微衛(wèi)星引物篩選步驟

1．進(jìn)行酶切用VspI對(duì)四種魚(yú)(GC、GS、NL和ZZ)基因組DNA(需基因組DNA濃度較高)進(jìn)行酶切。TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"反應(yīng)體系為：ddH2O 15ALVspIbuffer 2PLVspI酶 1ALDNA 2AL總體積 20AL酶切在37°C反應(yīng)3?4h即可，但是為了提高酶切效率可切4?6h。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4C5min,(94Clmin,53Clmin,72Clmin)X30,72ClOmin,4Chold。VspI酶即(AseI酶)：酶切識(shí)別位點(diǎn)為：5'AT；TAAT3'5'TAATfTA3'AseI酶的接頭為：Al：5'CTCGTAGACTGCGTACC3'A2：5'TAGGTACGCAGTC3'AseI酶用的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為：A3：5'CTCGTAGACTGCGTACCTAAT3'2．接頭制備用10ALAl(200AM)和10ALA2(200AM)混合，94C3min后室溫放置30min。3．酶切片段與接頭連接接頭為Al和A2制備的接頭，命名為AE。連接反應(yīng)體系如下：ddH2O5ALT4ligation酶0.5ALT4buffer4AL酶切產(chǎn)物20ALATP(10mM)0.3ALAE1AL總體積30.8AL上述混合體系在16C連接過(guò)夜。10h左右。4?連接產(chǎn)物PCR擴(kuò)增對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本做4管。擴(kuò)增引物為A3。反應(yīng)體系如下:ddH2O14AL10Xbuffer2.5ALMg2＋2ALdNTPs(10mM)0.5ALA3lALDNA(連接產(chǎn)物)5ALTaqE(2.5U/AL)0.2AL總體積25.2ALPCR反應(yīng)程序?yàn)?(94C30sec,56Clmin,72Clmin)X20,72ClOmin,4Chold。5.檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物大小應(yīng)在750bp左右，即400?lOOObp較好。6．回收擴(kuò)增產(chǎn)物將同一樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物收集于一個(gè)EP管中]向其中加入1/10總體積預(yù)冷的3MNaAC和2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇

（或者等體積預(yù)冷的4MNHAC和2倍體積預(yù)冷的異丙醇）4—20°C放置30min（該步可在一20°C長(zhǎng)期保存）室溫，12000rpm離心10min棄上清，加入1ml左右70%乙醇洗滌一次室溫，12000rpm離心5min棄上清，干燥后加入20ALddH2O溶解即可（可以根據(jù)沉淀量加入ddH2O）7．配雜交體系取250?500ng回收DNA與50?8Opmolbio-SSR探針混合，使SSC和SDS終濃度分別為4.2XSSC和0.07%SDS。具體雜交體系如下：ddH2O74.5AL20XSCC21AL10%SDS0.7AL回收產(chǎn)物3ALbio-SSR探針（AC）150.8AL總體積100ALPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5C5min,在58°C可以保存，但是不能時(shí)間長(zhǎng)。在此過(guò)程中可以準(zhǔn)備磁珠。bio-SSR探針序列可以為（AC）、（AC）、（AC）或者AG重復(fù)均可，這個(gè)可以根據(jù)基10 15 12因組序列確定。8．磁珠準(zhǔn)備1） 2mgbeads（200^L）（根據(jù)DNA沉淀的多少?zèng)Q定所用磁珠的量，在100?200AL之間，在解凍磁珠時(shí)應(yīng)輕柔的上下顛倒，不能用力）放置在磁力架上，使其吸附到EP管的一側(cè)，然后從另一側(cè)吸棄清液，再加入1mLTEN100洗滌，輕柔顛倒混勻，使磁珠和TEN100充分混合2min左右，然后放到磁力架上吸附，如此反復(fù)3次即可。 '°°2） 用40ALTEN100溶解最后一次聚集的磁珠。3） 為減少特異性吸附向上述混合液中加入2AL與之無(wú)關(guān)的基因組DNA（如植物基因組）。9．吸附1） 將雜交體系與稀釋的磁珠混合，再加入200ALTEN100稀釋。2） 室溫放置30min，期間輕柔混合（不能用力過(guò)猛，因?yàn)樵撨^(guò)程是目的片段與探針吸附）。10?洗滌（去掉多余DNA和雜質(zhì)）將吸附好的磁珠放到磁力架上去除上清。D松弛型洗滌：400ALTEN1000洗滌3次，每次5min，加入TEN1000后輕柔混勻。2）嚴(yán)謹(jǐn)型洗滌：12ML20XSSC+12yL10%SDS+1176yLddH2O,400AL/次，洗滌3次，每次5min,其間需輕柔混勻。