植物細(xì)胞培養(yǎng)及次生物質(zhì)生產(chǎn)

植物細(xì)胞培養(yǎng)及次生物質(zhì)生產(chǎn)第一頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)類(lèi)型根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模：小規(guī)模和大批量培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)方式：懸浮、平板、看護(hù)培養(yǎng)根據(jù)要求產(chǎn)物：用于誘變和生產(chǎn)次生(級(jí))產(chǎn)物(Secondaryproducts)的細(xì)胞培養(yǎng)第二頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日懸浮培養(yǎng)

單細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)

培養(yǎng)細(xì)胞的次級(jí)代謝及產(chǎn)物積累

第三頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日懸浮培養(yǎng)（Suspensionculture）懸浮培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。特點(diǎn)

1.培養(yǎng)細(xì)胞可不斷增殖，且生長(zhǎng)速度快。

2.液體狀態(tài)下便于細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和交換，細(xì)胞狀態(tài)可以相對(duì)保持一致。第四頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用SuspensioncellsPlantsArtificialseedsIsolationprotoplastsMutationselectSecondaryproducts第五頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的建立愈傷組織的誘導(dǎo)懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)懸浮細(xì)胞同步化第六頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日愈傷組織的誘導(dǎo)選擇適宜的外植體：幼胚下胚軸子葉選擇適宜的培養(yǎng)基：MS，B5，N6較高激素濃度必要的附加物質(zhì)第七頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日要求：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎適宜懸浮培養(yǎng)適宜再生植株第八頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日懸浮系的建立與培養(yǎng)callus150~250mlflaskcentrifugeisolationsubculture1g/10mlmedium100~120rmpculturetransfer1time/3d80rpm第九頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日第十頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系特征懸浮培養(yǎng)分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30～50個(gè)細(xì)胞以下。均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量一般2～3天便可增加一倍。第十一頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日第十二頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日第十三頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)第十四頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的衡量根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞數(shù)變化，或細(xì)胞質(zhì)量變化。生長(zhǎng)速率(p)：不同時(shí)間細(xì)胞密度(x)的自然對(duì)數(shù)與起始密度(x0)的自然對(duì)數(shù)之差與培養(yǎng)時(shí)間(t)的比值

