檢驗(yàn)技術(shù)離心機(jī)

檢驗(yàn)技術(shù)離心機(jī)第一頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日2經(jīng)典的分離分析技術(shù)：離心技術(shù)、電泳技術(shù)、光譜技術(shù)、色譜技術(shù)第二頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日3

離心現(xiàn)象是指物體在離心力場(chǎng)中表現(xiàn)的沉降運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象。應(yīng)用離心沉降進(jìn)行物質(zhì)的分析和分離的技術(shù)稱(chēng)為離心技術(shù)（centrifugaltechnique）,實(shí)現(xiàn)離心技術(shù)的儀器是離心機(jī)（centrifuge）。前言概念:第三頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日4離心技術(shù)的應(yīng)用:主要用于各種生物樣品的分離、純化和制備低速離心機(jī)主要用于細(xì)胞、細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)菌的沉淀和收集；高速離心機(jī)多用于制備和收集微生物、細(xì)胞碎片、大的細(xì)胞器、硫酸銨沉淀物以及免疫沉淀物等；超速離心機(jī)已成為分離、提純、鑒定、分析線粒體、微粒體、染色體、溶酶體、質(zhì)粒、病毒、大分子核酸和高分子蛋白質(zhì)第四頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日5第五頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日6第一節(jié)離心技術(shù)原理第二節(jié)離心機(jī)結(jié)構(gòu)第三節(jié)離心方法第四節(jié)高、超速離心技術(shù)

主要內(nèi)容第六頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日7教學(xué)基本要求1.掌握離心技術(shù)的基礎(chǔ)原理，常用的離心方法.2.熟悉離心機(jī)的分類(lèi)與結(jié)構(gòu)，各種離心機(jī)的臨床應(yīng)用3.了解離心機(jī)的維護(hù)、離心方法的進(jìn)展第七頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日8

一、離心力

二、相對(duì)離心力

三、沉降系數(shù)

四、沉降速度第一節(jié)離心技術(shù)原理第八頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日9重力時(shí)間當(dāng)懸浮液靜置不動(dòng)時(shí)，由于重力場(chǎng)的作用可使得其中懸浮的顆粒逐漸下沉，下沉的速度與微粒的大小、形態(tài)、密度、重力場(chǎng)的強(qiáng)度及液體的黏度有關(guān)。如紅細(xì)胞顆粒，直徑為數(shù)微米，可以在通常重力作用下觀察到它們的沉降過(guò)程。此外，物質(zhì)在介質(zhì)中沉降時(shí)還伴隨有擴(kuò)散現(xiàn)象。重力沉降：混合液靜置一段時(shí)間后第九頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日10擴(kuò)散現(xiàn)象

擴(kuò)散是由于微粒的熱運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的質(zhì)量遷移現(xiàn)象,主要是由于密度差引起的。對(duì)小于幾微米的微粒如病毒或蛋白質(zhì)等，它們?cè)谌芤褐谐赡z體或半膠體狀態(tài)，僅僅利用重力是不可能觀察到沉降過(guò)程的，因?yàn)轭w粒越小，與溶液密度越相近，擴(kuò)散現(xiàn)象則越嚴(yán)重，而沉降越慢。

擴(kuò)散現(xiàn)象是不利于樣品分離的，如果加大重力，就可能克服擴(kuò)散現(xiàn)象的不利影響,實(shí)現(xiàn)生物大分子的分離。

第十頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日11離心沉降：在離心機(jī)中，離心管（centrifugetube）放于離心轉(zhuǎn)頭里，當(dāng)離心機(jī)開(kāi)動(dòng)時(shí)，離心管繞離心轉(zhuǎn)頭的軸旋轉(zhuǎn)，作圓周運(yùn)動(dòng)，在離心管內(nèi)的樣品顆粒將同樣運(yùn)動(dòng)。第十一頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日12

假如顆粒處于真空中，顆粒會(huì)沿切線方向飛去,也就是當(dāng)離心管由圖中的0位轉(zhuǎn)到1位時(shí)，顆粒到達(dá)離心管底部A位。對(duì)于離心管而言，樣品顆粒由頂位移到了A位，也就是由離心管頂部移到了底部，這與重力場(chǎng)中的由高處落到低處相似。這種顆粒在圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)的切線運(yùn)動(dòng)稱(chēng)為離心沉降.