（使SSC終濃度為20%，SDS為0.1%）。11?洗脫1）第一次洗脫：在磁力架上棄上清液，向磁珠中加入50ALTE,95C5min后迅速取出將上清液吸入另一個(gè)管子中（若溫度降低那么則會(huì)復(fù)性），放入一20C保存。2） 第二次洗脫：向第一次洗脫后的磁珠中加入12AL0.15MNaOH,洗脫20min后，將其放在磁力架上，取一側(cè)清液，向清液中加入1.8AL1MHCL，再加入36.2ALTE，總共50AL后，放入一20°C保存。3） 洗脫產(chǎn)物回收：分別對(duì)兩次洗脫后的產(chǎn)物進(jìn)行回收。分別向兩次洗脫后的產(chǎn)物加2MYtRNA,50AL預(yù)冷的4MNH4Ac以及100AL預(yù)冷的異丙醇，放入—20C30min以上（也可以長(zhǎng)時(shí)間保存）。然后12000rpm離心1Omin后棄上清，（應(yīng)特別注意因?yàn)閹缀蹩床坏匠恋?，所以注意小心將弄丟），再加入70%乙醇洗滌一次，再12000rpm離心5min，棄上清。4） 將沉淀干燥后溶于20MLddH2O中。12．?dāng)U增洗脫后回收的產(chǎn)物擴(kuò)增上一步中的回收產(chǎn)物，NL1st，NL2nd；GS1st和GS2nd各擴(kuò)增4管。PCR反應(yīng)體系為：ddH2O13.6AL10Xbuffer2ALMg2＋1.2ALdNTPs(10mM)0.4ALA30.8ALDNA（回收產(chǎn)物）2ALTaqE(2.5U/AL)0.2AL總體積20ALPCR反應(yīng)程序?yàn)?94C5min,（94C1min,53C1min,72C1min）X30,72C10min，4Chold。檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，最好在750bp左右，即400?1000bp均可。13?回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物將所擴(kuò)增的有目的帶的產(chǎn)物加入到一個(gè)EP管中，加入總體積1/10體積的3MNaAc和2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇（也可以用等體積4MNH4Ac和2倍體積的預(yù)冷異丙醇，但是NH4Ac會(huì)去掉小片段，而NaAc不會(huì)），—20C放置30min以上室溫，12000rpm離心1Omin棄上清，加入1ml左右70%乙醇洗滌一次室溫，12000rpm離心5min棄上清，烘干后，沉淀溶于20^LddH2O中。14．與載體連接在EP管中配制連接混合液，總體積為10AL。PMD18-TVector0.5ALInsertDNA1ALddHO23.5PLLigationSolutionl5AL總體積10AL上述混合液在16C連接過(guò)夜。其中，PMD18-TVector用0.5?1AL均可，InsertDNA在0.1?0.3pmol,—般加入1AL,這些都根據(jù)DNA的量確定。LigationSolutionI應(yīng)在冰上溶解。15．連接產(chǎn)物的回收取出連接產(chǎn)物，向10AL反應(yīng)體系中加入2MYtRNA+12AL預(yù)冷的4MNH4Ac+24AL預(yù)冷異丙醇，混勻后一20°C沉降30min以上。（YtRNA的作用是幫助沉淀，因?yàn)檫B接產(chǎn)物較少所以要加入助沉劑YtRNA）室溫，12000rpm離心1Omin棄上清，加入500AL（根據(jù)DNA量多少加）70%乙醇洗滌一次室溫，12000rpm離心5min棄上清，烘干后，沉淀溶于5ALddH2O中。16．電轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化杯和電轉(zhuǎn)化細(xì)胞在冰上預(yù)冷。1.向每管連接產(chǎn)物回收液中加入50AL電轉(zhuǎn)化細(xì)胞，用槍混勻放在冰上。2．把混合液加入電轉(zhuǎn)化小杯中心的孔隙中，放到冰上。用紙擦干小杯，用1500V電壓在電轉(zhuǎn)化儀上進(jìn)行電擊（電擊時(shí)間長(zhǎng)短是根據(jù)DNA量確定的，機(jī)器自己會(huì)控制）。轉(zhuǎn)化后，每個(gè)小杯中加入900AL液體LB（不加氨芐），用槍頭吹打以便使其和轉(zhuǎn)化細(xì)胞混勻。5?取出所有液體加入1.5mLEP管中，170rpm,37C搖1h。6?清洗電轉(zhuǎn)化小杯，避免接觸金屬面，分別用ddHp70%乙醇和無(wú)水乙醇各清洗3次。7.取出搖好的菌液后，適當(dāng)稀釋涂板，30AL菌液+370AL液體LB,然后涂2個(gè)板子，每個(gè)板子200AL。在37C培養(yǎng)過(guò)夜。