現(xiàn)代免疫學技術(shù)

現(xiàn)代免疫學技術(shù)第一頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日一、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)

免疫技術(shù)為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。其基本原理是先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相裁體上，并保持其免疫活性。測定時，將待檢標本和酶標抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。用洗滌的方法分離抗原抗體復合物和游離成分。然后加入酶的作用底物催化顯色，進行定性或定量測定。第二頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日酶聯(lián)免疫分析的基本原理和方法類型

ELISA可用于測定抗體，也可用于檢測抗原。根據(jù)檢測目的和操作步驟不向，有以下幾種類型的常用方法。

直接法間接法

雙抗體夾心法

竟爭法第三頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日間接法此法是測定抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標抗球蛋白抗體(酶標抗抗體)和底物進行測定。

第四頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日雙抗體夾心法此法常用于測定抗原。將已知抗體吸附于固相載體．加入待檢標本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌，加入酶標抗體和底物進行測定。

第五頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日竟爭法此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以測定抗原為例．將持異性抗體吸附于固相載體；加入待測抗原和一定量的酶標已知抗原，使二者競爭與固相抗體結(jié)合；經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標抗原與待測抗原含量呈負相關(guān)。

第六頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日ELlSA方法的技術(shù)要點

I與固相載體結(jié)合的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被(coating)，由于載體不同，包被的方法也不同。使用聚苯乙烯制品為載體一般多采用物理吸附法。除載體的理化性質(zhì)外，受緩沖液的離子強度、pH值、包被時的溫度和時間等多種因素的影響。用抗原或抗體包被后。固相載體表面往往尚殘留少量未飽和的吸附位點，產(chǎn)生非特異吸附，導致本底偏高。為此．常用1％—5％BSA，或含5％—20％小牛血清的PH9.6碳酸鹽緩沖液注滿凹孔，37℃作用1h，可以消除此種干擾。這一過程稱為封閉(blocking)。固相載體和免疫吸附劑的制備

第七頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日ELlSA方法的技術(shù)要點

II抗原和抗體用于制備酶標記物和包被固相載體的抗原要求純度高，抗原性完整；抗體需特異、效價高、親和力強，并具有較高的比活性。如將抗體IgG用木瓜蛋白酶水解為Fab片段，再與酶連接，可以減少非特異性吸附，檢測效果更佳。McAb的應(yīng)用，進一步提高ELISA法的特異性和靈敏度。使用針對抗原分子中不同決定簇的兩種McAb分別作為固相抗體和酶標抗體用于雙位點夾心法，簡化了操作程序。通常采用特異性較高的McAb作為固相包被抗體，與酶標記的多克隆抗體相結(jié)合進行檢測，結(jié)果更為滿意。

第八頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日在ELISA法中，用于標記抗體或抗原的酶與免疫酶組織化學技術(shù)基本上相同。但所用底物被酶裂解后，應(yīng)能生成可溶性有色產(chǎn)物，適合用分光光度計(酶標儀)測量光密度值，籍以定量測定樣品中待撿抗原或抗體的含量。ELlSA方法的技術(shù)要點

III常用的酶及其底物

辣根過氧化物酶 (HRP)

OPD,TMB堿性磷酸酶 (AP)

PNP半乳糖苷酶 (Gal)

NPG葡萄糖氧化酶 (GOP)

PAP第九頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日二、免疫印跡技術(shù)免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)，是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。將含有目標蛋白(抗原)的樣品首先用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)或非變性電泳(Native—PAGE)等分離后，通過轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面，然后將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進行特異性檢測。第十頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日Westernblotmethod第十一頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日Westernblotanalysis第十二頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日三、流式細胞術(shù)

流式細胞儀(Flowcytometer，F(xiàn)CM)能快速、精確地測量通過檢測區(qū)液流中的細胞、大分子、乳膠滴或其他粒子。流式細胞術(shù)是應(yīng)用一個激光和有關(guān)的光學檢測系統(tǒng)來收集這些信號以供分析。為免疫學、腫瘤學、細胞遺傳學、病理學、放射生物學、細胞生物學和生物醫(yī)學研究提供強而有力的手段。FCM主要可定量分析細胞表面和細胞內(nèi)抗原，以及對細胞分子水平的核酸含量的測量，預(yù)示各種病理狀態(tài)下細胞的生物行為。FCM是集現(xiàn)代電子物理技術(shù)、激光技術(shù)、電子計算機技術(shù)于一身的先進科學儀器，開創(chuàng)了熒光技術(shù)的又一個嶄新的領(lǐng)域。第十三頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日流式細胞儀的細胞分析原理：待測細胞被制成單細胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后加入樣品管中，在氣體壓力推動下進入流動室。流動室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的約束下，細胞排成單列出流動室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細胞液柱，進入流動室。被熒光染料染色的細胞受到強烈的激光照時后發(fā)出熒光，被熒光光電倍增管接收，實現(xiàn)了細胞的定量分析。再通過流束形成含有細胞的帶電液滴而實現(xiàn)了細胞的分選。第十四頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日流式細胞儀第十五頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日四、免疫微粒技術(shù)

