第四章目的基因的轉(zhuǎn)化及其原理

植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體，Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體）原生質(zhì)體DNA直接導(dǎo)入轉(zhuǎn)化系統(tǒng)基因槍DNA導(dǎo)入轉(zhuǎn)化系統(tǒng)花粉粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)1當(dāng)前第1頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)一、植物基因工程載體命名規(guī)則及種類1、植物基因工程載體命名規(guī)則：(1)

pSC101plasmidStanleyCohen(人名)pTiT37/pAtT37根癌農(nóng)桿菌的質(zhì)粒類型（Agrobacteriumtumefaciens）pRiT37/pArT37發(fā)根農(nóng)桿菌的質(zhì)粒類型（Agrobacteriumrhizogenes）2當(dāng)前第2頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)（2）每個(gè)基因位點(diǎn)均以三個(gè)斜體小寫字母表示，如：leu（亮氨酸基因位點(diǎn)）

基因表現(xiàn)型用正體表示，如Leu（3）基因中任何位點(diǎn)發(fā)生突變則在該基因符號(hào)后加該位點(diǎn)斜體大寫字母，如亮氨酸A、B位點(diǎn)分別為突變型或缺陷型，表示為：leuA、leuB(4)抗性和敏感性分別用R或r，S或s表示

3當(dāng)前第3頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)2、植物基因工程載體的種類及特性植物基因工程載體克隆載體中間載體中間克隆載體中間表達(dá)載體卸甲載體onc-onc+轉(zhuǎn)化載體中間黏粒載體質(zhì)粒/黏粒載體基因標(biāo)記載體一元轉(zhuǎn)化載體（順式載體）雙元轉(zhuǎn)化載體（反式式載體）共整合載體SEV（拼接末端載體；split-endvector）4當(dāng)前第4頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)二、根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能1、Ti質(zhì)粒的遺傳特性、結(jié)構(gòu)及功能2、T-DNA的基因結(jié)構(gòu)與功能3、Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能

5當(dāng)前第5頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)一、Ti質(zhì)粒的遺傳特性、結(jié)構(gòu)及功能1.Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子。

根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)?？梢员环殖伤姆N類型：章魚堿型(octopine)胭脂堿型(nopaline)農(nóng)桿堿型（agropine）農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）或稱琥珀堿型(succinamopine)6當(dāng)前第6頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)圖3-1章魚堿型Ti質(zhì)?；驁D。章魚堿基因T-DNA區(qū)結(jié)合轉(zhuǎn)移區(qū)冠癭堿代謝復(fù)制起始區(qū)毒力區(qū)生長(zhǎng)素基因細(xì)胞分裂素基因冠癭堿合成7當(dāng)前第7頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)2.Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域Ti質(zhì)?？煞譃樗膫€(gè)區(qū)：（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：

T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。（2）Vir區(qū)（virulenceregion）該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。8當(dāng)前第8頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)（3）Con區(qū)（regionsencodingconjugations）該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)（originofreplication）該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。9當(dāng)前第9頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)3.Ti質(zhì)粒的生物學(xué)功能Ti質(zhì)粒的功能可歸為以下7個(gè)方面:①參與寄主細(xì)胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些細(xì)胞分裂素的活動(dòng)。②誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤并決定所誘導(dǎo)的腫瘤的形態(tài)學(xué)特征和冠癭堿成分。③賦予寄主菌株具有分解代謝各種冠癭堿化合物的能力。④賦予寄主菌株對(duì)土壤桿菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素的反應(yīng)性。⑤為農(nóng)桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁的能力。⑥決定寄主菌株的植物寄主范圍。⑦有的Ti質(zhì)粒能夠抑制某些根瘤土壤桿菌噬菌體生長(zhǎng)與發(fā)育，即具有對(duì)噬菌體的“排外性”。10當(dāng)前第10頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)表4-1Ti質(zhì)粒放入部分基因及其功能基因縮寫表型及功能在基因圖上的位置（kb）pTiC58（211kb）pTiAch5（195kb）age排斥噬菌體API111-11310-12agr對(duì)PAT-K84質(zhì)粒編碼的農(nóng)桿菌素敏感138-141—arc分解精氨酸4-59-10agc分解農(nóng)桿菌—54-57noc分解胭脂堿18-20—nos合成胭脂堿0-1—occ分解章魚堿—39-41ocs合成章魚堿—0-1ori復(fù)制起點(diǎn)33-3590-95roi（tmr）抑制長(zhǎng)根206-207190-192shi（tms）抑制長(zhǎng)芽202-203187-188traTi質(zhì)粒轉(zhuǎn)移121-12321-30inc質(zhì)粒不相容性33-3590-9511當(dāng)前第11頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)二、T-DNA的基因結(jié)構(gòu)與功能

1.T-DNA的發(fā)現(xiàn)

Chilton等人于1982發(fā)現(xiàn)。(MD

CHILTON,DTEPFER,APETIT,DCHANTAL

,CDFRANCINE,TJACQUES.