接頭序列：ATTAGGTACGCAGTCTACGAGCTCGTAGACTGCGTACCTAAT5B：AATGGGAAAGGCACAACTACAAGTCCCAGAATGCAAAGTGCTGTTGGCTAAAAAGCCAGGATTGGCTGAAGGTGTCACACATGACATGGGGCCACTTGGCAGTTTAGCACAGCTCCGAAAAGGGCTTTTGGTGCCAAGGATGGGTATTCCTCTGAGAACATTTGTGCCTGAATTTTGGCGAAAAGTACCCCTGGTCAGAGCTACAGAGCTGGTGTGTGAACTGCCCTGGTGAACGTTTCATCTCTACTCTGCACCACATAGTGGCTGGGGTTTTCCCCACACTTTTTACTCAGTGCAACATTAGCCTTGTGATTTGTTTTTCTCAGTAGTGTAAAAACACAGTTCTTCAGATTCCAGGTTGCTTCACTTGTGGTTGTTCCTCTGCTCCCTGGTGACTTTGCTTAGAAGCTCCAGTATTACAAAGATTGTACATGCACCTCTATCTAGCCCTCTTTGTTCCTCTACTGATGTTTTTCTGTTGGTGTCTCACTTGATCTGTCTCTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCATCACTCTCTTTCTCCAGCATCATACTTGCTCACTCCACAAATCCTCCCATCTCTCTCTCACACAGTCTCTCTCCCTCTCTCAATCTGTCTTTTTTTTTGTGGTGTTTTGACGCGTGCATGA

CCCCAAGATTGGGGTATCGGCCAGCGCAGTTTAA矗qi閨meMotifNo.ofSSRerkl5B-1tc11606527604RatingSe<|HoLeiij[|tliTmPC]GC4oAG^calsJtnol]Activity【陽(yáng)4D]Sense100352055.3EM-37.23=5.1Aiiti-sense100230?055.350.0-37.?31.2Product88—19GS5.544%--―HairpinDimerFalsePrimingCross：DimerNoHairpinsFoliikISenseNoneNoneNoneFoundAiiti-senseNoneNoneNonePl：5'CTCCCTGGTGACTTTGCTTA3'P2：5'GATGGGAGGATTTGTGGAGT3'SsrttPrimer5.0微衛(wèi)星分子標(biāo)記篩選方法綜述摘要：微衛(wèi)星是一種短的串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat,STR)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simplesequencerepeats,SSR)。它作為一種重要的分子遺傳標(biāo)記，能較好地反映物種的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性變化，被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究。本文概述了獲得和富集微衛(wèi)星位點(diǎn)的常用方法。最簡(jiǎn)便、最省時(shí)的方法是從從公共數(shù)據(jù)庫(kù)(如Genbank、EMBL、EST數(shù)據(jù)庫(kù)等)或已發(fā)表的文獻(xiàn)中查找到微衛(wèi)星位點(diǎn)，但只限于已經(jīng)有序列數(shù)據(jù)發(fā)布的物種；第二種方法是種間轉(zhuǎn)移擴(kuò)增，即從相近物種的數(shù)據(jù)庫(kù)中查找微衛(wèi)星位點(diǎn)，或使用已有數(shù)據(jù)發(fā)表的遺傳距離相近物種的微衛(wèi)星標(biāo)記。第三種方法是從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)，其中用于富集微衛(wèi)星的方法有引物法、磁珠雜交法、尼龍膜雜交法以及分子標(biāo)記技術(shù)法。關(guān)鍵詞：微衛(wèi)星；分子標(biāo)記；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微衛(wèi)星(Microsatellite),又稱(chēng)為簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SimpleSequenceRepeat,SSR)，短串聯(lián)重復(fù)(ShortTandemRepeatSTR),是以少數(shù)幾個(gè)核苷酸(一般1?6個(gè))為重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)DNA序列。微衛(wèi)星位點(diǎn)廣泛分布于真核生物的基因組中［1］，在植物基因組中平均每33Kb存在一個(gè)20bp長(zhǎng)的微衛(wèi)星位點(diǎn)，而在哺乳動(dòng)物中每6Kb存在一個(gè)20bp長(zhǎng)的微衛(wèi)星位點(diǎn)［2］。并且SSR的重復(fù)次數(shù)不同和重復(fù)程度不同，使其呈現(xiàn)高度的多態(tài)性。微衛(wèi)星標(biāo)記共顯性的特點(diǎn)使它能夠用于研究等位基因，區(qū)分二倍體(或多倍體)的純合體或雜合體，這是AFLP、RAPD等顯性標(biāo)記所無(wú)法做到的。