免疫微粒技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作為載體，包被上具有特異性親和力的各種免疫活性物質(zhì)(抗原或抗體)，使其致敏為免疫微粒，用于免疫學及其他生物學檢測與分離的一項技術(shù)。第十六頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日作為載體的微粒通常是以某種高分子有機單體為原料經(jīng)過高分子聚合方法制備而成。由于制備材料及工藝不同，現(xiàn)已制成惰性微粒、活性微粒、磁性微粒及標記微粒等四大類微粒，數(shù)量多達幾十種。將制備好的微粒與抗原(或抗體)經(jīng)物理吸附、化學偶聯(lián)及生物素親合親橋聯(lián)法等方法形成免疫微粒，廣泛應(yīng)用于各種可溶性大分子物質(zhì)的檢測、分離與純化、細胞標記與識別等。近年來，微粒技術(shù)在核酸分子雜交、DNA與RNA的分離及PCR等研究領(lǐng)域亦顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

第十七頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日膠乳微粒免疫檢測技術(shù)

膠乳微粒免疫檢測技術(shù)是在膠乳凝集定性試驗基礎(chǔ)上發(fā)展建立的一種非放射性均相免疫測定法，可以對各種微量的抗原物質(zhì)和小分子半抗原進行精確的定量測定。根據(jù)特異性抗體致敏的膠乳微粒，與待測標本中的相應(yīng)抗原相遇時發(fā)生凝集反應(yīng)，膠乳凝集程度與被測物的濃度呈函數(shù)關(guān)系，由此可測出標本中待測物的含量。測定方法主要有粒子計數(shù)法和濁度法兩種。

第十八頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日免疫磁性微粒分離磁性微粒(MMS)是以金屬離子為核心，外層均勻地包裹高分子聚合體的固相微粒。在液相中，受外加磁場的吸引作用，MMS可快速沉降而自行分離，無需進行離心沉淀。經(jīng)過特異性抗體包被制成免疫MMS，與檢樣中的抗原結(jié)合形成免疫MMS—靶分子(或靶細胞)復合體，通過外加磁場的作用即可與其他成分分離開來。再以適當方式使復合體解離，在磁場吸引下除去游離的免疫MMS，即可獲得純化的靶分子或細胞。

第十九頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日基因工程α-2b干擾素的

免疫磁性分離系統(tǒng)的開發(fā)磁鐵免疫磁性微球α-2b干擾素雜蛋白細胞裂解液第二十頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日免疫微粒技術(shù)

收率>80%，純度>90%，生物學活性>108IU/mg第二十一頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日第二十二頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日五、免疫組織化學技術(shù)

免疫組織化學又稱免疫細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(zhì)。

免疫組化技術(shù)由免疫熒光技術(shù)逐漸發(fā)展建立起高度敏感，且更為實用的免疫酶技術(shù)。第二十三頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日免疫組織化學的全過程包括：抗原的提取與純化；免疫動物或細胞融合；制備特異性抗體以及抗體的純化；將顯色劑與抗體結(jié)合形成標記抗體；標本的制備；免疫細胞化學反應(yīng)以及呈色反應(yīng)；觀察結(jié)果。

第二十四頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日免疫熒光細胞化學技術(shù)

免疫熒光細胞化學技術(shù)是采用熒光素標記的已知抗體(或抗原)作為探針，對檢測待測組織、細胞標本中的靶抗原(或抗體)，進行定位、定性和定量的目的。第二十五頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日免疫酶細胞化學技術(shù)

免疫酶技術(shù)就是用酶標記已知抗體(或抗原)，然后與組織標本在一定條件下反應(yīng)，如果組織中含有相應(yīng)抗原(或抗體)，抗原抗體相互結(jié)合形成的復合物中所帶酶分子遇到底物時，能催化底物水解、產(chǎn)生顯色反應(yīng)，識別出標本抗原(抗體)分布的位置和性質(zhì)，通過圖像分析并可達到定量的目的。免疫熒光技術(shù)雖已廣泛應(yīng)用于免疫學的研究與診斷，為免疫病理研究開辟了一條新途徑。另外，酶顯色產(chǎn)物具有較高的電子密度，經(jīng)過適當處理還可以進行免疫電鏡觀察第二十六頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日抗體與靶抗原結(jié)合之后，形成的抗原抗體復合物在顯微鏡下是不可見的，如將抗體與某種顯色劑偶聯(lián)，抗原與抗體結(jié)合形成的復合物就由不可見而成為可見，從而可以確定組織中是否存在某種抗原。

第二十七頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日六、免疫電子顯微鏡技術(shù)

免疫電鏡技術(shù)(Immuneelectronmicroscopy，IEM)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結(jié)合，在亞細胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對抗原物質(zhì)進行定位分析的一種高度精確、靈敏的方法。特異性抗體用電子致密物質(zhì)，如鐵蛋白、膠體金等標記后，使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合，在電鏡下觀察到標記物所在位置，即為抗原抗體反應(yīng)的部位。

