鹽誘導氧化脅迫與楊樹耐鹽性研究

鹽誘導氧化脅迫與楊樹耐鹽性研究（作者：王瑞剛，導師：陳少良教授）摘要胡楊是非常有價值的造林綠化樹種。在我國西北干旱鹽堿的荒漠和戈壁地帶，胡楊是惟一能夠形成森林的高大喬木樹種。在固定沙丘、農(nóng)田林網(wǎng)建設方面胡楊更具有不可替代的作用。胡楊具有很強的抗鹽性，然而其潛在的應用價值還遠沒有得到開發(fā)利用。近年來從植物生理、生化和分子生物學等方面對胡楊的耐鹽機理進行了較為系統(tǒng)的研究，而關于鹽誘導的氧化脅迫與楊樹耐鹽性的研究卻很少，而且也不深入。鹽誘導的氧化脅迫在植物抗鹽性中的作用越來越受到重視。為此，我們以耐鹽的胡楊和不耐鹽的群眾楊、I-214楊為材料，對NaCl脅迫下根、葉和質(zhì)外體中的鹽離子、活性氧（ROS）、抗氧化酶活性及其同功酶、丙二醛（MDA）和電解質(zhì)外滲率的變化進行動態(tài)分析，揭示了活性氧調(diào)控在胡楊耐鹽中的作用；并通過短期鹽脅迫和抑制劑處理，初步闡明了鹽誘導的氧化脅迫信號與樹木耐鹽性的關系。主要結(jié)論如下：.在長期鹽脅迫下，群眾楊葉片的CO2同化速率嚴重下降，而胡楊則維持在一個較高且穩(wěn)定的水平。Pn-Ci曲線顯示，鹽脅迫（12d）降低了兩種楊樹葉片的CO2的飽和點（CSP）、CO2飽和點的Pn（CSPn）和羧化效率（CE），卻提高了CO2的補償點（CCP）。相似的是，鹽脅迫也降低了兩種楊樹葉片的光飽和點（LSP）、光飽點的Pn（LSPn）和表觀量子產(chǎn)率（AQY），但鹽脅迫對群眾楊葉片光反應的抑制作用顯著高于胡楊。葉綠素熒光的數(shù)據(jù)顯示，長期鹽脅迫（12d）對群眾楊葉片光適應和暗適應的熒光參數(shù)有顯著的影響：（1）由于鹽誘導的初始熒光（Fo）的升高和最大熒光（Fm）的顯著下降導致了PSII最大熒光量子產(chǎn)率的下降；（2）在光適應的葉片上，鹽脅迫降低了光化學猝滅（qP），卻提高了非光化學猝滅（qN）。相反，胡楊葉片的葉綠素熒光參數(shù)則沒有相應的變化。說明同樣的鹽脅迫對胡楊光合作用的抑制明顯弱于群眾楊。.光合作用受阻與鹽離子在葉片中的大量積累造成的膜傷害有關。我們的結(jié)果顯示，長期鹽脅迫下，群眾楊葉片中鹽離子大量積累，特別是葉綠體中鹽離子的積累，是導致葉片光合作用受阻的主要原因。鹽離子的積累與電解質(zhì)外滲率和MDA含量的增加成正相關，這可能是由于鹽誘導的氧化脅迫造成了膜質(zhì)過氧化的加劇，膜質(zhì)過氧化的加劇又導致膜滲透性增加的結(jié)果。耐鹽的胡楊則不同，由于葉片和葉綠體中積累了較少鹽離子，基本沒有造成膜質(zhì)過氧化，從而維持了膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。.實驗結(jié)果顯示，膜質(zhì)過氧化的加劇與ROS的調(diào)控有關。在鹽脅迫的前期，胡楊一方面可以通過誘導下部葉片變黃脫落來減少鹽誘導的水分脅迫，從而延緩鹽離子的根冠運輸，而葉片脫落與超氧陰離子自由基（02-.）增加促進乙烯合成有關；另一方面胡楊能及時提高上部葉片抗氧化酶的活性（抗壞血酸過氧化物酶（APX），過氧化物酶（POD），過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽還原酶（GR）），有效地控制了02-.和H2O2的積累，避免了氧化傷害，保護了膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。而群眾楊則不能很快的感知鹽脅迫并作出相應的反應。隨著鹽脅迫的進行，群眾楊葉片中鹽離子大量積累，光合受阻，并誘導了ROS（02-和H2O2）大量積累，盡管抗氧化酶的活性也明顯的升高，但都不足以有效的控制ROS的傷害，從而使葉片出現(xiàn)了傷害癥狀，隨著葉片傷害面積的增加，其超氧化物歧化酶（SOD）和POD活性顯著下降，加劇了膜質(zhì)過氧化和膜透性的增加。而胡楊則不同，盡管也有鹽離子在葉片中大量積累，但其能通過及時提高抗氧化酶的活性，有效控制鹽誘導的ROS的積累，從而避免氧化損傷，維持膜的穩(wěn)定性。值得注意的是，與群眾楊和I-214楊相比，胡楊在鹽脅迫初始階段就能大幅度上調(diào)SOD、POD活性，迅速阻止葉片中活性氧的積累，避免其對膜的傷害．這是典型的植物抗逆的預警機制。.通過對長期鹽脅迫下根組織中ROS和抗氧化酶活性變化的研究，結(jié)果顯示，胡楊根組織能迅速感知鹽脅迫，并上調(diào)抗氧化酶的活性來減少鹽誘導的氧化損傷，長期鹽脅迫下又能保持高水平的抗氧化酶系統(tǒng)，很好的控制了ROS的水平，避免了氧化損傷，維持膜的穩(wěn)定性，從而減少了鹽離子的吸收運輸。而群眾楊在鹽脅迫初期不能迅速上調(diào)抗氧化酶的活性，長期鹽脅迫下，抗氧化酶活性又降低，造成了氧化損傷，破化了膜系統(tǒng)，更促使了鹽離子的積累。.