p＝(lnx-lnx0)/t鮮重：真空減壓過(guò)濾后稱(chēng)重，反應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況干重：鮮細(xì)胞烘干至衡重，反應(yīng)細(xì)胞質(zhì)量第十五頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日影響懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的因素起始愈傷組織的質(zhì)量接種細(xì)胞密度：懸浮細(xì)胞的起始密度一般在0.5~2.5×105個(gè)細(xì)胞/毫升。接種初期的細(xì)胞密度過(guò)低往往使延遲期加長(zhǎng)。最低有效密度：即能使細(xì)胞分裂、增殖的最低接種量。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基、方式、溫度、繼代周期。第十六頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日影響懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的因素培養(yǎng)基應(yīng)用條件培養(yǎng)基（生長(zhǎng)過(guò)愈傷組織或懸浮細(xì)胞的液體培養(yǎng)基）提供單細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂所需的特殊代謝物?；九囵B(yǎng)基成分的調(diào)節(jié)視不同的培養(yǎng)目的而定培養(yǎng)基設(shè)計(jì)時(shí)，一般均以誘導(dǎo)愈傷組織形成的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行調(diào)整。常用的培養(yǎng)基有MS、B5、LS、N6等。植物激素和其他附加成分的應(yīng)用。第十七頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日影響懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的因素培養(yǎng)方式：搖瓶，反應(yīng)器（氣動(dòng)式、攪拌式）；分批培養(yǎng)，半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)溫度25℃繼代周期指具有一定起始密度的細(xì)胞，從開(kāi)始培養(yǎng)到細(xì)胞數(shù)目和總重量增長(zhǎng)停止的一個(gè)過(guò)程。培養(yǎng)周期的長(zhǎng)短是由起始細(xì)胞密度、延遲期的長(zhǎng)短、生長(zhǎng)速率等決定。繼代培養(yǎng)（Subculture）：繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁殖培養(yǎng)過(guò)程。第十八頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的同步化細(xì)胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過(guò)細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中容易團(tuán)聚并進(jìn)入不同程度的分化狀態(tài)，因此，要達(dá)到完全同步化是十分困難的。同一培養(yǎng)體系的植物細(xì)胞經(jīng)常不能處于同一細(xì)胞周期，這種差異使懸浮細(xì)胞分裂、代謝以及生理生化狀態(tài)等復(fù)雜化。通過(guò)一定的理化措施可以使同一體系中的細(xì)胞達(dá)到相對(duì)同步化。什么措施？第十九頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日細(xì)胞周期第二十頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日饑餓法饑餓導(dǎo)致的細(xì)胞分裂受阻常常是使細(xì)胞不能合成DNA，即不能進(jìn)入S期，或細(xì)胞分裂不能進(jìn)行，即不能進(jìn)入M期。因此，通過(guò)饑餓法可以獲得處于G1和G2期的同步化細(xì)胞。氮饑餓時(shí)，通常獲得G1期的同步化細(xì)胞磷和碳饑餓時(shí)，獲得G1和G2期的同步化細(xì)胞。將饑餓細(xì)胞轉(zhuǎn)入完整培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞分裂又可重新恢復(fù)。第二十一頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日抑制劑法通過(guò)一些DNA合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞滯留在DNA合成前期，當(dāng)解除抑制后，即可獲得處于同一細(xì)胞周期(G1)的同步化細(xì)胞。常用抑制劑主要有5-氟脫氧尿苷(FudR)和羥基尿(HU)。用羥基尿處理獲得同步化細(xì)胞的方法在小麥、玉米、西芹等植物細(xì)胞培養(yǎng)中已有成功應(yīng)用。利用破壞微管的藥物將細(xì)胞阻斷在中期，常用的藥物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性較小。第二十二頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日分選法依據(jù)：細(xì)胞體積大小方法常規(guī)分選方法是梯度離心精細(xì)的分選可采用流式細(xì)胞儀優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)單分選細(xì)胞維持了自然生長(zhǎng)狀態(tài)，不會(huì)有其它處理帶來(lái)的副作用缺點(diǎn)分選精細(xì)度較差第二十三頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化的程度Okamura等曾采用此方法使胡蘿卜懸浮細(xì)胞較好地同步化。梅興國(guó)等（2001）采用6℃低溫處理紅豆杉細(xì)胞也獲得較明顯同步化效果?？赡艿脑虿煌臏囟葘?duì)細(xì)胞的有絲分裂有極明顯的影響，在一定范圍內(nèi)，溫度下降使細(xì)胞分裂速度減慢，細(xì)胞周期延長(zhǎng)，從而相應(yīng)地延長(zhǎng)了分裂期的時(shí)間，使分裂指數(shù)提高，細(xì)胞同步化率升高。第二十四頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日單細(xì)胞培養(yǎng)意義分離方法培養(yǎng)方法第二十五頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日植物單細(xì)胞培養(yǎng)的意義建立單細(xì)胞無(wú)性系，有助于研究植物細(xì)胞的特性和潛力，了解細(xì)胞間的相互關(guān)系，研究細(xì)胞分化、發(fā)育和形態(tài)發(fā)生的分子機(jī)理。采用生物化學(xué)的方法，對(duì)培養(yǎng)的單細(xì)胞進(jìn)行人工誘發(fā)突變，或建立遺傳轉(zhuǎn)化受體。在細(xì)胞水平上對(duì)花粉進(jìn)行培養(yǎng)，可排除體細(xì)胞干擾。利用生物反應(yīng)器可大規(guī)模地培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。第二十六頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日單細(xì)胞分離方法機(jī)械法具體做法：將葉片輕輕研碎、過(guò)濾離心、收集凈化從未分化的疏松易碎的愈傷組織，通過(guò)搖床振蕩獲得分散的單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞不受酶?jìng)?；有利于進(jìn)行細(xì)胞的生理和生化研究。第二十七頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日單細(xì)胞分離方法酶解法酶對(duì)細(xì)胞壁有一定的軟化作用，所以采用酶法時(shí)，必須加入甘露醇等滲透壓保護(hù)劑；可通過(guò)加入硫酸葡聚糖鉀來(lái)提高游離細(xì)胞的產(chǎn)量。(纖維素酶，果膠酶)優(yōu)點(diǎn)可獲得較多的葉肉游離細(xì)胞（但對(duì)禾本科植物葉片效果不好）。第二十八頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日細(xì)胞懸浮過(guò)濾與培養(yǎng)基混合植板培養(yǎng)克隆愈傷組織第二十九頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日細(xì)胞平板培養(yǎng)(platingculture)指將一定密度的懸浮細(xì)胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。Bergman(1960)首創(chuàng)單細(xì)胞的分離：一般采用酶分離法，小細(xì)胞團(tuán)不能超過(guò)6個(gè)細(xì)胞。單細(xì)胞懸浮液的制備：分離的單細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2次以后，調(diào)整密度為5×103個(gè)/毫升植板：將1份已調(diào)整好密度的單細(xì)胞懸浮液與4份35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中，其厚度為5mm左右。第三十頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日細(xì)胞平板培養(yǎng)（platingculture)平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來(lái)衡量。植板率是能長(zhǎng)出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞總和中所占的比例。每個(gè)平板形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)植板率＝每個(gè)平板接種的細(xì)胞總數(shù)第三十一頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日細(xì)胞平板培養(yǎng)(platingculture)優(yōu)點(diǎn)：?jiǎn)渭?xì)胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定點(diǎn)觀察，是單細(xì)胞株篩選和突變體篩選的常用方法。由于它具有篩選效率高、篩選量大、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分裂、分化、生理生化、遺傳變異、次生代謝產(chǎn)物合成等。缺點(diǎn)：通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造成毒害或影響組織吸收。第三十二頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日第三十三頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日看護(hù)培養(yǎng)（nurseculture）Muir(1953)首創(chuàng)此法獲得煙草單細(xì)胞體系。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便易行，效果好。缺點(diǎn)：不能在顯微鏡下追蹤細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)過(guò)程。第三十四頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日第三十五頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日微室培養(yǎng)(microchamberculture)在人工制造的無(wú)菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法。由Jones等在1960年設(shè)計(jì)的。優(yōu)點(diǎn)：可對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行顯微觀察，了解一個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、分化等過(guò)程缺點(diǎn)：培養(yǎng)基少，營(yíng)養(yǎng)和水分難以保持，pH變動(dòng)幅度大，培養(yǎng)細(xì)胞僅能短期分裂。細(xì)胞起始密度：30～80個(gè)/室。第三十六頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日雙層濾紙植板培養(yǎng)Horsch等（1980）建立培養(yǎng)皿培養(yǎng)基飼養(yǎng)細(xì)胞層培養(yǎng)細(xì)胞

