流式細(xì)胞術(shù)的原理科研

流式細(xì)胞術(shù)的原理科研第一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日概念Definition流式細(xì)胞術(shù)Flowcytometry(FCM)cellsuspension細(xì)胞懸液在流動的狀態(tài)中被檢測各項特性特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實現(xiàn)多參數(shù)分析檢測的對象主要是各種生物顆粒，包括大量的臨床樣本：外周血，骨髓，細(xì)胞穿刺液，洗脫液，實體組織，同時包括各種各樣的科研研究對象：培養(yǎng)細(xì)胞，藻類、染色體、原生動物第二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)以及原理第三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)以及工作原理雖然每款流式細(xì)胞儀有各自的特征性結(jié)構(gòu)，但是其內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本組成相同。基本結(jié)構(gòu)一共分三部分：液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)電子系統(tǒng)第四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日PrincipleReview第五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)包括流動室flowchamber液流驅(qū)動系統(tǒng)InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid鞘液三大作用：避免堵塞噴孔約束樣本位于噴嘴中心、提高測量精度保持細(xì)胞活性第六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日液流系統(tǒng)對靈敏度要求不是很苛刻的實驗，可調(diào)高樣本進(jìn)樣速率，從而提高采樣分析速度。第七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日光學(xué)系統(tǒng)主要由激發(fā)光源、光束成形及收集系統(tǒng)組成

弧光燈：氙燈、高壓汞燈價格便宜激發(fā)光譜廣但是單色性差-單一譜線上能量弱穩(wěn)定性差-功率不穩(wěn)定激光器：氣體激光器：氬離子（488nm）、氦氖（633nm）、氪離子（647nm）、氪氬（568nm）半導(dǎo)體激光器：價格低、結(jié)構(gòu)簡單、使用壽命長。BDFACSCalibur采用的635nm染料激光器第八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日光學(xué)系統(tǒng)激光器：單波長、高能量、發(fā)散角小、高穩(wěn)定性光照第九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日光學(xué)系統(tǒng)激光在檢測細(xì)胞樣本前經(jīng)過透鏡聚焦成為非常窄的高能量光束。激光光束的橫截面呈橢圓形光斑，所以除了集聚能量（細(xì)胞通過檢測區(qū)時就可以得到很強(qiáng)的信號），這樣還可以避免照射到其他細(xì)胞造成干擾。激光光束成形-透鏡聚焦第十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日光學(xué)系統(tǒng)收集系統(tǒng)

如何將混合的熒光區(qū)分開來，分別進(jìn)行收集呢？濾光片置于熒光探測器前，限定其接收的熒光的波長范圍第十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日光學(xué)系統(tǒng)第十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日電子系統(tǒng)第十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日流式細(xì)胞儀的工作原理第十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日散射光信號前向角散射光（FSC，F(xiàn)orwardScatter）：細(xì)胞相對大小及其表面積側(cè)向角散射光（SSC，SideScatter）：細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞核相對復(fù)雜性第十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日散射光信號第十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日熒光信號特異熒光信號背景信號第十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日熒光素什么是熒光及熒光素？某些物質(zhì)在特定波長范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長比照射光波長長的光線-即熒光。而這些受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱為熒光素。什么是熒光發(fā)生機(jī)理？室溫下的熒光素分子大部分處于穩(wěn)定的“基態(tài)”。當(dāng)熒光素在激發(fā)光的照射下吸收足夠的光能后，躍遷到新的狀態(tài)，即“激發(fā)態(tài)”。處于激發(fā)態(tài)的熒光分子極不穩(wěn)定，它可以通過極短時間（納秒）內(nèi)以發(fā)射一定波長的光量子的方式釋放所吸收的能量從而返回到基態(tài)。這一過程稱為熒光發(fā)射，也就是發(fā)光。第十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜所有的熒光素都有兩個特征光譜。激發(fā)光譜（Excitation，Ex）：-是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。-我們一般標(biāo)注的是吸收波峰，也就是最大吸收波長：Ex-Max發(fā)射光譜（Emission，Em）：-是指熒光素發(fā)射的一定波長范圍內(nèi)的熒光。所有熒光都是寬譜發(fā)射。-一般標(biāo)注的是發(fā)射波峰，即最大發(fā)射波長：Em-Max第十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日FITC的激發(fā)與發(fā)射光譜常用染料FITC可被488nm激光激發(fā)，Em-Max：525nm，可以配用530/30接收通道488nm525nm第二十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日PI的激發(fā)與發(fā)射光譜常用染料PI同樣可被488nm激光激發(fā)，Em-Max：625nm，所以配用不同的585/42接收通道488nm625nm第二十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日APC的激發(fā)與發(fā)射光譜常用染料APC可被635nm激光激發(fā)，Em-Max：660nm，可以配用660/20接收通道635nm660nm第二十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日熒光染料的選擇儀器配置：激光器種類；光信號接收通道；減少發(fā)射光光譜重疊第二十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日補償——熒光染料寬譜發(fā)射的特征產(chǎn)生補償問題?！狿E滲漏到FITC通道的信號FL1-x%FL2—FITC滲漏到PE通道的信號FL2-x%FL1第二十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日先電壓，后補償雙色染色的實驗中先使用陰性管調(diào)電壓陰性對照（1）：細(xì)胞加上IgG1FITC,IgG1PE然后用單染管調(diào)補償單染管（2）：細(xì)胞+抗體AFITCor抗體BPE第二十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日調(diào)電壓