另外，微衛(wèi)星的特異性引物擴(kuò)增具有良好的重復(fù)性和保真性，方便各實(shí)驗(yàn)室間的交流。目前，微衛(wèi)星標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用到基因連鎖與遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性研究、譜系和發(fā)育研究、疾病檢測(cè)以及品種鑒定、親本分析與個(gè)體、純系檢驗(yàn)上。隨著微衛(wèi)星標(biāo)記在圖譜上的豐富,將顯現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)。但微衛(wèi)星分析中引物的獲得需要預(yù)先獲知核酸序列,其廣泛應(yīng)用受限于從特定的物種中分離微衛(wèi)星位點(diǎn)的難度和花費(fèi)。微衛(wèi)星標(biāo)記分離最大的困難是引物的獲得。同RAPD、AFLP等遺傳標(biāo)記不同，微衛(wèi)星研究首先需要獲知位點(diǎn)的序列信息，以便從重復(fù)序列兩端側(cè)翼的保守序列中設(shè)計(jì)引物。因而微衛(wèi)星引物的開(kāi)發(fā)是應(yīng)用該技術(shù)的關(guān)鍵。目前已知微衛(wèi)星位點(diǎn)的物種很有限，這是因?yàn)槲⑿l(wèi)星位點(diǎn)的獲得需經(jīng)過(guò)克隆、雜交篩選、測(cè)序等步驟，因此需花費(fèi)一定的人力、金錢(qián)，這限制了微衛(wèi)星標(biāo)記的大量使用。但近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的各種微衛(wèi)星位點(diǎn)富集技術(shù)已在一定程度上解決了這個(gè)問(wèn)題。已有的最常用的獲得微衛(wèi)星位點(diǎn)的方法包括：1.從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中查找微衛(wèi)星位點(diǎn)；2?遺傳距離相近物種間引物轉(zhuǎn)移擴(kuò)增；3?從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)。其中，最方便、最經(jīng)濟(jì)的方法就是從已發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得微衛(wèi)星引物，但該法在使用對(duì)象上，只限于已有引物開(kāi)發(fā)出的物種，而且引物的數(shù)量不會(huì)有所增加，只能停留在原有基礎(chǔ)上。對(duì)于近緣種引物的應(yīng)用，其適用范圍究竟有多大；原物種的微衛(wèi)星基因座在其他物種間轉(zhuǎn)移擴(kuò)增時(shí)，其多態(tài)性如何。這些問(wèn)題使得在不同物種間共用微衛(wèi)星引物時(shí)，盲目性較大，可指導(dǎo)操作的理論依據(jù)不足。最好的途徑就是從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)并進(jìn)行引物的開(kāi)發(fā)。從數(shù)據(jù)庫(kù)中查找微衛(wèi)星位點(diǎn)在上述三種方法中,最簡(jiǎn)便最省時(shí)的就是從公共數(shù)據(jù)庫(kù)或已發(fā)表的文獻(xiàn)中查找到微衛(wèi)星位點(diǎn)。許多微衛(wèi)星研究的出發(fā)點(diǎn)都是公共數(shù)據(jù)庫(kù)，比如從EMBL、Genbank或EST數(shù)據(jù)庫(kù)中查找微衛(wèi)星位點(diǎn)。從這些數(shù)據(jù)庫(kù)中，可通過(guò)電子查詢(xún)方式方便地獲得所需要的序列或?qū)ふ乙汛嬖诘奈⑿l(wèi)星引物。研究者對(duì)大量序列進(jìn)行處理，利用ClustalW等程序，根據(jù)相似性程度，剔除冗余的EST，再剔除過(guò)短的序列（小于lOObp）和過(guò)長(zhǎng)的序列（大于lOOObp）,再利用SSRHunter等軟件搜索獲得含有微衛(wèi)星的序列，并根據(jù)其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物。何蔚［3］等選用前人分離得到的42對(duì)大熊貓微衛(wèi)星引物，分別用圈養(yǎng)大熊貓的血液DNA和野生大熊貓的糞便DNA對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明不同標(biāo)記的多態(tài)性差異較大，并篩選出13對(duì)能較好地應(yīng)用于大熊貓遺傳多樣性研究的微衛(wèi)星引物?？飫倶颍?］等利用生物信息學(xué)方法從公開(kāi)發(fā)表的鱖魚(yú)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找多態(tài)信息含量豐富的微衛(wèi)星位點(diǎn)中共搜索到304條鱖魚(yú)核酸序列，經(jīng)計(jì)算機(jī)篩選和人工選擇,最終獲得22條含微衛(wèi)星重復(fù)單元的序列，利用SSRHunter軟件在此22條含有微衛(wèi)星的序列中發(fā)現(xiàn)30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出17對(duì)引物，其余位點(diǎn)兩端序列短無(wú)法設(shè)計(jì)引物。