實(shí)際上顆粒是在介質(zhì)中運(yùn)動(dòng)的，顆粒作切線運(yùn)動(dòng)時(shí)將由于介質(zhì)的摩擦阻力，使其在離心管中依圖中虛線所示的曲線運(yùn)動(dòng)，當(dāng)離心管由0位轉(zhuǎn)到2位時(shí)，顆粒由頂位移到B位。介質(zhì)的阻力越大，顆粒的沉降速度越小、沉降的距離也越短。旋轉(zhuǎn)速度越大，顆粒的沉降越快。第十二頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日13在離心力場(chǎng)中加速度達(dá)到數(shù)萬(wàn)甚至數(shù)十萬(wàn)倍重力加速度時(shí)，顆粒的沉降也加快了同樣的倍數(shù)。這就使得許多在重力場(chǎng)中不能沉降的細(xì)小顆粒及密度較低的物體組份能用離心技術(shù)進(jìn)行分離純化。5ml血液離心5分鐘血漿血細(xì)胞第十三頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日14離心機(jī)工作原理:懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細(xì)胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而使溶液得以分離、濃縮和提純，顆粒的沉降速度取決于離心機(jī)的轉(zhuǎn)速、物質(zhì)的沉降系數(shù)、顆粒的質(zhì)量、大小和密度。血漿試管離心沉降物血液第十四頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日15一、離心力當(dāng)物體所受外力小于運(yùn)動(dòng)所需要的向心力時(shí)，物體將向遠(yuǎn)離圓心的方向運(yùn)動(dòng)。物體遠(yuǎn)離圓心運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象稱(chēng)為離心現(xiàn)象。也叫離心運(yùn)動(dòng)。離心運(yùn)動(dòng)是由于向心力消失或不足而造成的。旋轉(zhuǎn)離心力離心運(yùn)動(dòng)：第十五頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日16離心作用是根據(jù)在一定角速度下作圓周運(yùn)動(dòng)的任何物體都受到一個(gè)向外的離心力進(jìn)行的。離心力（Fc）的大小等于離心加速度ω2r與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：

式中ω是旋轉(zhuǎn)角速度，Ｎ(rpm)是每分鐘轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)次數(shù)，r為離心半徑(cm)，m是質(zhì)量。離心作用、離心力：第十六頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日17二、相對(duì)離心力(relativecentrifugalforce，RCF)

相對(duì)離心力是指在離心力場(chǎng)中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度“g”。

由于各種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力也不同,因此在文獻(xiàn)中常用“相對(duì)離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力,例如25000×g,表示相對(duì)離心力為25000。只要RCF值不變，一個(gè)樣品可以在不同的離心機(jī)上獲得相同的結(jié)果。一般情況下,低速離心時(shí)相對(duì)離心力常以轉(zhuǎn)速“rpm”來(lái)表示，高速離心時(shí)則以“g”表示。=1.118×10-5×(rpm)2×rg為地球重力加速度(980cm·sec-2)第十七頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日18通常稱(chēng)離心管頂部到旋轉(zhuǎn)中心的距離為最小離心半徑rmin，該處承受的離心力場(chǎng)為最小離心力場(chǎng)；稱(chēng)離心管底部到旋轉(zhuǎn)中心的距離為最大離心半徑rmax，該處承受的離心力場(chǎng)稱(chēng)為最大離心力場(chǎng)。最小離心半徑最大離心半徑在計(jì)算時(shí)規(guī)定旋轉(zhuǎn)半徑均用平均半徑“Rav”代替：第十八頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日19三、沉降系數(shù)微粒(分子)的沉淀性質(zhì)以沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient，S)表示，其量綱為秒(s)。1924年Svedberg對(duì)沉降系數(shù)下的定義為：顆粒在單位離心力場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。積分得:(X1為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；X2為離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離)

若ω用2πn／60表示，則:定義10-13s為一個(gè)Ｓvedberg單位，即１Ｓ＝10-13s。第十九頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日20四、沉降速度(sedimentationvelocity)沉降速度是指在強(qiáng)大離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的距離式中r為球形粒子半徑；d為球形粒子直徑；η為流體介質(zhì)的黏度；ρp為粒子的密度；ρm為介質(zhì)的密度.將2-7代入2-4可得①當(dāng)ρp

＞ρm，則S>O，粒子順著離心方向沉降；②當(dāng)ρp=ρm，則S=o，粒子到達(dá)某一位置后達(dá)到平衡；③當(dāng)ρp

＜ρm，則S<0，粒子逆著離心方向上浮。第二十頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日21Fc=FB+Ff

+FKFc：離心力FB：由離心力場(chǎng)所引起的浮力Ff：摩擦阻力FK:擴(kuò)散作用力

Fc=FB=Ff=f·(dx/dt)（f為摩擦系數(shù)，單位是g/s)FbFgFBFf沉降速度的推導(dǎo)方法:代入上式得：dx/dt=縱向力橫向力Fc-fFK第二十一頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日22第二節(jié)離心機(jī)構(gòu)造一、各式離心機(jī)的主要結(jié)構(gòu)裝置二、驅(qū)動(dòng)部分三、制冷和溫度控制四、離心機(jī)的主要類(lèi)型第二十二頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日23離心機(jī)的主要構(gòu)件組成:驅(qū)動(dòng)電機(jī)制冷系統(tǒng)(高速離心機(jī))真空系統(tǒng)(超離離心機(jī))