Agrobacteriumrhizogenes

insertsT-DNAintothegenomesofthehostplantrootcells.Nature,1982(295):432-434）

研究證明，這部分DNA是從質(zhì)粒DNA上切割后，轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞，故稱之為轉(zhuǎn)移DNA（transferred-DNA）。12當(dāng)前第12頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)GGCAGGATATATATTCAATTGTAATGGCAGGATATATATACCGGTTGTAATT圖3-2Ti質(zhì)粒上幾個(gè)重要區(qū)域及其序列LB：左邊界序列；RB：右邊界序列13當(dāng)前第13頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)2.T-DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)l

Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)的長(zhǎng)度約為23kb；l

T-DNA僅存在于植物腫瘤細(xì)胞的核DNA中；l

在T-DNA的5′端和3′端都有真核表達(dá)信號(hào)。如TATAbox、AATAAbox及polyA等。14當(dāng)前第14頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)T-DNA的兩端左右邊界各為25bp的重復(fù)序列，即邊界序列（bordersequence），分別稱之為左邊界（BL或TL）和右邊界（BR或TR）。該25bp邊界序列屬保守序列,但通常右邊界（TR）序列更為保守，左邊界(TL)序列在某些情況下有所變化。其核心部分是14bp，可分為10bp(CACGATATAT)及4bp(GTAA)兩部分,是完全保守的。致瘤性：右邊界作用大于左邊界15當(dāng)前第15頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)3.T-DNA上的編碼基因及功能

T-DNA的轉(zhuǎn)錄有下述共同點(diǎn)：①T-DNA的兩條鏈都是有意義鏈,即都能被轉(zhuǎn)錄。②T-DNA上每個(gè)基因都有各自的啟動(dòng)子。③基因的轉(zhuǎn)錄由植物細(xì)胞RNA聚合酶Ⅱ完成。④T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和終止的調(diào)節(jié)信號(hào)，T-DNA的轉(zhuǎn)錄機(jī)理可能與真核生物相同。⑤植物或農(nóng)桿菌中可能有甲基化或去甲基化的調(diào)節(jié)基因活性。16當(dāng)前第16頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)TLTRTCiaaHiaaMauxiptcytocsfrsmasags圖4-3章魚堿型Ti質(zhì)粒的T-DNA編碼基因結(jié)構(gòu)iaaH：吲哚乙酸胺水解酶；iaaM：色氨酸單加氧酶；aux：生長(zhǎng)素；ipt:異戊烯基轉(zhuǎn)移酶；cyt：細(xì)胞分裂素；frs：琥珀堿合成酶；mas：甘露堿合成酶；ags：農(nóng)桿堿合成酶17當(dāng)前第17頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)T-DNA區(qū)基因的功能

第一類是編碼冠癭堿合成酶及分解代謝基因，如:frs、mas、ags第二類是致瘤基因；包括生長(zhǎng)素基因aux和細(xì)胞分裂素基因cyt

18當(dāng)前第18頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)三、Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能1、Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)：農(nóng)桿菌致瘤所必須的；Vir區(qū)僅位于T區(qū)DNA左側(cè)；兩者之間的距離常隨Ti質(zhì)粒類型不同而有差異。HABGCDEFtzsABGCDE章魚堿胭脂堿圖4-5章魚堿型和胭脂堿型Ti質(zhì)粒的Vir區(qū)編碼基因結(jié)構(gòu)19當(dāng)前第19頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)表4-4章魚堿型Ti質(zhì)粒vir基因基本結(jié)構(gòu)與功能遺傳座位分子量（kb）基因數(shù)表達(dá)方式功能virA2.81組成型幫助接受植物信號(hào)分子啟動(dòng)毒性區(qū)表達(dá)virG1.01組成型轉(zhuǎn)錄活化virC1.52誘導(dǎo)型T-DNA加工virD4.54誘導(dǎo)型T-DNA加工virE2.22誘導(dǎo)型T-DNA加工virB9.511誘導(dǎo)型膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白virF1.01誘導(dǎo)型T-DNA轉(zhuǎn)運(yùn)virH94.22誘導(dǎo)型細(xì)胞色素P-450單氧化酶20當(dāng)前第20頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)三、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)化機(jī)理