利用壓力室的方法獲取質(zhì)外體溶液和H2O2的細胞化學染色，進一步研究了質(zhì)外體中ROS和抗氧化酶活性的的變化。結(jié)果顯示，隨著鹽脅迫的進行，群眾楊質(zhì)外體中鹽離子大量積累，誘導了ROS（O2-和H2O2）大量積累，盡管抗氧化酶的活性也明顯的升高，但仍不足以有效的控制ROS的傷害，從而使葉片出現(xiàn)了傷害癥狀。而胡楊則不同，盡管也有鹽離子在葉片中積累，但其能通過及時提高抗氧化酶的活性，控制鹽誘導的ROS的積累，從而有效地避免了氧化損傷，維持了膜的穩(wěn)定性。這些結(jié)果都表明抗氧化脅迫在兩種楊樹的耐鹽性中起了重要的作用。.通過低鹽短期脅迫和抑制劑實驗，我們發(fā)現(xiàn)，鹽誘導的ABA信號轉(zhuǎn)導途徑與樹木耐鹽性密切相關，耐鹽的胡楊能快速的感知鹽脅迫，提高ABA的含量，誘導氣孔關閉，即緩和了鹽誘導的滲透脅迫，又減少了鹽離子的吸收和根冠運輸，而在此過程中ROS起到中間環(huán)節(jié)作用，并且ROS誘導抗氧化防御的上調(diào)能有效的避免鹽誘導的氧化損傷。不耐鹽的群眾楊對鹽脅迫反應遲鈍，不能很快適應環(huán)境，可能是其不耐鹽的主要原因之一?？傊?，胡楊耐鹽性的獲得可能是由于提高了抗氧化脅迫能力。一方面，在長期鹽脅迫下，胡楊不僅能通過誘導O2-.上調(diào)，促進乙烯的合成，誘導落葉來減少蒸騰；而且能有效控制葉組織、根組織和質(zhì)外體中ROS水平，避免氧化損傷，維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。另一方面，鹽誘導的氧化脅迫信號在胡楊耐鹽性中起重要的作用，既能誘導氣孔關閉，減少蒸騰，又能減少氧化損傷。關鍵詞：楊樹，耐鹽性，光合，鹽離子，活性氧，抗氧化酶，氧化脅迫信號，丙二醛，電解質(zhì)外滲率Salt-inducedoxidativestressandtherelevancetosalt

toleranceinPoplars(WangRuigangDirectedbyProf.ChenShaoliang)AbstractPopuluseuphraticaOliv.isavaluabletreespeciesusedforafforestationonsalineandalkalinedesertsits,andplaysveryimportantrolesinstabilizingsanddunes,andinagricultureshelterbeltconstructioninnorth-westChina.P.euphraticahasahighercapacitytotoleratesalinity,butit’spotentialapplicationvalueisnotdevelopedabundantly.Recently,physiological,biochemicalandmolecularmechanismsofsalttolerancehavebeeninvestigatedinP.euphratica,buttherelationshipbetweensalt-inducedoxidativestressandsalt-toleranceislessknown.Moreover,salt-inducedoxidativestresshasreceivedmuchattention.Inordertoelucidatemechanismofreactiveoxygenspecies(ROS)regulationandtherelevancetosalt-toleranceinwoodyplants,weusedsalt-tolerantP.euphraticaandsalt-sensitiveP.popularisandP.cvI-214toinvestigatetheeffectsofincreasingNaClontissuesaltconcentration,ROS,anti-oxidativeenzymes,malondialdehyde(MDA)andmembranepermeability(MP)inleaves,rootsandtheapoplast.Inaddition,wedesignedexperimentstoclarifythecorrelationbetweensalt-inducedoxidativestresssignalandsalt-toleranceinpoplars.Inalonger-termofsalinity,CO2assimilationinP.populariswasseverelyreducedwhereasstressedP.euphraticamaintainedarelativelyhigherandconstantlevelofPn.Pn-Cicurvesshowedthatsaltstress(12days)reducedCO2saturationpoint(CSP),CO2