看護(hù)濾紙轉(zhuǎn)移濾紙第三十七頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)意義規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立生物反應(yīng)器規(guī)模化培養(yǎng)的技術(shù)問(wèn)題第三十八頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日意義應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)合成有用的天然產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。目前有約25％的法定藥品來(lái)自植物，其有效成分均為次生產(chǎn)物。許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來(lái)源，可用于殺蟲(chóng)、殺菌，而對(duì)環(huán)境和人畜無(wú)害，是理想的環(huán)保產(chǎn)品第三十九頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日部分代表性植物次生產(chǎn)物及其植物資源工業(yè)用途次生產(chǎn)物植物資源醫(yī)藥可待因罌粟薯蕷皂苷配基三角葉薯蕷奎寧金雞納樹(shù)地高辛狹葉毛地黃莨菪胺曼陀羅長(zhǎng)春花堿長(zhǎng)春花農(nóng)業(yè)化學(xué)除蟲(chóng)菊酯除蟲(chóng)菊食品，飲料留蘭香薄荷化妝品茉莉油茉莉花第四十頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求 從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)適宜于植物生長(zhǎng)和生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。從培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿(mǎn)足以下三個(gè)條件：培養(yǎng)的細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，短時(shí)間內(nèi)能生產(chǎn)較多產(chǎn)物產(chǎn)物不被迅速降解，最好能分泌到培養(yǎng)基中第四十一頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立種子細(xì)胞選擇外植體高產(chǎn)細(xì)胞種子細(xì)胞增殖與放大培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)體系建立第四十二頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日種子細(xì)胞選擇外植體選擇植物類(lèi)型：遺傳基礎(chǔ)。在確定生產(chǎn)某一種化合物以后，首先必須準(zhǔn)確選擇那些能夠產(chǎn)生目的化合物的植物種類(lèi)及品種或單株。組織器官：由于天然產(chǎn)物一般為次生代謝產(chǎn)物，而植物次生代謝產(chǎn)物的積累具有組織器官的特異性，因此，在起始細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的器官、組織作為外植體。第四十三頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日種子細(xì)胞選擇高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選懸浮細(xì)胞系單細(xì)胞克隆種細(xì)胞增殖第四十四頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日種子細(xì)胞選擇直選法李志勇等（2002）直接從起始細(xì)胞中挑選不同細(xì)胞團(tuán)建立了10個(gè)大蒜細(xì)胞懸浮系，比較研究顯示，不同懸浮細(xì)胞系的SOD合成能力最大差異可達(dá)5倍。適當(dāng)增加選擇壓力，采用一些誘變的方法梅興國(guó)（2001）通過(guò)在培養(yǎng)基中添加1.6mM的L-Phe，篩選出了抗Phe的紅豆杉細(xì)胞懸浮系，其紫杉醇含量高于原型細(xì)胞3～5倍。第四十五頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日種子細(xì)胞增殖與放大培養(yǎng)目的準(zhǔn)備材料提供技術(shù)參數(shù)過(guò)程搖瓶反應(yīng)器第四十六頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立培養(yǎng)方式成批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)方式的選擇根據(jù)次生產(chǎn)物積累而定，通常還根據(jù)不同要求進(jìn)行改進(jìn)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成需要不同的培養(yǎng)基時(shí)，就需要采用兩步法培養(yǎng)，先在細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)大批量細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至合成產(chǎn)物的階段后，將其轉(zhuǎn)至產(chǎn)物合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在產(chǎn)物合成階段又可采用連續(xù)培養(yǎng)方式以延長(zhǎng)細(xì)胞生產(chǎn)時(shí)間。第四十七頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日生物反應(yīng)器類(lèi)型及特點(diǎn)是指用于高等生物細(xì)胞批量化培養(yǎng)的裝置及其相應(yīng)控制系統(tǒng)。適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)該具有適宜的氧傳遞、良好的流動(dòng)性和較低的剪切力。攪拌式氣動(dòng)式固定化式其它—光照生物反應(yīng)器，轉(zhuǎn)鼓式第四十八頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日反應(yīng)器類(lèi)型體積（L）培養(yǎng)植物種類(lèi)攪拌式7，15D.carota胡蘿卜攪拌式20，15500N.tabacum煙草攪拌式5000C.roseus長(zhǎng)春花螺旋攪拌式20C.blumei五彩蘇提升攪拌式2.5P.elliotii濕地松鼓泡式20，30，130P.ginseng人參鼓泡式65，1500N.tabacum煙草外環(huán)氣升式10，30，85C.roseus長(zhǎng)春花導(dǎo)筒氣升式20，210D.lanata狹葉毛地黃轉(zhuǎn)鼓式1－4V.rosea長(zhǎng)春花植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器第四十九頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日攪拌式反應(yīng)器第五十頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日氣動(dòng)式反應(yīng)器又稱(chēng)空氣提升式反應(yīng)器特點(diǎn)：剪切力小，但攪拌不很均勻。

