植物組織培養(yǎng)原理

植物組織培養(yǎng)原理第一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素細(xì)胞全能性和細(xì)胞分化

離體條件下器官發(fā)生

體細(xì)胞胚胎發(fā)生第二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日知識點(diǎn):基本概念：植物細(xì)胞全能性、細(xì)胞分化、 脫分化、再分化植物離體培養(yǎng)中再生植株有哪些途徑？愈傷組織是如何形成與生長的？植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生有哪些途徑？影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素有哪些？第三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)植物細(xì)胞全能性和細(xì)胞分化植物組織培養(yǎng)的核心理論：

植物細(xì)胞全能性理論（Haberlandt,1902）。第四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日細(xì)胞全能性概述細(xì)胞脫分化細(xì)胞再分化第五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日定義：1902年由Haberlandt提出，即植物體細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖、發(fā)育成完整植株的能力。

20世紀(jì)80年代，每一個植物細(xì)胞具有該植物的全部遺傳信息，在適當(dāng)條件下可表達(dá)出該細(xì)胞的所有遺傳信息，分化出植物有機(jī)體所有不同類型細(xì)胞，形成不同類型的器官甚至胚狀體，直至形成完整再生植株。一、植物細(xì)胞的全能性（Totipotency）第六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日從一個細(xì)胞發(fā)育成一個植株第七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日植物細(xì)胞全能性的證明是通過1958年Steward等胡蘿卜根段細(xì)胞體胚發(fā)生試驗及1964年Guha等進(jìn)行的曼陀羅花藥培養(yǎng)。第八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日細(xì)胞全能性的相對性:

細(xì)胞全能性并不意味著任何細(xì)胞均可以直接產(chǎn)生植物;

動植細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異.第九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日細(xì)胞按照分裂能力分為三類:第一類是始終保持分裂能力,如莖尖、根尖及形成層細(xì)胞；第二類是永久失去分裂能力的終端分化細(xì)胞，如篩管、導(dǎo)管、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞等特化細(xì)胞；第三類是在通常情況下不分裂，但在受到外界刺激后可重新啟動分裂的細(xì)胞。如表皮細(xì)胞及各種薄壁細(xì)胞。第十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日一個植物細(xì)胞向分生狀態(tài)回復(fù)過程所能進(jìn)行的程度，取決于它在自然部位上所處位置和生理狀態(tài)。第十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日根據(jù)細(xì)胞類型不同從強(qiáng)到弱:

營養(yǎng)生長中心>形成層>薄壁細(xì)胞>厚壁細(xì)胞（木質(zhì)化細(xì)胞）>特化細(xì)胞（篩管、導(dǎo)管細(xì)胞）根據(jù)細(xì)胞所處的組織不同從強(qiáng)到弱：頂端分生組織>居間分生組織>側(cè)生分生組織>薄壁組織（基本組織）>厚角組織>輔導(dǎo)組織>厚壁組織第十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日

植物細(xì)胞全能性理論是植物組織培養(yǎng)的核心理論。離體細(xì)胞具有生命的特征屬性，在全能性的基礎(chǔ)上，提供合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件，離體細(xì)胞經(jīng)歷脫分化（dedifferentiation）和再分化（redifferentiation）過程，可形成再生植物。第十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日細(xì)胞全能性脫分化個體再生再分化細(xì)胞分裂細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過細(xì)胞脫分化和再分化實(shí)現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的前提，再分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的最終體現(xiàn)。第十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日植物干細(xì)胞：存在于植物頂端分生組織（莖尖和根尖分生組織）的原始細(xì)胞團(tuán)，也存在于形成層等各種次生分生組織中；植物離體胚性細(xì)胞定義為植物全能性干細(xì)胞。具有再生能力的愈傷組織或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞植物干細(xì)胞變異第十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日擬南芥頂端分生組織中的干細(xì)胞第十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日擬南芥根尖分生組織中的干細(xì)胞第十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日干細(xì)胞能夠很好的展現(xiàn)植物細(xì)胞的全能性，因此植物干細(xì)胞的選擇和誘導(dǎo)是植物離體培養(yǎng)再生技術(shù)體系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。植物干細(xì)胞自我更新再生能力遺傳穩(wěn)定第十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日