已知農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后，只留在細(xì)胞間隙中。T-DNA首先在細(xì)菌中被加工、剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并非整個(gè)Ti質(zhì)粒都進(jìn)入植物細(xì)胞。該基因轉(zhuǎn)化過程是一個(gè)復(fù)雜的遺傳工程。21當(dāng)前第21頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)1、T-DNA的加工及轉(zhuǎn)移

22當(dāng)前第22頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)四、T鏈整合植物基因組的分子機(jī)理

1、整合位點(diǎn)及其特性T-DNA在植物染色體中的插入是隨機(jī)的，可插入植物任何一條染色體插入位點(diǎn)常有以下特點(diǎn)：①T-DNA優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活躍的植物基因位點(diǎn)；②T-DNA與植物DNA連接處富含A，T堿基對(duì)；③植物DNA上的插入靶位點(diǎn)與T-DNA邊界序列有一定程度的同源性。23當(dāng)前第23頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)2.T-DNA的整合機(jī)理

雙鏈斷裂修復(fù)模型（DSBRmodel）單鏈缺口修復(fù)模型（SSGRmodel）

24當(dāng)前第24頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)Sci，IF：9.20525當(dāng)前第25頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)26當(dāng)前第26頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)Fig4-6IllegitimaterecombinationmodelsforT-DNAintegration.(a)Double-strandbreak-repair(DSBR)andsingle-strandgap-repair(SSGR)modelsequallyexplaintheintegrationeventsleadingtoT-DNAinsertion621-x34.AsoutlinedintheDiscussion,theDSBRmodelpredictsadouble-strandbreakinthetarget.UnwoundorexonucleaseprocessedendsoftheT-DNAandofthetargetannealbypartialhomologouspairing.Single-strandoverhangsareremovedbyendo-orexonucleasedigestion;theendsarerepairedandligated.TheSSGRmodelpredictsanickinthetargetthatisconvertedtoagapbya5'-3'exonuclease.TheT-strandinvadesthegapandasynapsisisformedbypartialpairingbetweenT-DNAendsandtarget.TheoverhangsoftheT-DNAareremovedandtheT-strandisligatedtothetarget.AnickintroducedintothesecondstrandofthetargetinitiatesrepairsynthesisofthesecondstrandoftheT-DNA.(b)ApplicationoftheSSGRmodelforT-DNAinsertion621-36.Asproposedinthemodelofinsertion621-x34,repairattheendsofinvadingT-strandmayoccurbeforeligation.AbsenceofaninternalCAGTT-DNAsequencefromtherightjunctionofinsert621-36suggeststhatcopyingofthetargetplantDNAledtoalterationoftherightT-DNAendduringintegration.Mismatchrepairmaysimilarlyexplaintheobserveddeletion.(c)AmodifiedversionofSSGRmodelexplainingpossibleinvolvementofVirD2proteininrecombinationeventsthatresultedinT-DNAinsertions621-37andN6H-cs4.T-DNAinvasiondepictedinthemodelinvolvesVirD2-mediatedrecognitionofanick(orgap)thatisfollowedbyligationofthe5'endoftheT-strandtothetargetDNA.The3'endoftheT-strandmovesalongthetarget,whiletheunwoundtargetDNAstrandisremovedbyexonucleolyticdigestion.Atthepositionwherethe3'endoftheT-strandisstabilizedbybase-pairing,theT-strandisligatedtothetarget.Atthesamepositionanickisintroducedinthesecondstrandofthetargetthatdefinestheleftbreak-pointoftargetdeletionandinitiatesthereplicationoftheT-strand.Symbolsusedforpresentationofputativerecombinationeventsareexplainedunderneaththemodels.27當(dāng)前第27頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)3.T-DNA整合的遺傳效應(yīng)T-DNA插入的遺傳特性：(1)T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排。但多數(shù)插入會(huì)導(dǎo)致靶位點(diǎn)處小的缺失，缺失多至79個(gè)核苷酸。(2)另一個(gè)常見的結(jié)果是，在T-DNA／植物DNA連接處，會(huì)有幾個(gè)至33個(gè)核苷酸的“填充”DNA（FillerDNA）存在，這些“填充”DNA的序列與靠近連接處的植物DNA序列相似。(3)在植物靶位處不要求有特異的序列，但若在T-DNA兩端和植物靶位處之間有一段短序列（5～10b）同源，則可以在整合中起作用。28當(dāng)前第28頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)五、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建1、Ti質(zhì)粒的改造及卸甲載體構(gòu)建