顯示系統(tǒng)自動(dòng)保護(hù)系統(tǒng)控制系統(tǒng)必要配件:離心轉(zhuǎn)頭和離心管第二十三頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日24第二十四頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日25一、各式離心機(jī)的主要結(jié)構(gòu)裝置第二十五頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日26二、驅(qū)動(dòng)部分(一)轉(zhuǎn)頭室轉(zhuǎn)頭室的設(shè)計(jì)要求:安全、密閉、隔熱①應(yīng)具有一定的強(qiáng)度，外有防護(hù)鋼板，保證內(nèi)部破裂飛濺物不能擊穿飛出。②達(dá)到高速旋轉(zhuǎn)時(shí)，自動(dòng)鎖定，不能人為地開(kāi)啟。③有隔熱保護(hù)屋。④有蒸發(fā)盤(pán)管組成的內(nèi)室壁，壁的材質(zhì)為不銹鋼的，便于清潔消毒和耐蝕。⑤有真空裝置的轉(zhuǎn)頭室，對(duì)室蓋、電機(jī)軸與轉(zhuǎn)室交換處設(shè)有密封裝置，保證轉(zhuǎn)頭室具有良好的密封性。第二十六頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日271．轉(zhuǎn)頭的型式(1)角式轉(zhuǎn)頭(2)蕩平式轉(zhuǎn)頭(3)垂直轉(zhuǎn)頭(4)區(qū)帶轉(zhuǎn)頭(5)連續(xù)流動(dòng)轉(zhuǎn)頭連續(xù)流動(dòng)轉(zhuǎn)頭扇形小室葉片徑向?qū)Ч軈^(qū)帶轉(zhuǎn)頭垂直轉(zhuǎn)頭敞開(kāi)式轉(zhuǎn)頭角式轉(zhuǎn)頭第二十七頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日282．離心管設(shè)計(jì)要求:高強(qiáng)度、耐熱、透明性

(1)塑料離心管聚乙烯(polyethylene，PE)

聚碳酸酯(po1ycabonate，PC)

聚丙烯(poly-propylene，PP)特點(diǎn):透明(或半透明)，硬度小，能耐高溫消毒，可用穿刺法取出梯度,易變形，抗強(qiáng)酸強(qiáng)堿及某些有機(jī)溶劑腐蝕性差，使用壽命.(2)不銹鋼管特點(diǎn):強(qiáng)度大，不變形，能抗熱、抗凍、抗化學(xué)腐蝕。但價(jià)格高(3)玻璃試管特點(diǎn):耐熱和透明性好，強(qiáng)度差3．管帽第二十八頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日29(二)驅(qū)動(dòng)電機(jī)多為串激式,包括定子和轉(zhuǎn)子兩部分第二十九頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日30(三)轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)系統(tǒng)1．交流變頻調(diào)速將逐步取代直流調(diào)速2．多功能、自動(dòng)化和微機(jī)控制第三十頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日31三、制冷和溫度控制１．制冷系統(tǒng)高超速離心機(jī)和一部分低速大容量制備用離心機(jī)配置2．溫度控制轉(zhuǎn)頭室內(nèi)的溫度由測(cè)溫元件完成,如蒸汽壓力式溫度表、半導(dǎo)體熱敏電阻和紅外線遙感元件。測(cè)溫元件感測(cè)到的信號(hào)，通過(guò)放大器放大來(lái)控制制冷系統(tǒng)第三十一頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日32四、離心機(jī)的主要類(lèi)型根據(jù)用途：分析型、制備型、分析－制備型根據(jù)操作方式：間歇、連續(xù)和半連續(xù)

根據(jù)分離形式：沉降式和過(guò)濾式

根據(jù)離心機(jī)轉(zhuǎn)速：分常速(低速)、高速和超速

根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：管式、吊籃式、轉(zhuǎn)鼓式和碟式

根據(jù)是否冷凍：高速冷凍離心機(jī)、大容量冷凍離心機(jī)第三十二頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日33制備性離心機(jī):用于分離各種生物材料，每次分離的樣品容量比較大

分析性離心機(jī):

一般都帶有光學(xué)系統(tǒng)，主要用于研究純的生物大分子和顆粒的理化性質(zhì)第三十三頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日341.制備性離心機(jī):

根據(jù)轉(zhuǎn)速常速（低速）高速超速rpm

500010000~25000＞25000ＲＣＦ6000×g89000×g＞89000×g適用分離對(duì)象細(xì)胞微生物菌體、大細(xì)胞器亞細(xì)胞器、病毒和和細(xì)胞碎片等

