生物化學檢驗中酶的測定

生物化學檢驗中酶的測定第一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日前言酶的測定方法分為絕對定量法和相對定量法兩大類。絕對定量法是通過特異試劑與酶作用直接測定酶蛋白量或酶分子濃度的方法。相對定量法是根據(jù)酶的催化活性或酶促反應速度來間接測定酶濃度的方法。目前臨床上所用的方法多屬相對定量法。第二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日本節(jié)內(nèi)容一、酶活性濃度的測定二、酶質量濃度的測定三、同工酶及其亞型測定四、酶活性濃度測定的主要影響因素及控制第三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶活性濃度的測定第四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日主要內(nèi)容酶活性濃度測定的基本原理酶活性濃度的測定方法底物或產(chǎn)物濃度的檢測酶偶聯(lián)反應法工具酶與共通反應途徑酶活性濃度的單位第五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶活性濃度測定的

基本原理第六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶催化活性的途徑酶催化活性可通過測定酶促反應過程中單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，即測定酶促反應的速率來獲得。用這種方法獲得的酶濃度的確切名稱是“酶的催化活性濃度”或簡稱為“酶活性濃度”。第七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶活性與反應速率的關系若[S]>>Km，且[S]很大，米-曼氏方程式可簡化為：此時，酶促反應的最大速度只與酶催化活性或酶量[E]成正比例，它是建立準確、可靠測定方法的基礎。第八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶促反應過程的分期一個典型的酶促反應過程一般包括三個階段。延滯期（lagphase）、線性期（linearphase）非線性期（nonlinearphase）第九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶促反應時間進程曲線第十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日注意事項要準確測定酶活性，必須了解不同酶反應速率和時間的關系，找出酶促反應速率恒定的時間，避開延滯期、非線性反應期。傳統(tǒng)的手工分析法無法在零級反應期測定，故結果不夠準確。第十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶活性濃度的測定方法第十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶活性濃度的測定方法以反應時間為依據(jù)，酶活性濃度測定方法可分為兩大類定時法（fixedtimeassay）連續(xù)監(jiān)測法（continuousmonitoringassay）第十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日定時法通常是酶作用一段時間后，加入強酸、強堿、蛋白沉淀劑等終止酶促反應，測定這段時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，計算酶促反應的平均速度。第十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日定時法中酶促反應的過程第十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日注意事項用定時法測定酶活性濃度，必須了解不同酶促反應速率和時間的關系，應先做預試驗找出酶促反應速率恒定的時期，確定線性時間，然后在這段時間進行測定，避開延滯期和一級反應。第十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日連續(xù)監(jiān)測法連續(xù)監(jiān)測法是指每隔一定時間（2～60s），連續(xù)多次測定酶反應過程中某一反應產(chǎn)物或底物量隨時間變化的數(shù)據(jù)，求出酶反應初速度，間接計算酶活性濃度的方法。第十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日連續(xù)監(jiān)測法的測定時間第十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日注意事項自動生化分析儀能自動獲取規(guī)定時間內(nèi)的信號，自動判斷非線性度，所以連續(xù)監(jiān)測法更適合于自動化儀器。目前已取代固定時間法而成為臨床實驗室測定酶活性濃度最常用的方法。第十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日底物或產(chǎn)物濃度的檢測第二十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日底物或產(chǎn)物濃度的檢測在酶活性測定方法中，無論是定時法還是連續(xù)監(jiān)測法，酶促反應速度都要通過測定底物或產(chǎn)物來實現(xiàn)。