saturatedPn(CSPn),andcarboxylationefficiency(CE),butincreasedCO2compensationpoint(CCP)inthetwogenotypes.Similarly,salinityloweredlightsaturationpoint(LSP),lightsaturatedPn(LSPn),andapparentquantumyield(AQY)inbothgenotypesbuttheinhibitoryeffectofNaClonlightreactionwasmorepronouncedinP.popularis,ascomparedtoP.euphratica.Chlorophyllafluorescencedataindicatedthatalonger-termofsaltstress(12days)exhibitedamarkedinfluenceonfluorescenceparametersofP.popularisinbothdark-andlight-adaptedstates:(i)NaClinhibitedthemaximalefficiencyofPSIIphotochemistry(Fv/Fm)duetothesalt-inducedincreaseofFo(theminimalfluorescence)andthemarkeddeclineofFm(themaximalfluorescence);(ii)salinitydecreasedcoefficientofphotochemicalquenching(qP)butmarkedlyelevatedcoefficientofnonphotochemicalquenching(qN)inthelight-adaptedstate.Incontrast,therewerenocorrespondingchangesofchlorophyllafluorescenceinsalinisedP.euphratica.ThisindicatedlesseffectofsamesaltstressonphotosynthesisinP.euphraticaisthanP.popularis.Inhibitionofleafphotosynthesisisrelatedtomembranedamagecausedbysaltbuild-upinthelong-termsaltstress.Resultsshowthatsaltionaccumulationinleaves,especiallyinchloroplast,inhibitedphotosynthesisofP.popularis.TheincreaseofMPandMDAwasresultedfromasaltbuildupinleaves,whichleadstomembraneperoxideandinionleakage.Incontrast,P.euphraticamaintainedstabilityofmembranesystemundersaltstressandsalinitydidnotcausemembraneperoxidationsincelesssaltionaccumulatedinP.euphraticaleaves.ResultsshowthattheaccelerationofmembraneperoxidationwasassociatedwithROSregulation.Atthebeginningofsalinity,P.euphraticacanalleviatedNaCl-inducedwaterstressandlimitedshoot-to-roottransportofsaltionbyinducingabscissionofyellowleavesinlowershoot,Moreoverleafabscissionwasassociatedwithaincreaseofethylenesynthesisinducedbysuperoxideradical(O2-.)upregulation.P.euphraticasignificantlyincreasedanti-oxidativeenzymes(ascorbateperoxidase(APX),catalase(CAT)andglutathionereductase(GR)inleavesoflowershoottocontrollevelsofO2-.andH2O2,thusavoidingoxidativedamageandmaintainingintegralityofmembranesystem.Incontrast,P.popularisisnotabletosensesaltstressandmakecorrespondingchangesforsaltadaptation