細(xì)胞生物學(xué)40課件2

第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、光鏡技術(shù)

1、幾種常見(jiàn)光學(xué)顯微鏡A普通光學(xué)顯微鏡

普通生物顯微鏡由3部分構(gòu)成，即：①照明系統(tǒng)，包括光源和聚光器；②光學(xué)放大系統(tǒng)，由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體；③機(jī)械裝置，用于固定材料和觀察方便。當(dāng)前第1頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第2頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)B暗視野顯微鏡

使用特殊的照明方法，使照明光線(xiàn)不直接進(jìn)入物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線(xiàn)進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見(jiàn)到小至4~200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。

應(yīng)用：觀察未經(jīng)染色的活體或膠體粒子。當(dāng)前第3頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第4頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)

C相差顯微鏡（PCM）1953年獲得諾貝爾物理獎(jiǎng)，相差顯微鏡的基本原理是，把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光（直射光和衍射光）的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn)。

應(yīng)用：觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。一種介殼蟲(chóng)的染色體（PCM照片）當(dāng)前第5頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)在相差顯微鏡下觀察的分裂期細(xì)胞變化過(guò)程

當(dāng)前第6頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)

D倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過(guò)物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。當(dāng)前第7頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)E熒光顯微鏡

細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線(xiàn)照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線(xiàn)照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對(duì)這類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。當(dāng)前第8頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第9頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色）當(dāng)前第10頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)F微分干涉差顯微鏡（DIC顯微鏡）

能顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像，立體感強(qiáng)，用于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器，與錄像設(shè)備結(jié)合，可觀察活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)。尼康E800熒光DIC顯微鏡當(dāng)前第11頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)DIC顯微鏡下的硅藻當(dāng)前第12頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)

G激光共聚焦掃描顯微鏡（LSC顯微鏡）

可改變觀察的焦平面，因而能進(jìn)行“光學(xué)切片”，觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。將改變焦點(diǎn)獲得的一系列細(xì)胞不同平面上的圖像疊加后，可重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)。

激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測(cè)量。當(dāng)前第13頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第14頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)LCSM照片，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管當(dāng)前第15頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)2光鏡標(biāo)本的制備以石蠟切片為例：材料處理固定脫水包埋切片染色觀察

染色劑：普通染色劑，熒光染色劑當(dāng)前第16頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)3光鏡技術(shù)的應(yīng)用

A觀察活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，生命運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞周期。B細(xì)胞器的定位及功能研究。C基因產(chǎn)物與大分子物質(zhì)的定位及定量。D監(jiān)測(cè)細(xì)胞代謝活動(dòng)。

當(dāng)前第17頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)

例：胞內(nèi)鈣離子濃度的監(jiān)測(cè)鈣是通用的第三信使，能特異地選擇性地調(diào)節(jié)細(xì)胞的活動(dòng)，因此測(cè)定細(xì)胞中鈣離子濃度在空間和時(shí)間上的變化，對(duì)于監(jiān)控許多細(xì)胞的生理活動(dòng)有重要作用。如受精時(shí)，卵細(xì)胞突然定位地將鈣離子釋放到胞漿中。

鈣指示劑：FuRA－2，水母發(fā)光蛋白等當(dāng)前第18頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)沙元雙細(xì)胞胚中一個(gè)細(xì)胞的鈣信號(hào)引起鈣依賴(lài)水母發(fā)光蛋白發(fā)光當(dāng)前第19頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)羅丹明123染色后顯示的細(xì)胞線(xiàn)粒體的定位當(dāng)前第20頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)二、電鏡技術(shù)1、透射電子顯微鏡（TEM）

透射電子顯微鏡以電子束為光源，由于電子束的波長(zhǎng)要比可見(jiàn)光和紫外光短得多，并且電子束的波長(zhǎng)與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說(shuō)電壓越高波長(zhǎng)越短，因而使其分辨力大大提高，目前TEM的分辨力可達(dá)0.2nm。電子顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達(dá)近百萬(wàn)倍、由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。當(dāng)前第21頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第22頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第23頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)

2掃描電子顯微鏡（SEM）掃描電子顯微鏡（SEM），可用來(lái)觀察標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。其工作原理是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與電子束入射角有關(guān)，也就是說(shuō)與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?hào)，再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)來(lái)控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。當(dāng)前第24頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)當(dāng)前第25頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)人類(lèi)紅細(xì)胞的SEM圖片當(dāng)前第26頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)花粉的SEM圖片昆蟲(chóng)卵的SEM圖片當(dāng)前第27頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)3掃描透射電子顯微鏡（STEM）

是唯一不需要染色、固定而能夠直接觀測(cè)單個(gè)生物分子的儀器。世界上僅有幾臺(tái)。4掃描隧道顯微鏡（STM）

獲1986年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)?？捎脕?lái)顯示晶體表面原子布陣。固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)三態(tài)物質(zhì)均可進(jìn)行觀察，能直接觀察生物大分子的原子布陣，也能觀察一些生物結(jié)構(gòu)的原子排列，有助于把生物學(xué)研究推進(jìn)到納米科學(xué)水平。當(dāng)前第28頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物1、差速離心2、密度梯度離心1）速度沉降主要用于分離密度相近而大小不一的細(xì)胞組分。2）等密度沉降主要用于分離不同密度的細(xì)胞組分。當(dāng)前第29頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)