1、定義：分化（differentiation）：是指植物體各個部分出現(xiàn)異質(zhì)性的現(xiàn)象，體現(xiàn)在細(xì)胞分化、組織分化、器官分化三個水平上。細(xì)胞分化：指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在的發(fā)育方式改變的過程。是基因選擇性活化或阻遏的結(jié)果。細(xì)胞分化是組織分化和器官分化的基礎(chǔ)，是離體培養(yǎng)再分化和植株再生得以實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)。二、植物細(xì)胞分化第十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日2、植物細(xì)胞分化的某些規(guī)律和機(jī)理（1）細(xì)胞分化分為形態(tài)結(jié)構(gòu)分化和生理生化分化兩類，生理生化分化在形態(tài)結(jié)構(gòu)分化之前。（2）植物中細(xì)胞發(fā)育的途徑一旦被“決定”（determination），通常不易改變。而離體培養(yǎng)可以通過脫分化而喪失這種“決定”。（3）分化與極性（Polarity）關(guān)系密切。第二十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日（4）細(xì)胞分裂對細(xì)胞分化具有重要作用。特定環(huán)境條件下進(jìn)行的細(xì)胞分裂可以導(dǎo)致特定的細(xì)胞分化，由不等分裂形成的分化細(xì)胞說明了細(xì)胞質(zhì)在細(xì)胞分化中的作用。（5）植物生長調(diào)節(jié)劑有明顯調(diào)節(jié)作用。如生長素與分裂素比值，高，促進(jìn)生根；低，促進(jìn)長芽。（6）染色體和DNA的變化對細(xì)胞分化影響比較大。如核內(nèi)多倍體的形成。（7）生理隔離現(xiàn)象第二十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)離體條件下植物器官發(fā)生

植物的離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成根、芽、莖等器官的過程。不定根、不定芽是指在一些非正常發(fā)生部位形成的根或芽，離體培養(yǎng)中通常是指從愈傷組織上發(fā)生的根或芽。第二十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日一、脫分化1、脫分化（Dedifferentiation）：也稱去分化，指離體條件下生長的細(xì)胞、組織或器官經(jīng)過細(xì)胞分裂或不分裂逐漸失去原來的結(jié)構(gòu)和功能而恢復(fù)分生狀態(tài)，形成無組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織或不分化細(xì)胞的過程。如葉柄基部的薄壁細(xì)胞成為離層細(xì)胞；傷害導(dǎo)致局部細(xì)胞形成愈傷組織。第二十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日

脫分化誘導(dǎo)期間會導(dǎo)致細(xì)胞膜透性改變，細(xì)胞核增大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)范圍擴(kuò)大，多核糖體形成，過氧化物酶增加，蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)合成活躍等。但目前對于脫分化的機(jī)理尚未完全闡明。2、脫分化的機(jī)理第二十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日（1）損傷。切割損傷的刺激，促使細(xì)胞增殖。（2）在誘導(dǎo)愈傷組織時常加入生長素類，但同時配合細(xì)胞分裂素的效果可能更好。（3）弱光或黑暗條件有利于脫分化中的細(xì)胞分裂。（4）細(xì)胞位置。外植體本身的各類細(xì)胞可能對培養(yǎng)條件的刺激有不同的敏感性。（5）外植體的生理狀態(tài)。不同生理年齡和不同季節(jié)都會有不同的培養(yǎng)反應(yīng)。（6）植物種類的差異。一般雙子葉植物比單子葉植物及裸子植物容易。3、影響脫分化的主要因素第二十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日組織培養(yǎng)中的再分化包括下面4個水平：細(xì)胞水平的再分化組織水平的再分化器官水平的再分化（器官發(fā)生）植株水平的分化（植株再生）二、再分化第二十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日細(xì)胞水平的再分化：愈傷組織生長、不斷分裂，分化出不同的細(xì)胞類群。主要有薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞、石細(xì)胞、纖維細(xì)胞等。第二十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日組織水平的再分化：在高水平生長素條件下，最常見的是微管束（Vasculartissue）的分化。松散的愈傷組織內(nèi)含大量擬分生組織或瘤狀結(jié)構(gòu)；致密的愈傷組織內(nèi)組織分化很少，大多由高度液泡化的細(xì)胞組成。

第二十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日器官水平的再分化：由分化出的不同組織形成各種器官，如芽、莖、葉、根等。 根據(jù)起源不同，分為兩種類型：直接器官發(fā)生（器官型）：直接從外植體的細(xì)胞形成器官原基，然后發(fā)育成器官。間接器官發(fā)生（器官發(fā)生型）：先形成愈傷組織，再由愈傷組織產(chǎn)生不同的器官原基，后形成不同器官。第二十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日植株水平的再分化（植株再生）：根、莖或芽器官的發(fā)生可使植株重建。先誘導(dǎo)分化出芽，后形成根較好。離體培養(yǎng)中再生植株的主要途徑有：器官發(fā)生胚胎發(fā)生第三十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日

2、影響細(xì)胞再分化因素：

從理論上講，在離體培養(yǎng)條件下經(jīng)過再分化可獲得各種類型的細(xì)胞、組織、器官以及再生植株。但是目前，還不能讓所有植物的活細(xì)胞都再生植株。主要原因是：（1）不同植物種類再分化的能力差異很大；（2）對某些植物再生條件還沒有完全掌握。第三十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日三、愈傷組織（callus）培養(yǎng)１、愈傷組織的形成

在細(xì)胞脫分化過程中，大多數(shù)情況下形成愈傷組織。愈傷組織的細(xì)胞往往是異質(zhì)性的，無明顯極性，其形成過程可分為誘導(dǎo)期、分裂期和分化期。