其中13對(duì)引物擴(kuò)增條帶清晰，經(jīng)過(guò)多態(tài)性分析，最終篩選獲得6對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星引物。徐玲玲⑸等從資料和GenBank中選取擴(kuò)增效果好、等位基因多、均勻分布于小型豬18條常染色體和X染色體上的100個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)合成引物，對(duì)封閉群小型豬基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增及條件優(yōu)化，篩選出32個(gè)分布于不同染色體且等位基因多的微衛(wèi)星位點(diǎn)。近年來(lái)隨著數(shù)據(jù)庫(kù)中EST序列的增加，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋法獲得EST微衛(wèi)星位點(diǎn)的報(bào)道越來(lái)越多。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行SSR引物開(kāi)發(fā)也就成了一種既經(jīng)濟(jì)又有效的方法。許新⑹等從雜色鮑cDNA文庫(kù)中用SSRHunter軟件搜索獲得173個(gè)重復(fù)序列，從中設(shè)計(jì)93對(duì)引物，有78對(duì)可以擴(kuò)增，占合成總引物的83.9%，用深圳、汕尾等3個(gè)群體中挑選出多態(tài)性引物19對(duì)，多態(tài)性微衛(wèi)星比例24.36%。石耀華⑺等從馬氏珠母貝cDNA文庫(kù)查找到了268個(gè)重復(fù)序列，含微衛(wèi)星的EST數(shù)占EST總數(shù)的3.48%，設(shè)計(jì)151對(duì)微衛(wèi)星引物，有130對(duì)可以擴(kuò)增，占合成引物總數(shù)的86.09%，其中多態(tài)性引物45對(duì)，占微衛(wèi)星總數(shù)的34.6%。EST微衛(wèi)星位于編碼區(qū)，由于基因序列的保守性，EST微衛(wèi)星序列比從基因組中篩選的微衛(wèi)星多態(tài)性低°Eujayl⑻比較了小麥EST的微衛(wèi)星和基因組微衛(wèi)星多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因組微衛(wèi)星多態(tài)性（53%）遠(yuǎn)高于EST微衛(wèi)星（25%）。從數(shù)據(jù)庫(kù)中查找微衛(wèi)星最大的缺點(diǎn)是只限于已經(jīng)有序列數(shù)據(jù)發(fā)布的物種。一個(gè)替代方法是從相近的物種數(shù)據(jù)庫(kù)中查找微衛(wèi)星位點(diǎn)，或使用已發(fā)表的遺傳距離相近物種的微衛(wèi)星標(biāo)記。近緣物種交叉擴(kuò)增獲得微衛(wèi)星引物由于微衛(wèi)星重復(fù)序列和包含引物位點(diǎn)的側(cè)翼序列在物種間具有保守性，所以某一個(gè)物種的微衛(wèi)星引物可以在其相近的物種中使用，用來(lái)檢測(cè)相近物種同源位點(diǎn)的多態(tài)性。這樣就大大地減少了檢測(cè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的工作量。微衛(wèi)星在近緣種之間的通用性已有研究,但在屬間應(yīng)用還不多。根據(jù)M.Rossetto［9］對(duì)近年來(lái)發(fā)表文獻(xiàn)的總結(jié)，微衛(wèi)星位點(diǎn)可在物種間擴(kuò)增，其多態(tài)性也相當(dāng)高。Zucoloto［10］等利用密西西比鱷和寬吻凱門(mén)鱷的微衛(wèi)星在其他3種鱷魚(yú)中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增率均在85%以上。Kupper［11］等使用的環(huán)頸鸻微衛(wèi)星成功地在4種鸻科鳥(niǎo)類(lèi)中獲得擴(kuò)增，平均擴(kuò)增率為75%。蔡清秀［12］等從從非洲象31個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)和5個(gè)已知亞洲象微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選出14個(gè)勐養(yǎng)亞洲象的微衛(wèi)星位點(diǎn)，其中9個(gè)多態(tài)位點(diǎn)能在185份糞便樣品DNA中穩(wěn)定擴(kuò)增。孫濤［13］等利用138條人類(lèi)微衛(wèi)星引物在黑葉猴中進(jìn)行篩選，得到了23個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。