2、中間載體/表達(dá)載體的構(gòu)建

3、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建29當(dāng)前第29頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)1、Ti質(zhì)粒的改造及卸甲載體構(gòu)建

野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙：①Ti質(zhì)粒分子量過大，一般在160～240kb，基因工程中難以操作；②大型的野生Ti質(zhì)粒上分布著各種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)，..難以找到可利用的單一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，不能通過體外DNA重組技術(shù)直接向野生型Ti質(zhì)粒導(dǎo)入外源基因；③T-DNA區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，其中onc基因產(chǎn)物干擾宿主植物中內(nèi)源激素的平衡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞長(zhǎng)成腫瘤，阻礙細(xì)胞的分化和植株的再生；④Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制,即使得到重組質(zhì)粒，也只能在農(nóng)桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增；而農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化率極低（10％左右）,因此，通過Ti質(zhì)粒的體外操作，在常規(guī)分子克隆條件下幾乎不能構(gòu)建在T-DNA中只有單一切點(diǎn)的載體；⑤Ti質(zhì)粒上還存在一些對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。

30當(dāng)前第30頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)為了使Ti質(zhì)粒成為有效的外源基因?qū)胼d體，必須對(duì)野生型Ti質(zhì)粒進(jìn)行一番科學(xué)的改造。十分幸運(yùn)的是，大腸桿菌具有能與農(nóng)桿菌高效地接合轉(zhuǎn)移的特性。因此，科學(xué)家們可以先將T-DNA片段克隆到大腸桿菌的質(zhì)粒中，并插入外源基因，最后通過接合轉(zhuǎn)移把外源基因引入到農(nóng)桿茵的Ti質(zhì)粒上，這是一種把預(yù)先進(jìn)行亞克隆、切除、插入或置換的T-DNA引入Ti質(zhì)粒的有效方法。帶有重組T-DNA的大腸桿菌質(zhì)粒衍生載體稱為”中間載體”（intermediatevector），而接受中間載體的Ti質(zhì)粒則稱為受體Ti質(zhì)粒（acceptorTip1asmid），一般是卸甲載體（disarmedvector）。31當(dāng)前第31頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)2、onc-卸甲載體所謂卸甲載體就是無(wú)毒的（non-oncogenic）Ti質(zhì)粒載體。因?yàn)槔靡吧偷腡i質(zhì)粒作載體時(shí)，影響植株再生的直接原因是T-DNA中onc基因的致瘤作用。因此，為了使野生型的Ti質(zhì)粒成為基因轉(zhuǎn)化的載體，必須切除T-DNA上的onc基因，即“解除”其“

武裝”,構(gòu)建成所謂“卸甲”或稱“繳械”載體（disarmedvector）。在這種onc-載體中，已經(jīng)缺失的T-DNA部位被大腸桿菌的一種常用的質(zhì)粒pBR322取代。這樣任何適合于克隆在

pBR322質(zhì)粒中的外源DNA片段，都可以通過與

pBR322質(zhì)粒DNA的同源重組，而被共整合到Onc-Ti質(zhì)粒載體上。32當(dāng)前第32頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)onc+卸甲載體

對(duì)于研究外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)，以及對(duì)于以改良農(nóng)作物為目的的植物基因工程而言，onc-體系是最有用的。不過，人們可能還要設(shè)計(jì)一些特殊的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究外源基因在冠癭瘤組織中的表達(dá)問題。在這種情況下，使用onc+菌株載體則比較合適。由于冠癭瘤組織具有不依賴于激素的表型特征，所以這種載體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于它可以快速地增生冠癭組織，比較快速而容易得到轉(zhuǎn)化體。33當(dāng)前第33頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)2、中間載體的構(gòu)建（1）中間載體的基本結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)