.Afterexposuretosaltstress,agreatbuildupofNa+andCl-restrainingphotosynthesisinducedasignificantincreaseofROSinleavesandxylemsapofP.popularisdespiteanotableincreaseofanti-oxidativeenzymes,whichresultedinleaf-injuryultimately.UnlikeP.popularis,P.euphraticacouldeffectivelypreventsalt-inducedROSaccumulationbyup-regulatinganti-oxidativeenzymesalthoughtherewasagreatbuildupofsaltioninleavesandxylem(especiallyNa+),whichisfavorabletoavoidoxidativedamageandmaintainmembraneintegrity.Accordingly,thatthecapacityforanti-oxidativestressplaysanimportantpartinsalttoleranceinpoplars.Weinvestigatedtheeffectofalong-termsaltstressonROSandanti-oxidativeenzymesactivitiesinroots.ResultsshowthatP.euphraticarootcouldrapidlysensetheinitialsalinityandreducesalt-inducedoxidativedamagebyup-regulatinganti-oxidativeenzymes;whileinalong-termsaltstress,P.euphraticacouldeffectivelycontrolROSlevelsbymaintaininghigherlevelanti-oxidativeenzymessystem,whichisbenefittoavoidoxidativedamageandmaintainmembranestability,thesaltionabsorptionandtransportwereconsequentlyreduced.However,P.populariswasnotabletoup-regulateanti-oxidativeenzymesaftertheonsetofsaltstress.Thesalt-induceddeclineofanti-oxidativeenzymesinP.popularis,leadstooxidativeinjuryofmembranesystem,whichcausingsaltionaccumulation.Weobtainedxylemsapbypressurechambertoinvestigatesalt-inducedchangeofROSandanti-oxidativeenzymesintheapoplast.CellularH2O2locationwasdeterminedbycytochemistrystaining.ResultsshowedthatthesaltionaccumulationintheapoplastofP.popularisinducedROS(O2-.andH2O2)buildupinalong-termsaltstress.Theincreasedanti-oxidativeenzymeswasnotabletoremoveROSinjury,leadingtosaltdamageinP.popularisleaves.AlthoughsaltionbuilduptookplaceinP.euphraticaleaves,activitiesofanti-oxidativeenzymeswereinceasedcorrespondinglytopreventsalt-inducedexcessROSaccumulationandavoidoxidativeinjury,whichcontributingtomembranestabilitymaintenance.UsingABAsynthesisinhibitor,wefoundedthatsaltinducedABAsignaltransductionwasassociatedwithsalttoleranceinP.euphratica.Salt-tolerantP.euphraticacouldsensetheinitialsaltstress,inceaseABAcontentinleavesandinducedstomataclose,whichalleviatessalt-inducedos