其中有7個(gè)位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡，9個(gè)位點(diǎn)存在無(wú)效等位基因現(xiàn)象，但是各位點(diǎn)之間均未檢測(cè)到連鎖不平衡現(xiàn)象，這些位點(diǎn)將在黑葉猴種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)揮重要作用。洪艷云［14］等選用10對(duì)非洲糜羚微衛(wèi)星引物和10對(duì)綿羊微衛(wèi)星引物作為篩選普氏原羚基因組DNA微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20對(duì)引物中有8對(duì)引物在普氏原羚基因組DNA中擴(kuò)增出了多態(tài)性位點(diǎn)。 譚元卿［15］等利用小鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)引物536對(duì)，對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠基因組DNA擴(kuò)增出了313個(gè)陽(yáng)性條帶，經(jīng)測(cè)序分析確定130個(gè)長(zhǎng)爪沙鼠的微衛(wèi)星位點(diǎn)，與小鼠同源性為24.3%。引物跨物種共用的有效程度除與其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近有關(guān)外。Primmer［16］等對(duì)大量鳥(niǎo)類(lèi)微衛(wèi)星交叉擴(kuò)增研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行總結(jié)后提出，交叉擴(kuò)增中微衛(wèi)星在來(lái)源物種中的完全重復(fù)單元數(shù)目(perfectrepeatunits)與交叉擴(kuò)增所獲得的同源微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性呈正相關(guān)。微衛(wèi)星位點(diǎn)的重復(fù)單元數(shù)目越多，其多態(tài)性也就越高，這表明微衛(wèi)星位點(diǎn)的高重復(fù)單元數(shù)目在其近緣物種仍有所保持。這意味著即使由于較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系使物種間交叉擴(kuò)增率較低，具有較高重復(fù)單元數(shù)目的原始微衛(wèi)星位點(diǎn)仍有可能獲得有價(jià)值的擴(kuò)增產(chǎn)物。值得注意的是，僅從產(chǎn)物片斷大小和變化上不是總能很好地確定微衛(wèi)星的存在，通過(guò)改變擴(kuò)增條件用微衛(wèi)星引物在物種間擴(kuò)增得到產(chǎn)物后，仍需要通過(guò)雜交、測(cè)序等方法確定所擴(kuò)增出的條帶就是所期望的產(chǎn)物。從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)于無(wú)法從上面兩種方法獲得微衛(wèi)星引物的物種，可以從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)。絕大多數(shù)微衛(wèi)星位點(diǎn)是從100-1000bp的小插入片段基因組文庫(kù)中通過(guò)寡核苷酸探針雜交獲得的。標(biāo)準(zhǔn)的分離微衛(wèi)星位點(diǎn)的方法有如下步驟：①提取基因組DNA；②用限制性?xún)?nèi)切酶將基因組DNA切割成小片段；③凝膠電泳，回收大小100-1000bp的片段；④將回收片段克隆，使用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交；⑤篩選出含有重復(fù)序列的克隆；⑥測(cè)序證實(shí)重復(fù)序列片段的存在；⑦根據(jù)重復(fù)序列片段兩端保守序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢驗(yàn)引物的有效性；⑧對(duì)小量樣本進(jìn)行預(yù)試驗(yàn),挑選出重復(fù)性好，具多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。按以上步驟，Srikwan［17］和Munshi-South［18］利用尼龍膜菌落原位雜交法分離出6個(gè)泰國(guó)樹(shù)鼩(Tupaiaglis)和5個(gè)馬來(lái)西亞樹(shù)鼩(Tupaiaspp.)的微衛(wèi)星位點(diǎn)。魏東旺［19］等從鯉魚(yú)基因組DNA中篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)，用探針(CA)n對(duì)質(zhì)粒pGEM-3Zf(+)構(gòu)建的基因文庫(kù)進(jìn)行雜交篩選，從2000個(gè)白色菌落中共獲得陽(yáng)性克隆45個(gè)，其中32個(gè)克隆中共得到22個(gè)微衛(wèi)星。