為解決Ti質(zhì)粒不能直接導(dǎo)入目的基因的困難，構(gòu)建中間載體（intermediatevector）是有效方法之一。中間載體是一種在一個(gè)普通大腸桿菌的克隆載體（例如pBR322質(zhì)粒）中插入了一段合適的T-DNA片段，而構(gòu)成的小型質(zhì)粒。中間載體通常是多拷貝的E.Coli小質(zhì)粒，這一點(diǎn)對(duì)于通過體外遺傳操作導(dǎo)入外源基因是非常必要的。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)看可分為兩類中間載體，即共整合系統(tǒng)中間載體和雙元載體系統(tǒng)中間載體。34當(dāng)前第34頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)共整合系統(tǒng)中間載體的特征①中間載體必須含有與Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)同源的序列，此外含有pBR的序列，在其被引入到根癌農(nóng)桿菌后即可高頻地與Ti質(zhì)粒的T-DNA的同源序列進(jìn)行重組；②它應(yīng)具有一個(gè)或幾個(gè)細(xì)菌選擇標(biāo)記，這將有利于篩選共整合質(zhì)粒；③它必須

有bom位點(diǎn)，在有誘導(dǎo)質(zhì)粒存在的情況下，bom位點(diǎn)的存在可以使中間載體在不同細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移；④它應(yīng)該含有陽(yáng)性植物選擇標(biāo)記，以利于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的篩選，例如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neomycinphosphotransferase,Npt-Ⅱ)基因，其可賦予轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞卡那霉素抗性；⑤它應(yīng)該含有單一的限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，以利于外源基因的插入；⑥無(wú)Ti質(zhì)粒的邊界序列。35當(dāng)前第35頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)雙元載體系統(tǒng)的中間載體與共整合系統(tǒng)中間載體不同之處是:①無(wú)同源序列；②具有LB和RB;③無(wú)Co1E1復(fù)制點(diǎn)

36當(dāng)前第36頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)（2）中間表達(dá)載體啟動(dòng)子及其它調(diào)控序列

轉(zhuǎn)錄的調(diào)控對(duì)真核生物基因表達(dá)起著關(guān)鍵性作用。就真核生物基因表達(dá)調(diào)控序列而言，大多數(shù)真核生物在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的5′端上游區(qū)第30至25bp處具有TATA盒，在70至80bp處還有CAAT盒。在大多數(shù)真核生物基因的3′端具有AATAA序列。這些5′和3′端的調(diào)控序列對(duì)真核生物的基因表達(dá)起著關(guān)鍵性作用。Ti質(zhì)粒雖然來(lái)源于農(nóng)桿菌，但其Nos、Ocs、Tmr等基因具有與真核生物啟動(dòng)子類似的TATA盒和CAAT盒，均能在植物細(xì)胞中表達(dá)，并且無(wú)組織特異性。因此，它們成為早期構(gòu)建嵌合基因的啟動(dòng)子，其中以Nos啟動(dòng)子（pNos）最常用。37當(dāng)前第37頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)38當(dāng)前第38頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)3、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建（1）一元載體系統(tǒng)（2）雙元載體系統(tǒng)39當(dāng)前第39頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)1．一元載體系統(tǒng)的構(gòu)建這一類載體是中間表達(dá)載體與改造后的受體Ti質(zhì)粒之間，通過同源重組所產(chǎn)生的一種復(fù)合型載體，通常亦稱為共整合載體（co-intergratedvecter），又由于該載體的T-DNA區(qū)與Ti質(zhì)粒Vir區(qū)連鎖，因此又稱之為順式載體（cis-vector）。一元載體的特點(diǎn)是:①由兩個(gè)質(zhì)粒（E.coli質(zhì)粒和Ti質(zhì)粒）重組而成，分子量較大；②共合體的形成頻率與兩個(gè)質(zhì)粒的重組頻率有關(guān),相對(duì)較低；③必須用Southern雜交或PCR對(duì)大的共整合體質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)；④構(gòu)建時(shí)比較困難。一元載體系統(tǒng)目前主要有兩種載體：共整合載體和拼接未端載體（split-endvector,SEV）。

40當(dāng)前第40頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)（1）共整合載體的構(gòu)建共整合載體的特點(diǎn)是：①中間表達(dá)載體與受體Ti卸甲載體，通過同源重組共整合而構(gòu)建；②中間表達(dá)載體與受體Ti質(zhì)粒之間同源序列是pBR322。共整合載體的構(gòu)建過程

l）中間載體pLGV1103導(dǎo)入農(nóng)桿菌:目前通常采用兩種方法，即接合轉(zhuǎn)移法（conjugativetransfer）和三親雜交轉(zhuǎn)移法。