在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器,速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀當(dāng)前第30頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)A：速度沉降B：等密度沉降當(dāng)前第31頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類(lèi)等的顯示方法原理：利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些 特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過(guò)顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來(lái)判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布與含量。當(dāng)前第32頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)Feulgen反應(yīng)→DNA

蘇丹Ⅲ→脂類(lèi)當(dāng)前第33頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)酶的顯示是通過(guò)顯示酶的活性來(lái)表明酶的存在，而不是酶的本身。將具有酶活性的組織放入含有一定底物的溶液中孵育，底物經(jīng)酶的作用形成初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物，它再與某種捕捉劑相反應(yīng),形成顯微鏡下可視性沉淀,即最終反應(yīng)產(chǎn)物。

如：細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶的顯示先將切片放入含有酶底物(常用β-甘油磷酸鈉)的溶液中孵育，底物經(jīng)酶的作用，水解并釋放出磷酸；用捕捉劑硝酸鉛與磷酸反應(yīng)，形成微細(xì)的磷酸鉛沉淀，此時(shí)，可在電鏡下檢出；如再用硫化銨處理時(shí)，磷酸鉛被置換成硫化鉛沉淀，可在光鏡下見(jiàn)到。當(dāng)前第34頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)

ABA:細(xì)胞色素氧化酶活性定位B:ATP酶活性定位當(dāng)前第35頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)三、特異蛋白抗原的定位與定性

一般說(shuō)來(lái)，發(fā)生在組織細(xì)胞內(nèi)的抗原抗體反應(yīng)是不可見(jiàn)的，但如果事先將某種熒光素、酶、同位素等用生化方法標(biāo)記在抗體分子上（標(biāo)記抗體），就能憑借特殊光鏡及電鏡等觀察標(biāo)本中的熒光現(xiàn)象、酶作用的沉淀物（顏色）、放射線(xiàn)徑跡的有無(wú)和部位，由此判斷是否發(fā)生了特異性的抗原抗體反應(yīng)以及抗原物質(zhì)的定位分布。當(dāng)前第36頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性原位雜交：用標(biāo)記的核酸探針通過(guò)分子雜交確定特異核苷酸序列在染色體上或在細(xì)胞中的位置的方法。在顯微與亞顯微水平上的基因定位、特異mRNA表達(dá)等研究中起重要作用。光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記探針）

電鏡水平的原位雜交技術(shù)（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）當(dāng)前第37頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)人類(lèi)染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片當(dāng)前第38頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)五、放射自顯影技術(shù)原理及應(yīng)用：利用同位素的放射自顯影，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與定量研究；實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)和追蹤研究。當(dāng)前第39頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)a：疏松染色質(zhì)處的RNA轉(zhuǎn)錄b：骨髓細(xì)胞高爾基復(fù)合體處的硫酸酯（箭頭處）當(dāng)前第40頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)六、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)

細(xì)胞顯微分光光度術(shù)利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對(duì)特異光譜的吸收，測(cè)定這些物質(zhì)如（核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。

當(dāng)前第41頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)：

指用流式細(xì)胞儀（FCM）對(duì)細(xì)胞或染色體進(jìn)行分選或?qū)蝹€(gè)細(xì)胞或其它生物微粒進(jìn)行定量分析的一門(mén)技術(shù)。

主要應(yīng)用：用于定量測(cè)定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測(cè)定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量； 從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞； 分離特異染色的染色體。當(dāng)前第42頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)※細(xì)胞分選熒光標(biāo)記抗體探針＋細(xì)胞抗原細(xì)胞被標(biāo)記除去游離抗體稀釋超聲波振蕩器內(nèi)與鞘液混合液滴被激普通細(xì)胞：干涉檢測(cè)器檢測(cè)光激發(fā)熒光標(biāo)記：干涉檢測(cè)器＋細(xì)胞熒光檢測(cè)器檢測(cè)鞘液帶上正電荷負(fù)極收集器鞘液帶上負(fù)電荷正極收集器※染色體分選同理。用熒光標(biāo)記的DNA探針同特異染色體結(jié)合，使待分選的染色體帶上熒光標(biāo)記。當(dāng)前第43頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)用流式細(xì)胞計(jì)分選細(xì)胞示意圖當(dāng)前第44頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程

與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)二、細(xì)胞工程三、顯微操作技術(shù)當(dāng)前第45頁(yè)\共有50頁(yè)\編于星期四\21點(diǎn)

高等生物是由多細(xì)胞構(gòu)成的整體，在整體條件下要研究單個(gè)細(xì)胞或某一群細(xì)胞在體內(nèi)的功能活動(dòng)是十分困難的。但是如果把活細(xì)胞