-尋找目標(biāo)細(xì)胞群;-多色實驗中，分出陰陽性細(xì)胞群分界線調(diào)閾值-減少背景信號調(diào)補償-減去干擾信號調(diào)節(jié)電壓、閾值、補償?shù)诙摚菜氖?，編輯?023年，星期日調(diào)整熒光接收器電壓電壓改變對數(shù)據(jù)顯示的影響第二十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日數(shù)據(jù)存儲ListMode列表模式：每個細(xì)胞的參數(shù)依次按順序排列存儲

FSCSSCFL1FL2EVENVENT210020024540EVENT3300600100700FITC/PE雙染樣本第二十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日數(shù)據(jù)顯示二維點圖（DotPlot）直方圖（Histogram）等高線圖（ContourPlot）密度圖（Density）三維圖（3DPlot）等·第二十九頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日樣本收集及處理制備單細(xì)胞懸液免疫熒光染色上機(jī)檢測數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞術(shù)操作流程第三十頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日1.樣本制備第三十一頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日樣本來源血液骨髓淋巴結(jié)體液（尿液、腦脊液、胸腹腔積液）灌洗液（肺泡支氣管）加抗凝劑（EDTA），室溫保存，24h內(nèi)實體組織機(jī)械法制備單細(xì)胞懸液，保持抗原活性，不宜用酶、表面活性劑第三十二頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日2.免疫熒光染色第三十三頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日染色方式的選擇直接染色—

標(biāo)有熒光染料的抗體直接特異結(jié)合目標(biāo)抗原。—首選的方式：方便快捷、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、非特異結(jié)合少間接染色—標(biāo)有熒光染料的二抗間接特異結(jié)合目標(biāo)抗原?！谥苯尤旧荒軐崿F(xiàn)的情況下，選用的方式：非特異性結(jié)合相對增加。在流式試劑日益全面的情況下，越來越少的客戶選擇這種方式。僅適用于研究最新發(fā)現(xiàn)抗原的客戶。第三十四頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日熒光染料的選擇1，首先，了解目標(biāo)抗原1）細(xì)胞表面抗原2）細(xì)胞內(nèi)或是核內(nèi)抗原（固定、透膜步驟）3）以上兩者兼?zhèn)洹Ｏ葮?biāo)記表面抗原，固定后，破膜標(biāo)記胞內(nèi)抗原。4）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的測定。使用細(xì)胞內(nèi)蛋白分泌抑制劑，如monensin、BFA，使得細(xì)胞因子不能分泌到細(xì)胞外。（活化、固定、透膜）2，了解熒光染料及其工作原理，做出準(zhǔn)確的選擇。第三十五頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日熒光染料的種類熒光染料分為三大類1.小分子化合物：FITC、PacificBlue2.大分子熒光蛋白：AmCyan，PerCP，PE,APC3.串聯(lián)染料：

PerCP-Cy5.5，PE-Cy5第三十六頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日如何正確選擇與使用熒光素儀器配置：有哪些激光器與接收通道多色實驗中，盡量減少熒光素之間的相互干擾—

如APC與Cy5不能串聯(lián)使用，兩者光譜重疊大，補償不好調(diào)。第三十七頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日BD網(wǎng)站提供每一種熒光素的激發(fā)以及發(fā)射光譜第三十八頁，共四十頁，編輯于2023年，星期日如何正確選擇與使用熒光素儀器配置：有哪些激光器與接收通道多色實驗中，盡量減少熒光素之間的相互