Flash第五十一頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日固定化反應(yīng)器種類(lèi)：包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽和聚丙烯酰胺等附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫和中空纖維等。Alfermann等(1983)用氣升式系統(tǒng)，采用海藻鈣固定細(xì)胞成功地用30L和200L的反應(yīng)器生產(chǎn)地高辛。Jose等(1983)進(jìn)一步用中空纖維反應(yīng)器培養(yǎng)胡蘿卜和碧?hào)|茄生產(chǎn)代謝產(chǎn)物酚類(lèi)物質(zhì)Flash第五十二頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問(wèn)題懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)必須適應(yīng)植物細(xì)胞特性細(xì)胞體積大。其平均直徑比細(xì)菌大幾十倍通常以2～200個(gè)細(xì)胞，直徑2mm大小的非均勻小細(xì)胞團(tuán)形式存在?？辜羟心芰θ?。生長(zhǎng)速度慢，周期長(zhǎng)，培養(yǎng)基成分復(fù)雜，有利于微生物生長(zhǎng)，因此在培養(yǎng)中維持無(wú)菌環(huán)境難度較大但又十分重要。第五十三頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問(wèn)題培養(yǎng)液的流變特性－－粘度變化原因：細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)的變化細(xì)胞密度：當(dāng)?shù)陀?g/L時(shí)(煙草細(xì)胞)，培養(yǎng)液粘度基本不變，而高于此值時(shí)，粘度增加。細(xì)胞狀態(tài)：培養(yǎng)密度在10g/L時(shí)，大細(xì)胞團(tuán)(長(zhǎng)春花細(xì)胞)的營(yíng)養(yǎng)液表觀粘度明顯大于小細(xì)胞團(tuán)的表觀粘度。第五十四頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問(wèn)題氧氣含量調(diào)節(jié)KLa（氧的傳遞系數(shù)，Nv=Kla(C*-C)