從基因組文庫(kù)中分離微衛(wèi)星位點(diǎn)的傳統(tǒng)方法在微衛(wèi)星富集程度上效率很低，為了提高微衛(wèi)星位點(diǎn)分離的效率，在文庫(kù)構(gòu)建前或構(gòu)建后發(fā)展了一些富集方法。3.1雜交法富集微衛(wèi)星雜交富集法根據(jù)所使用的介質(zhì)不同可分為三種：磁珠法、尼龍膜法和親和素超濾離心法。磁珠富集法磁珠富集法的基本原理是用生物素標(biāo)記重復(fù)序列寡核酸探針并與基因組DNA酶切片段雜交，再利用生物素與親和性強(qiáng)的特性，使兩者相互作用的穩(wěn)定性和強(qiáng)度即使在變性、雜交、洗脫等操作過(guò)程中也不產(chǎn)生分離，從而完成對(duì)重復(fù)序列目標(biāo)片段的富集，建立微衛(wèi)星富集文庫(kù)。經(jīng)過(guò)磁珠富集后使獲得的具有重復(fù)序列片段的效率大幅度提高。目前，鏈親和素包埋的磁珠已被廣泛應(yīng)用到各種微衛(wèi)星富集方法中。磁珠雜交的微衛(wèi)星富集過(guò)程是在文庫(kù)構(gòu)建前，一般步驟如下：限制性?xún)?nèi)切酶酶切基因組DNA，酶切后的DNA片段＜1000bp；接頭連接酶切DNA片段；酶切位點(diǎn)和接頭作為引物結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)行擴(kuò)增，增加DNA片段量；生物素標(biāo)記的互補(bǔ)微衛(wèi)星寡核酸探針同PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交；鏈霉素包埋的磁珠雜交篩選目的片段；目的片段洗脫、擴(kuò)增、純化、克隆；陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR分析；多態(tài)性鑒定。于穎［20］等通過(guò)磁珠富集法構(gòu)建了藏雞基因組微衛(wèi)星富集文庫(kù)，從1200個(gè)轉(zhuǎn)化子中獲得了353個(gè)陽(yáng)性克隆，隨機(jī)挑選53個(gè)測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果成功設(shè)計(jì)了18對(duì)藏雞微衛(wèi)星引物，最終篩選出6個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記。袁慧［21］等用磁珠富集法構(gòu)建了巖原鯉AC重復(fù)和GATA重復(fù)的微衛(wèi)星富集文庫(kù)，陽(yáng)性克隆率分別為30%和7%左右。對(duì)40個(gè)AC重復(fù)的陽(yáng)性克隆和30個(gè)GATA重復(fù)的陽(yáng)性克隆測(cè)序，共獲得61個(gè)微衛(wèi)星序列。朱亮［22］等法應(yīng)用磁珠和生物素標(biāo)記的微衛(wèi)星探針與豚鼠基因組酶切片段雜交，捕獲200-1000bp含有微衛(wèi)星序列的DNA片段，克隆構(gòu)建富集微衛(wèi)星序列的小片段插入文庫(kù)然后用PCR法進(jìn)行篩選，結(jié)果從約2000個(gè)轉(zhuǎn)化子中獲得240個(gè)陽(yáng)性克隆對(duì)其中98個(gè)進(jìn)行了測(cè)序，并成功設(shè)計(jì)豚鼠微衛(wèi)星引物17對(duì)。WANG［23］等采用磁珠富集法建立黑斑狗魚(yú)微衛(wèi)星富集文庫(kù)，然后利用Y-32P標(biāo)記的放射性同位素探針進(jìn)行第二次雜交，得到的陽(yáng)性克隆為1300個(gè)，占87.25%，從中挑出196個(gè)進(jìn)行測(cè)序，192(97.96%)個(gè)含有微衛(wèi)星序列。趙亮［24］等為促進(jìn)大銀魚(yú)保護(hù)遺傳學(xué)的開(kāi)展，采用磁珠富集微衛(wèi)星序列技術(shù)，提高了微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選效率，成功獲得6個(gè)具有多態(tài)性的(CA)n重復(fù)序列的大銀魚(yú)微衛(wèi)星位點(diǎn)。李齊發(fā)［25］等用鏈親和素磁珠親和捕捉與生物素標(biāo)記的微衛(wèi)星寡核苷酸探針(CA)12、(CCG)8、(CAG)8、(TTTC)8退火結(jié)合的含有接頭和牦牛微衛(wèi)星序列的單鏈限制性酶切片段，首次成功構(gòu)建牦?；蚪M微衛(wèi)星富集文庫(kù)。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性克隆率為77%(37/48)，說(shuō)明構(gòu)建的牦牛基因組微衛(wèi)星富集文庫(kù)是一個(gè)高質(zhì)量的文庫(kù)。