依據(jù)酶促反應中底物或產(chǎn)物的理化特性質及檢測方法，酶活性濃度測定的方法可分為直接法和間接法。第二十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日直接法這類方法是在不終止酶促反應條件下，通過特殊的儀器直接測定反應體系中底物或產(chǎn)物的理化特性變化量，如吸光度、熒光、旋光性、pH、電導率、粘度等，從而計算出酶活性濃度的方法。第二十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日基于NADH或NADPH理化特性的測定方法利用NAD(P)H在340nm處的吸光度值的變化，測定各種脫氫酶的活性，該法是目前應用最廣的一類方法。第二十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日基于人工合成色素原底物理化特性的測定方法一些水解酶類或轉移酶類可通過酶促反應將化合物中的某一基團水解或移去，使無顏色的底物轉變?yōu)橛蓄伾漠a(chǎn)物。人們把這類底物稱為“色素原”底物。根據(jù)這一原理，人們設計合成了一系列底物用來測定酶活性。第二十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第二十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日間接法間接法是指酶促反應底物和產(chǎn)物之間沒有特征性的理化性質，需通過另一個化學反應或生化反應，將底物或產(chǎn)物轉化為有明顯特征理化性質的另一個化合物，然后進行測定的方法。第二十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日化學法大多數(shù)是在酶促反應終止后加入另一個試劑與底物或產(chǎn)物反應，轉化為有色化合物，再用分光光度法檢測。部分酶類是在原來反應體系中加入一些與酶促反應無關的試劑，這些試劑只和酶促反應的某一反應物迅速作用，產(chǎn)生可被儀器檢出的有特征性物質，但同時又不和酶作用也不影響酶活性。第二十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶偶聯(lián)法是目前在酶活性測定中應用最多，最為廣泛的方法。即在原反應體系中加入另一些酶試劑，將所進行的酶促反應和被測酶反應偶聯(lián)起來。在臨床常規(guī)酶學分析中，以NAD（P）H為輔酶或輔基的脫氫酶，以及過氧化物酶（POD）是常用的酶偶聯(lián)法的酶試劑。第二十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶偶聯(lián)反應法第二十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶偶聯(lián)反應式第三十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶偶聯(lián)反應法的基本原理在酶活性測定時，如果底物或產(chǎn)物不能直接測定或難于準確測定，可采用酶偶聯(lián)法測定，即在反應體系中加入一個或幾個工具酶，將待測酶生成的某一產(chǎn)物轉化為新的可直接測定的產(chǎn)物，當加入酶的反應速度與待測酶反應速度達到平衡時，可以用指示酶的反應速度來代表待測酶的活性。第三十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第三十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶偶聯(lián)反應法的反應進程用酶偶聯(lián)法測定酶活性濃度時，酶促反應進程存在四個時相：①預孵育期或預溫期。②延滯期。③穩(wěn)態(tài)期或恒態(tài)期。④非恒態(tài)期。第三十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶偶聯(lián)法的吸光度變化示意圖第三十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日注意事項應用酶偶聯(lián)法測定時，關鍵在于確定恒態(tài)期，因為只有恒態(tài)期才能代表酶活性。只有此階段的吸光度才會有明顯線性變化。第三十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日工具酶與共通反應途徑第三十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日工具酶在酶學分析中，作為試劑用于測定化合物濃度或酶活性濃度的酶稱為工具酶。常用的工具酶有氧化還原酶類、轉移酶類和水解酶類，但以氧化還原酶類更多見，因為其產(chǎn)物最易被直接監(jiān)測而成為指示酶。第三十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第三十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日共通反應途徑在臨床生物化學檢驗中，許多項目的測定往往使用有工具酶的參與的類似的反應原理，即所謂共通（或通用）反應途徑。