）： 如在4L的氣升式反應(yīng)器中進(jìn)行長(zhǎng)春花細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，KLa在20h-1左右時(shí)。細(xì)胞生長(zhǎng)與次生產(chǎn)物合成維持在良好狀態(tài)； 在15L通風(fēng)式反應(yīng)器中培養(yǎng)的煙草細(xì)胞，當(dāng)KLa在5~10h-1的范圍內(nèi)，生物量和代謝產(chǎn)物隨KLa增加而增加。溶氧濃度：毛地黃細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基氧濃度從10％飽和度上升至30％，細(xì)胞生長(zhǎng)速率從0.15d-1上升至0.20d-1，如果繼續(xù)上升至40％，細(xì)胞生長(zhǎng)速率反而下降至0.17d-1。第五十五頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日規(guī)模化培養(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問(wèn)題CO2調(diào)節(jié)在通氣過(guò)程中，混入2％～4％的CO2能消除高通氣速率對(duì)長(zhǎng)春花細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物合成的不利影響。第五十六頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問(wèn)題泡沫和表面黏附性植物細(xì)胞培養(yǎng)中易產(chǎn)生泡沫，且覆蓋蛋白質(zhì)和粘多糖，細(xì)胞極易被包埋在其中從循環(huán)的培養(yǎng)液中帶出來(lái)，形成非均相培養(yǎng)而影響培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和生產(chǎn)率。消除方法化學(xué)消泡：天然油脂、高級(jí)醇類(lèi)、聚醚類(lèi)機(jī)械消泡第五十七頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日規(guī)模化培養(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問(wèn)題剪切力對(duì)植物細(xì)胞的影響適當(dāng)?shù)募羟辛梢栽黾优囵B(yǎng)系統(tǒng)的通氣性保持良好的混合狀態(tài)和分散性提高細(xì)胞生物量和次生產(chǎn)物量過(guò)高的剪切力導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)變小、細(xì)胞破損來(lái)源攪拌槳形式、攪拌速度、通氣速率第五十八頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日培養(yǎng)細(xì)胞的次生代謝及產(chǎn)物積累植物次生代謝（secondarymetabolism）1891年由Kossel提出，非細(xì)胞生命活動(dòng)所必需。植物次生代謝產(chǎn)物(secondarymetabolites)

的類(lèi)型培養(yǎng)下的植物細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物積累特性提高細(xì)胞次生產(chǎn)物量的途徑第五十九頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日植物次生產(chǎn)物的主要類(lèi)型酚類(lèi)化合物－黃酮類(lèi)、醌類(lèi)和簡(jiǎn)單酚類(lèi)黃酮類(lèi)： 結(jié)構(gòu)：C6-C3-C6