2）中間載體與受體Ti質(zhì)粒的同源重組。

3）共整合載體的選擇。

41當(dāng)前第41頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)共整合轉(zhuǎn)化程序當(dāng)前第42頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)（2）

SEV的構(gòu)建SEV系統(tǒng)即T-DNA邊界拼接系統(tǒng)，亦稱拼接末端載體（sp1it-endvecter,SEV）。它是由Freley等人于1985年建立的另一種共整合載體，也因?yàn)樗膬蓚€(gè)LIH序列在同源重組前分別處于不同質(zhì)粒上而得名。SEV與pGV3850的差異及構(gòu)建過程如下述：1）SEV的受體Ti質(zhì)粒的T-DNA上的致瘤基因（onc）及TR都已被缺失，T-DNA的保留部分被稱為“左邊界內(nèi)部同源區(qū)”（1eftinsidehomcology，LIH）。該受體Ti質(zhì)粒還保留了Vir基因及其它正常的功能基因，同時(shí)還攜有用于細(xì)菌篩選的抗性基因。2）SEV中間載體具有一個(gè)細(xì)菌的抗性基因，一個(gè)植物抗性基因及與受體Ti質(zhì)粒同源的LIH序列及TR。3）通過三親雜交將中間載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌后，由于它們之間都具有LIH同源序列，即可發(fā)生同源重組，形成SEV的共整合載體。

43當(dāng)前第43頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)（3）

SEV與pGV3850比較

兩者都是通過受體Ti質(zhì)粒與中間載體同源重組而形成，故同屬于共整合的一元載體系統(tǒng)，但它們之間有著一定的差異：1）它們的受體Ti質(zhì)粒與中間載體的結(jié)構(gòu)不同。pGV3850的左右邊界在一個(gè)受體Ti質(zhì)粒上，而SEV來(lái)自二個(gè)質(zhì)粒，即TR來(lái)自中間載體。2）同源序列不同。pGV3850重組的同源序列是pBR322，而SEV是LIH。3）SEV是更有效的共整合載體。由于pGV3850共整合載體，帶有大腸桿菌pBR322序列，外源基因嵌合在該序列中，因而轉(zhuǎn)化的植物中也帶有重復(fù)的pBR322序列。此重復(fù)序列可能對(duì)轉(zhuǎn)化植物中的外源基因的穩(wěn)定性有影響，而SEV系統(tǒng)則排除了這種可能。44當(dāng)前第44頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)2．雙元載體系統(tǒng)

雙元載體（binaryvecter）系統(tǒng)是指由兩個(gè)分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng),又因?yàn)槠銽-DNA與Vir基因在兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒上，通過反式激活T-DNA轉(zhuǎn)移,故稱之為反式載體（transvecter）.45當(dāng)前第45頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)（1）雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建原理

雙元載體主要包括兩個(gè)Ti質(zhì)粒，即微型Ti質(zhì)粒和輔助Ti質(zhì)粒。

Ti質(zhì)粒上的Vir基因與T-DNA具有反式互補(bǔ)作用，Vir基因可以反式激活T-DNA的轉(zhuǎn)移。其次，中間載體含有廣泛寄主范圍質(zhì)粒的復(fù)制起始點(diǎn)（oriV），而代替了共整合載體中用以重組的同源區(qū)，能夠在任何農(nóng)桿菌寄主里自發(fā)復(fù)制。46當(dāng)前第46頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)（4）雙元載體的構(gòu)建

將MiniTi質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有He1perTi質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌的途徑有兩條，一條是直接用純化的MiniTi質(zhì)粒轉(zhuǎn)化速凍的根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞；另一條是與共整合載體構(gòu)建一樣，采用三親接合的方式。MiniTi質(zhì)粒均能以E.coli的pRK2013為輔助質(zhì)粒，通過三親雜交而接合轉(zhuǎn)移到含有輔助Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)。由于E.coli的pRK2013不能在農(nóng)桿菌中復(fù)制最后消失，含有MiniTi質(zhì)粒和He1perTi質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌可直接用于植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

47當(dāng)前第47頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)48當(dāng)前第48頁(yè)\共有52頁(yè)\編于星期六\9點(diǎn)（5）一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)的比較雙元載體系統(tǒng)與一元載體系統(tǒng)之間有著較大的差異：