第三十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日兩類常用的通用反應途徑NAD(P)+或NAD(P)H偶聯(lián)的脫氫酶及其指示反應偶聯(lián)H2O2的工具酶及其指示反應第四十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶活性濃度的單位第四十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶活性濃度的單位酶活性單位慣用單位，國際單位（IU），Katal單位;酶活性濃度單位酶活性濃度以每單位體積所含的酶活性單位數(shù)表示。U/L。第四十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日正常上限倍數(shù)正常上限升高倍數(shù)（upperlimitsofnormal,ULN）是指把酶測定值轉換為正常上限值的倍數(shù)。簡單地說，就是用測得的酶活性結果除以參考范圍的上限值。第四十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶質量濃度的測定第四十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶濃度嚴格來說是指酶分子的質量濃度，常以酶蛋白濃度來表示。人體體液中的酶有幾百種，除LPS、LCAT、ChE、銅氧化酶（CER）外，大多數(shù)酶的含量在μg/L水平甚至更低。因此，酶活性濃度的測定是目前主要測定方法。20世紀70年代以后，隨著新技術特別是免疫學技術的發(fā)展，酶的定量分析技術中出現(xiàn)了許多利用酶蛋白的抗原性，通過抗原抗體反應直接測定酶蛋白質量的新方法。第四十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶蛋白濃度測定的方法國內(nèi)外曾使用電泳法、柱層析法、免疫化學法等測定酶濃度，其中以免疫化學法應用較廣。免疫化學法是利用酶蛋白的抗原性，制備特異性抗體后用免疫學方法測定酶濃度。第四十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶濃度測定的免疫化學方法免疫抑制法、免疫沉淀法、放射免疫測定（RIA）、化學發(fā)光免疫測定（CLIA）、酶免疫測定（EIA）、熒光酶免疫測定（FEIA）等。其中，前兩種方法可用于酶活性濃度測定，其他方法則用于酶蛋白濃度測定。例如，如免疫抑制法測定CK-MB的活性、免疫沉淀法（單向擴散法）法測定超氧化物歧化酶（SOD）的活性；RIA測定胰蛋白酶和彈性蛋白酶濃度、CLIA測定CK-MB的濃度、ELISA測定神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）濃度等。第四十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日CK-MB是診斷AMI、測定心肌梗塞面積的重要指標。近年來，國外對AMI診斷效率評價時多采用測定CK-MB質量，即測定CK-MB的酶蛋白質量濃度（Mass）的方法。CK-MB質量的測定通常是制備抗CK-M抗體和抗CK-B抗體或采用CK-MB抗體，用CLIA、ELISA、FEIA等方法測定。第四十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日CK-MB這些方法適用于臨床自動化分析，具有測定時間短（最快僅需7min）、靈敏性高（最低檢測限<μg/L）和準確性好的特點，明顯優(yōu)于其他分析測定CK-MB的方法，1990年后逐漸被廣泛接受。為使CK-MB質量分析標準化，AACC成立了專門的標準化委員會，最近已研制成功采用重組基因技術的CK-MB參考材料（Rck-2）。第四十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日注意由于酶濃度測定方法的不同，報告方式也有差異酶活性濃度單位常以U/L報告，酶質量（mass）濃度單位常直接用ng/ml或g/L報告。第五十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日免疫化學法測定酶濃度的優(yōu)缺點①靈敏度高，靈敏度達到ng/Ｌ至μg/Ｌ的水平，能測定樣品中用原有其他方法不易測出的少量或痕量酶；②特異性高，幾乎不受體液中其他物質，如酶抑制劑、激活劑等的影響，不受藥物的干擾；第五十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日免疫化學法測定酶濃度的優(yōu)缺點③能用于一些不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白的酶測定，如各種酶原或去輔基酶蛋白，或因遺傳變異而導致合成無活性的酶蛋白，以及失活的酶蛋白等；④在某些情況下，與酶活性測定相結合，計算免疫比活性，能提供更多的具有臨床應用和研究價值新的資料和信息。⑤特別適用于同工酶的測定。第五十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日酶的免疫化學測定的局限性①要制備足夠量的提純酶作為抗原和具有免疫化學性質的抗血清常常是很困難的，而且工作量很大；②測定步驟多，操作繁瑣；③測定成本高。第五十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日同工酶及其亞型測定第五十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日主要內(nèi)容同工酶的概念電泳法色譜法免疫分析法動力學分析法蛋白酶水解法第五十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日同工酶的概念同一種屬中由不同基因或等位基因所編碼的多肽鏈單體、純聚體或雜化體，具有相同的催化作用，但其分子構成、空間構像、理化性質、生物學性質以及器官分布或細胞內(nèi)定位不同的一組酶稱為同工酶。