生物合成前體：苯丙氨酸和丙二酸單酰輔酶A。 功效：為治理心血管疾病和高血壓的藥物成分。醌類(lèi)化合物： 結(jié)構(gòu)：由苯式多環(huán)芳烴衍生的芳香二氧化合物， 種類(lèi)：苯醌、萘醌。 功效：呈現(xiàn)顏色，具有抗菌、抗癌作用。第六十頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日萜類(lèi)化合物組成單元：異戊二烯合成途徑：異戊二烯途徑種類(lèi)：?jiǎn)屋?、倍半萜、二萜、三萜以及甾?lèi)化合物。萜類(lèi)化合物已超過(guò)2萬(wàn)種。單萜和倍半萜是植物揮發(fā)油和香料的主要成分，有的具有重要的藥用價(jià)值。倍半萜：抗瘧疾藥物青蒿素。二萜生物堿：抗癌藥物紫杉醇。三萜皂甙：人參皂甙。甾體皂甙：薯蕷皂甙。第六十一頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日含氮化合物包括：生物堿、胺類(lèi)、非蛋白質(zhì)氨基酸和生氰苷種類(lèi)：5500種以上分布：雙子葉植物生物堿的作用：藥用，植物抗毒素。目前對(duì)生物合成途徑研究比較清楚的有：煙草的煙堿(nicotine)、毒藜?jí)A(anabasine)和吡咯生物堿

(pyrrolizidinealkaloid)，毛茛科植物的小檗堿(berberine)，曼陀羅屬植物的莨菪堿(tropine)和東莨菪堿(scopolamine)。第六十二頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日培養(yǎng)條件下植物細(xì)胞次生產(chǎn)物積累的特性生長(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)成正比，如長(zhǎng)春花中長(zhǎng)春花堿的合成、煙草細(xì)胞煙堿合成、薯蕷中薯蕷皂甙的合成。中間型產(chǎn)物僅在細(xì)胞生長(zhǎng)下降時(shí)合成，細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期或停止生長(zhǎng)產(chǎn)物都不合成，蒽醌類(lèi)物質(zhì)合成的植物細(xì)胞、莨菪烷類(lèi)合成的植物細(xì)胞等屬于此類(lèi)型。非生長(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)物合成在細(xì)胞生長(zhǎng)停止以后。如紫草寧。第六十三頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑選擇適宜的起始材料－－種類(lèi)、部位梔子（Gardeniajasminoides）胚軸銀杏 子葉當(dāng)歸 根紅豆杉幼嫩的莖茜草葉柄培養(yǎng)基既要滿(mǎn)足植物細(xì)胞的生物量增長(zhǎng)，還要滿(mǎn)足細(xì)胞合成及積累次生產(chǎn)物的需要。第六十四頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑前體（precursor）的應(yīng)用作用：提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量。選擇對(duì)某一目的產(chǎn)物來(lái)講可能有多種前體物質(zhì)同一種前體物質(zhì)又可能有多條代謝路徑從而形成不同的代謝產(chǎn)物。針對(duì)其合成的關(guān)鍵生化過(guò)程進(jìn)行前體物質(zhì)添加。多數(shù)前體物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)本身并不十分有力注意前體濃度。過(guò)量也可能產(chǎn)生反饋抑制。第六十五頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日人參皂甙的生物合成途徑乙酰輔酶A