第二十八頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日鐵蛋白標記鐵蛋白是一種含鐵23％，分子量約750kDa，直徑為12—14nm的球形蛋白。其核心是由4個亞基組成的高電子密度氫氧化鐵膠態(tài)分子團，外層由24個蛋白質(zhì)亞單位組成近似球形的外殼。在電鏡下，鐵很容易和其他粒子相區(qū)別，顯像清晰。可通過雙功能交聯(lián)劑可與抗體、SPA等共價結(jié)合；用于免疫電鏡檢測的優(yōu)點是標記物呈顆粒狀，分辨率高。但其缺點是Fe的分子量太大，難以透過細胞膜和組織，只適用于細胞表面抗原定位；而且Fe染色標本只適合電鏡檢查，不能用普通光學顯微鏡觀察。第二十九頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日酶標記將酶標抗體用于免疫組化技術(shù)，以HRP標記抗體，通過H2O2／DAB底物系統(tǒng)被酶分解的呈色反應(yīng)，來顯示抗原抗體反應(yīng)部位。DAB分解產(chǎn)物為不溶性的棕色吩嗪衍生物，經(jīng)過OsO4處理后變黑，具有高電子密度，十分適合于電鏡觀察。而且HRP的分子量(40kDa)比鐵蛋白(750kDa)將近小20倍，酶標抗體較易透過經(jīng)適當處理后的組織細胞膜，能用于定位細胞內(nèi)抗原。但酶反應(yīng)產(chǎn)物的分辨率不如顆粒性標記物(鐵蛋白膠體金)高。

第三十頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日酶標記第三十一頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日膠體金標記膠體金是氯金酸(HAuCl4)的水溶膠顆粒，如同鐵蛋白一樣具有高電子密度，在電鏡比鐵蛋白顆粒更致密，易于辨認，定位比酶反應(yīng)物精確。膠體金容易和多種大分子物質(zhì)、包括抗體、A蛋白、凝集素等結(jié)合。根據(jù)制備方法不同，可以得到直徑在3—150nm之間的各種大小的膠體金顆粒；分別使用不同直徑的膠體金顆粒制備標記物，可以在同一標本片上顯示兩種或多種抗原物質(zhì)，即所謂雙標記或多標記。膠體金標記物還可代替鐵蛋白作為掃描免疫電鏡的標記物。因此，膠體金成為當前免疫電鏡工作者最感興趣的標記物。第三十二頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日膠體金標記第三十三頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日七、膠體金試紙條技術(shù)膠體金標記技術(shù)(Immunogoldlabelingtechnique)是以膠體金作為示蹤標記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標記技術(shù).膠體金是由氯金酸在還原劑等作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金。利用它在堿性環(huán)境中帶負電荷的性質(zhì)，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團相互吸引而形成牢固結(jié)合，除抗體蛋白外，膠體金還可與其他多種生物大分子結(jié)合。第三十四頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日膠體金標記試紙條第三十五頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日膠體金標記試紙條第三十六頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日八、免疫PCR技術(shù)(Immuno-PCR)

免疫PCR是一種抗原檢測系統(tǒng)，將一段已知序列的DNA片段標記到抗原抗體復合物上，再用PCR方法將這段DNA擴增，然后用常規(guī)方法檢測PCR產(chǎn)物。免疫PCR集PCR的高靈敏度與抗體和抗原反應(yīng)的特異性于一體。其突出的特點是指數(shù)級的擴增效率帶來了極高的敏感度，能檢出濃度低至2ng/Ｌ的抗原物質(zhì)，為現(xiàn)行任何一種免疫定量方法所不及。第三十七頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日免疫PCR體系的組成免疫PCR體系由待檢抗原,特異性抗體,連接分子，DNA和PCR擴增系統(tǒng)。待檢的抗原可以直接吸附于固相(包被抗原)，這一過程與ELISA試驗是相同的。免疫PCR中的特異性是對應(yīng)于待測抗原，與ELISA一樣，抗體的特異性和親和力將影響免疫PCR的特異性和敏感性。一般均選用單克隆抗體，這個抗體常采用生物素標記，通過親和或葉綠素再結(jié)合DNA。第三十八頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日特異抗體與DNA之間的連接連接分子

連接分子是連接特異抗體與DNA之間的分子。Sano等用鏈親和素/蛋白Ａ(striptavidin-proteinA)基因工程融合體作為連接分子來連接生物素標記的DNA與抗體，此種融合蛋白的鏈親和素部分可識別DNA上的生物素，蛋白部分可識別抗體的Fc段。

第三十九頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日DNA和PCR系統(tǒng)免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶將結(jié)合于固相上的DNA特異放大，由此定量檢測抗原。免疫PCR的敏感性多于ELISA主要是應(yīng)用了PCR強大的擴增能力。免疫PCR中的DNA分子可以選擇任何DNA，但要保證DNA的純度，且有較好的均質(zhì)性，盡可能不選用受檢樣品中可能存在的DNA。DNA的生物素化是用生物素標記的dATP或dUTP通過聚合酶標記在DNA分子上，一般是1個分子DNA標記2個生物素，標記率可達百分之百。免疫PCR的PCR擴增系統(tǒng)與一般PCR一樣,主要包括引物、緩沖液和耐熱DNA聚合酶。

第四十頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期日免疫PCR產(chǎn)物的檢測