凡酶蛋白結構不同的同工酶稱為原級同工酶，而將經(jīng)加工或修飾后的同工酶稱為次級同工酶或酶的多種形式。第五十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日第五十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日同工酶的測定由于同工酶（及其亞型同工型）一級結構的不同，導致其在理化性質、催化性質、生物學等方面有明顯的性質差異，這些差異為同工酶的分析和鑒定提供了理論基礎。臨床同工酶的分析大致可分為兩步，即首先精確地分離出某酶的各同工酶組分，然后測定酶的總活性和各同工酶組分的活性。第五十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日電泳法在研究同工酶的所有方法中，電泳法的使用最為廣泛。目前所采用的電泳方法大致可分為顯微電泳、自由界面電泳和區(qū)帶電泳三大類。臨床上以區(qū)帶電泳最為常用。第五十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日區(qū)帶分離用電泳法進行區(qū)帶分離的原理與其他蛋白電泳相似。可用的支持物雖多，但目前的實驗室多用醋酸纖維素薄膜（簡稱醋纖膜）、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠作為電泳支持介質。國內(nèi)外的一些自動化電泳分析系統(tǒng)則多采用分辨率更高的瓊脂糖凝膠作為支持介質，采用高壓或常壓電泳進行各種同工酶及其亞型的分離與鑒定。第六十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日活性顯色經(jīng)電泳分離后的同工酶區(qū)帶需用酶反應染色法進行顯色。不能直接顯色者可加入工具酶經(jīng)偶聯(lián)反應顯色。如果產(chǎn)物（或經(jīng)偶聯(lián)反應后）能顯熒光者亦可用熒光法檢測。電泳法同工酶的顯色與一般蛋白質不同，需依賴其催化活性，因此，不能經(jīng)過固定步驟，呈色產(chǎn)物要求非水溶性。第六十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日常用的顯色系統(tǒng)重氮試劑染料：人工合成的萘酚或萘胺衍生物在酶促反應后產(chǎn)生的萘酚或萘胺與偶氮染料如固藍Ｂ等生成難溶于水的有色的重氮化合物。如ALP、GGT同工酶的測定。第六十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日常用的顯色系統(tǒng)電子傳遞染料：脫氫酶反應產(chǎn)生NAD（P）H，其中Ｈ+經(jīng)PMS傳遞Ｈ+，交給四氮唑鹽生成不溶性有色的甲臜化合物。如LDH同工酶的測定。第六十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日常用的顯色系統(tǒng)脫氫酶偶聯(lián)的指示反應：如AST、CK等第六十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日檢測結果顯色后的區(qū)帶一般用光密度計或熒光計掃描定量分析。第六十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日正常和病理狀況時血清LD同工酶的瓊脂糖凝膠電泳分離圖譜第六十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日注意事項用電泳法進行同工酶分析時，如顯示的區(qū)帶數(shù)與同工酶數(shù)不一致時，要特別注意巨分子酶的存在。第六十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日色譜法色譜法又稱層析法、色層法或層離法，是一種以物理化學原理為主的分離分析方法。常用于分離同工酶的色譜法是柱色譜，但方法費時繁瑣，通常不適合臨床同工酶常規(guī)檢測。目前國外已有供臨床同工酶分析用的商品化微型色譜柱。第六十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日免疫分析法可應用于同工酶檢測的免疫分析法有免疫抑制法、免疫沉淀法、免疫電泳法、放射免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法等，其中應用較多的是免疫抑制法、免疫沉淀法和免疫電泳法等。第六十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日免疫抑制法利用同工酶的一種亞基與相應的抗體結合后，該亞基的酶活性受到抑制，測定加與不加抗體前后樣品中酶活性的變化，可以計算出該亞基型同工酶的活性。臨床曾常規(guī)采用此法測定血清中CK-MB同工酶。足量的抗CK-MM的血清可將CK-MM完全抑制，CK-MB因有50%為M型亞基，也被抑制50%，而CK-BB（血清中無CK-BB或僅有痕量時）則不受影響，第七十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期日計算不加抗CK-MM血清時樣品的CK活性=CK-MM和CK-MB活性；加入抗CK-MM血清時樣品的CK活性=50%CK-MB的活性；加入抗CK-MM血清時樣品的CK活性2=CK-MB活性；所測CK-MM和CK-MB之總活性CK-MB活性=CK-MM活性。第七十一頁，共七十七頁，編輯于2023年