甲羥戊酸（MVA）反式角鯊烯（C30）

2,3-氧化鯊烯環(huán)阿屯醇達(dá)瑪烯二醇香樹(shù)素植物甾醇人參皂甙Rg1人參皂甙Ro第六十六頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑激發(fā)子（elicitor）的應(yīng)用也稱(chēng)誘導(dǎo)子，是指能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞中某些反應(yīng)，并形成細(xì)胞特征性自身反應(yīng)的分子。非生物激發(fā)子，如輻射、金屬離子、茉莉酸類(lèi)似物（茉莉酸甲酯，M-JA）等。生物激發(fā)子外源激發(fā)子：菌絲、微生物機(jī)體提取物及微生物產(chǎn)生的多糖、蛋白和脂肪酸等內(nèi)源性激發(fā)子：來(lái)源于植物結(jié)構(gòu)的化合物。如降解細(xì)胞壁的酶、細(xì)胞壁碎片、寡聚糖等有機(jī)分子。第六十七頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑激發(fā)子促進(jìn)次生產(chǎn)物積累與其種類(lèi)和濃度有關(guān)激發(fā)子對(duì)南方紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)合成紫杉醇的影響激發(fā)子適宜濃度（mM）與對(duì)照比提高產(chǎn)物效率（倍）M-JA0.17.0花生四烯酸0.16.5硝酸柿胺1.05.5水楊酸0.14.5硝酸鹽0.013.0第六十八頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日M-JAMg/L0.00.110.01.0第六十九頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑培養(yǎng)技術(shù)的選擇包括反應(yīng)器的選擇和培養(yǎng)方式的選擇培養(yǎng)技術(shù)的選擇不僅要考慮細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累的效率，同時(shí)還應(yīng)考慮技術(shù)基礎(chǔ)和生產(chǎn)成本。第七十頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑兩相培養(yǎng)(two—phaseculture)指在植物細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機(jī)化合物，或者是具有吸附作用的多聚化合物，使培養(yǎng)體系由于分配系數(shù)不同而形成上、下兩相，細(xì)胞在其中一相中生長(zhǎng)并合成次生代謝物，這些次生代謝物又通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞结尫诺桨猓⒈涣硪幌嗨健５谄呤豁?yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日兩相培養(yǎng)組成：培養(yǎng)相和提取相組成類(lèi)型：液-液系統(tǒng)和液-固系統(tǒng)液-液系統(tǒng)：分離相主要使用液體石蠟、烷類(lèi)化合物。分離相和培養(yǎng)基的化學(xué)性質(zhì)和比重不同。液-固系統(tǒng)：是指提取相以固態(tài)形式存在于系統(tǒng)中，主要通過(guò)吸附分離目的產(chǎn)物，目前使用的主要有活性炭、硅酸鎂載體、沸石、蠶絲以及樹(shù)脂。第七十二頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日紅豆杉細(xì)胞兩相培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇實(shí)驗(yàn)材料：東北紅豆杉細(xì)胞系培養(yǎng)基：第一相：B5培養(yǎng)基，第二相：5％(v/v)的松油醇，產(chǎn)物釋放劑：5％(v/v)二甲基亞砜。接種量:10g(鮮重)/100ml培養(yǎng)基/250mL三角燒瓶。培養(yǎng)條件：25℃，120rpm，黑暗培養(yǎng)。第七十三頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日■細(xì)胞干重；▲紫杉醇產(chǎn)量；兩相系統(tǒng)——；單相系統(tǒng)－－

第二相的加入，使得紫杉醇產(chǎn)量提高到30.19mg/L，比對(duì)照增加103%；63％的紫杉醇從胞內(nèi)的釋放出來(lái)，其中有75％轉(zhuǎn)移至有機(jī)相。第七十四頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑兩步培養(yǎng)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞在生產(chǎn)培養(yǎng)基中積累產(chǎn)物第七十五頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日提高細(xì)胞次生產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑器官組織在反應(yīng)器中的培養(yǎng)技術(shù)發(fā)狀根（毛狀根，hairyroot）培養(yǎng)生產(chǎn)次生產(chǎn)物，已在人參、丹參、紫草、顛茄和黃芪等植物中進(jìn)行了探索性研究，并取得良好進(jìn)展。冠癭組織培養(yǎng)用于次生產(chǎn)物的生產(chǎn)。第七十六頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日第七十七頁(yè)，共八十七頁(yè)，編輯于2023年，星期日毛狀根毛狀根(hairyroots)是發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacteriumrhizogenes）感染雙子葉植物后，其Ri質(zhì)粒上的T-DNA片斷整合進(jìn)植物細(xì)胞核基因組中誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特殊表現(xiàn)型。毛狀根可以不依賴(lài)激素快速生長(zhǎng)，根多叢生，多分枝，多根毛，無(wú)向地性。