生物大分子等第三十四頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日352.分析性離心機(jī):都是超速離心機(jī)使用了特殊設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)頭和光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，以便連續(xù)地監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場(chǎng)中的沉降過(guò)程，從而確定其物理性質(zhì)在分析離心杯中物質(zhì)沉降情況時(shí)，在重顆粒和輕顆粒之間形成的界面就像一個(gè)折射的透鏡，結(jié)果在檢測(cè)系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)生了一個(gè)“峰”，由于沉降不斷進(jìn)行，界面向前推進(jìn)，因此峰也移動(dòng)，從峰移動(dòng)的速度可以計(jì)算出樣品顆粒的沉降速度。第三十五頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日36第三節(jié)離心方法一、分離離心法二、分析離心法三、普通低速離心機(jī)使用的注意事項(xiàng)第三十六頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日37離心方法分類(lèi)：差速離心法密度梯度離心方法速率區(qū)帶離心法等密度區(qū)帶離心法分離離心方法分析離心方法：監(jiān)測(cè)沉降過(guò)程，研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)第三十七頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日38一、分離離心法又稱(chēng)制備離心法，包括差速離心法和密度梯度離心法第三十八頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日391．差速離心法

是以不同離心力來(lái)分離不同質(zhì)（沉降系數(shù)）的微粒的一種動(dòng)力學(xué)方法，因不同的粒子在同一離心條件的離心力場(chǎng)中沉降速度不同，若不斷增加相對(duì)離心力，一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子將分步沉淀。原理：速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀

第三十九頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日40用差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份

特點(diǎn)及應(yīng)用：

特點(diǎn)：分辨率不高；離心次數(shù)多，操作繁雜；產(chǎn)品的純度和回收率都達(dá)不到理論值。應(yīng)用：用于組織勻漿液中細(xì)胞器和病毒的分離及其他分離手段之前的粗制品提取。如破碎細(xì)胞各組分(細(xì)胞核、細(xì)胞膜碎片、線粒體、溶酶體、核糖體)的沉淀分離。第四十頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日412．密度梯度離心法原理：將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。

分類(lèi)：依據(jù)離心分離原理。（連續(xù)密度梯度離心法）

（不連續(xù)密度梯度離心法）

第四十一頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日42(1)速率區(qū)帶離心法原理：

在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)(如蔗糖)，把待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，與梯度液一起離心?？拷D(zhuǎn)軸處的介質(zhì)密度最小，離旋轉(zhuǎn)軸最遠(yuǎn)處的介質(zhì)密度最大，但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度。

這種方法是根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達(dá)到彼此分離的目的。

第四十二頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日43梯度液（聚蔗糖(ficoll)、硅溶膠(pereoll)及蔗糖(sucrose)）在離心過(guò)程中以及離心完畢后，取樣時(shí)起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用，避免因機(jī)械振動(dòng)而引起已分層的粒子再混合。第四十三頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日44特點(diǎn)及應(yīng)用：特點(diǎn)：分辨力高，但離心時(shí)間要嚴(yán)格控制。應(yīng)用：速率區(qū)帶離心法是一種動(dòng)力學(xué)方法，適用于測(cè)定生物大分子顆粒的沉降系數(shù)。速率區(qū)帶離心是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般應(yīng)用于物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。第四十四頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日45(2)等密度區(qū)帶離心法原理：根據(jù)樣品組分的密度差別進(jìn)行分離純化，一般是將待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合

，密度梯度液柱的密度范圍很大，液柱底部的密度明顯大于樣品組分的密度。如果樣品中有幾個(gè)密度不相同的組分，它們將分別集中于密度梯度液柱中相應(yīng)的密度位置上，形成幾個(gè)分離的區(qū)帶，收集各個(gè)區(qū)帶即得到各個(gè)提純的組分。第四十五頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日46分辨力高，耗時(shí)。是一種測(cè)定生物大分子或顆粒的浮力密度的靜力學(xué)方法。此法一般應(yīng)用于物質(zhì)的大小相近，而密度差異較大時(shí)，如分離核酸、亞細(xì)胞器等，也可以分離復(fù)合蛋白質(zhì)，簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)不適用。梯度介質(zhì)通常為氯化銫(CsCl)特點(diǎn)及應(yīng)用：第四十六頁(yè)，共五十三頁(yè)，編輯于2023年，星期日47二、分析離心法目的:

為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)，而不是專(zhuān)門(mén)收集某一特定組分。方法:

使用特殊的轉(zhuǎn)子和檢測(cè)手段，連續(xù)監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場(chǎng)中的沉降過(guò)程

沉降速度法沉降平衡法等密