閆守慶［26］等將貉基因組DNA酶切片段與MboI連接頭連接，連接產(chǎn)物與生素物標(biāo)記的(AC)n微衛(wèi)星探針變性及退火，再通過(guò)鏈親和素偶聯(lián)磁珠親和捕捉，經(jīng)吸附、洗滌、洗脫、PCR擴(kuò)增，連接轉(zhuǎn)化構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫(kù)，經(jīng)測(cè)序分析表明該文庫(kù)含重組克隆約2800個(gè)，陽(yáng)性克隆71.4%。李新國(guó)［27］等以日本扁柏4個(gè)種源的DNA樣品為材料，與含有生物素標(biāo)記的(CT)15探針雜交，再用磁珠富集雜交產(chǎn)物，成功地實(shí)現(xiàn)了日本扁柏核基因組微衛(wèi)星的高效分離，共獲得2200多個(gè)陽(yáng)性克隆，發(fā)現(xiàn)含有微衛(wèi)星的克隆比例高達(dá)65.6%。尼龍膜富集法尼龍膜法的主要步驟包括限制性?xún)?nèi)切酶酶切基因組DNA；接頭連接；通過(guò)吸附在尼龍膜上的許多微衛(wèi)星探針來(lái)富集基因組中的微衛(wèi)星片段；洗脫結(jié)合片段，用接頭作為引物進(jìn)行；目的片段連接到質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽(yáng)性克隆測(cè)序。戰(zhàn)愛(ài)斌［28］等應(yīng)用微衛(wèi)星富集文庫(kù)一菌落原位雜交法，用固定了(AG)15和(AC)15探針的尼龍膜(HybondN+)捕捉含有微衛(wèi)星DNA的片段，經(jīng)洗脫、PCR擴(kuò)增和TA克隆，構(gòu)建櫛孔扇貝的微衛(wèi)星富集文庫(kù)。富集文庫(kù)中1200個(gè)重組克隆經(jīng)過(guò)菌落原位雜交后，532個(gè)(44.3％)為陽(yáng)性克隆。任意挑選100個(gè)克隆測(cè)序，結(jié)果顯示所有的克隆都至少含有一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。3.1.2親和素和超濾離心富集法親和素超濾離心法的一般過(guò)程如下：限制性?xún)?nèi)切酶酶切基因組DNA，酶切后的DNA片段＜1000bp；接頭連接酶切DNA片段；酶切位點(diǎn)和接頭作為引物結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)行擴(kuò)增，增加DNA片段量；生物素標(biāo)記的互補(bǔ)微衛(wèi)星寡核酸探針同PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交；用親合素捕獲并超濾離心濃縮富集雜交的目的片段；以富集的核酸作為模板，反應(yīng)體系和程序同前進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物再次雜交、捕獲、濃縮富集和擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物克??；陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR分析；多態(tài)性鑒定。李石柱［29］等應(yīng)用湖北釘螺基因組DNA的酶切片段與生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交，親合素捕獲并超濾離心濃縮富集、克隆并測(cè)序，獲得湖北釘螺微衛(wèi)星DNA序列205條，GenBank注冊(cè)登記號(hào)GU204044-GU204248。張麗［30］等應(yīng)用中華白蛉基因組DNA的酶切片段與生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交，親合素富集和超濾離心濃縮目的片段，擴(kuò)增放大后克隆并測(cè)序，獲得118條微衛(wèi)星序列，重組克隆陽(yáng)性率為78.6%。樊勇［31］等應(yīng)用中華按蚊基因組DNA的酶切片段與生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交，親合素富集和超濾離心濃縮目的片段，擴(kuò)增放大，克隆并測(cè)序，獲得252條序列，GenBank注冊(cè)登記號(hào)為EF620047-EF620298。馬雅軍［32］等對(duì)雷氏按蚊的微衛(wèi)星DNA序列進(jìn)行了分離，應(yīng)用雷氏按蚊基因組DNA的酶切片段與生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交,親合素富集和超濾離心濃縮目的片段，擴(kuò)增放大后克隆并測(cè)序,獲得雷氏按蚊微衛(wèi)星DNA58條，GenBank注冊(cè)登記號(hào)為EF620299-EF620356。引物法富集微衛(wèi)星引物法富集微衛(wèi)星一般是使用同目的微衛(wèi)星重復(fù)互補(bǔ)的寡核苷酸作為引物，通過(guò)PCR反應(yīng)在文庫(kù)構(gòu)建前或構(gòu)建后富集微衛(wèi)星位點(diǎn)。根據(jù)所使用引物類(lèi)型的不同可分為兩類(lèi)：引物序列同微衛(wèi)星寡核苷酸互補(bǔ)以及簡(jiǎn)并性寡核苷酸引物。Paetgkau［33］用