第三十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日愈傷組織（callus）原指植物體的局部受到創(chuàng)傷刺激后，在傷口表面新生的組織。它由活的薄壁細(xì)胞組成，可起源于植物體任何器官內(nèi)各種組織的活細(xì)胞。第三十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日黃瓜子房組織經(jīng)脫分化形成胚性愈傷組織第三十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日第三十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日誘導(dǎo)期（起動期）：是細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的時期。細(xì)胞大小幾不變，內(nèi)部發(fā)生生理生化變化，迅速合成蛋白質(zhì)和核酸。分裂期：外層細(xì)胞分裂，中間細(xì)胞常不分裂，形成小芯。細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少結(jié)構(gòu)，淺而透明。在原培養(yǎng)基上，細(xì)胞必分化，及時轉(zhuǎn)移，其可無限制地進(jìn)行細(xì)胞分裂，維持不分化狀態(tài)（愈傷的繼代）。分化期：細(xì)胞在形態(tài)和生理功能上的分化，出現(xiàn)形態(tài)和功能各異的細(xì)胞。形成過程（三個時期）：第三十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日2、愈傷組織的生長

（1）生長：誘導(dǎo)期后，外植體外層細(xì)胞分裂，在組織受傷表面形成一層愈傷組織，細(xì)胞數(shù)目迅速增多，表層細(xì)胞平均重量下降，體積變??；降低溫度，可以使細(xì)胞生長速度減慢，平均大小可增加。（2）質(zhì)地類型：松脆和致密兩種。高濃度生長素，可使Callus變得松脆；高濃度細(xì)胞分裂素，則可使致密。（3）生理生化變化：次生物質(zhì)合成能力變化，對激素的需求變化等。第三十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日3、愈傷組織的保持–

轉(zhuǎn)接

在多數(shù)情況下，隨著繼代培養(yǎng)代數(shù)增加和培養(yǎng)時間的延長，Callus長勢下降、褐變、分化和形態(tài)發(fā)生能力下降、降低甚至死亡。所以在此之前，應(yīng)及時轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基上。

主要原因：遺傳因素，染色體畸變、基因突變；生理因素，細(xì)胞或組織內(nèi)激素平衡的改變，細(xì)胞對外源生長物質(zhì)的敏感性改變。后者可以通過調(diào)控培養(yǎng)條件而恢復(fù)。第三十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日4、愈傷組織形態(tài)發(fā)生

（1）過程：外層細(xì)胞分裂，逐漸減慢并停止；內(nèi)部較深處的細(xì)胞開始分裂，而且分裂方向也發(fā)生改變，形成微管化組織和瘤狀結(jié)構(gòu)。（2）形態(tài)發(fā)生方式：器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生。第三十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日器官發(fā)生體細(xì)胞胚胎發(fā)生第四十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日愈傷組織器官發(fā)生的方式：A

先形成芽，芽的基部后產(chǎn)生后根；B

先形成根，根上再出芽；C愈傷組織的不同部位形成芽和根，然后形成微管束組織把兩者結(jié)合起來.第四十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日器官發(fā)生的過程：分為兩種：

經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生第四十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程愈傷組織形成生長中心形成器官原基及器官形成第四十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程有兩種情況： 外植體直接發(fā)生芽 莖尖培養(yǎng)中芽形成第四十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生一、什么是植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生？定義：植物離體培養(yǎng)的細(xì)胞、組織、器官產(chǎn)生類似胚的結(jié)構(gòu)，其形成也經(jīng)歷一個類似合子胚胎發(fā)生和發(fā)育過程，這種現(xiàn)象稱為植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生，形成的類似胚的結(jié)構(gòu)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有普遍性，目前已在200多種被子植物上觀察到體胚發(fā)生過程。第四十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日合子胚的發(fā)生過程第四十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日第四十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日雙子葉植物胚胎發(fā)生：合子－原胚－球形胚－心型胚－魚雷胚－子葉胚單子葉植物胚胎發(fā)生：合子－原胚－球形胚－盾型胚－子葉胚體細(xì)胞胚胎發(fā)生與合子胚發(fā)生階段類似，但體胚形成由體細(xì)胞（或小孢子等性細(xì)胞）形成。第四十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日合子心型胚正在萌發(fā)的體胚

合子胚與體胚比較第四十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日

1、發(fā)生過程：一般分為5個階段：胚性愈傷組織誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎早期分化發(fā)育、體細(xì)胞胚胎成熟、體細(xì)胞胚胎萌發(fā)和成苗。

雙子葉植物：體胚經(jīng)過原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚到子葉胚等階段。

單子葉植物：與雙子葉植物誘導(dǎo)發(fā)生過程類似，只是在形態(tài)上無魚雷形胚等階段，成熟體胚上有盾片、胚芽鞘和胚根等結(jié)構(gòu)。二、體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程 第五十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日第五十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日挪威云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)生及體胚生長狀態(tài)第五十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日針葉松體細(xì)胞胚及體胚萌發(fā)生長第五十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日（1）胚性愈傷組織，通常較小，近圓形，具有較大的核和核仁，并高度染色，胞質(zhì)濃厚。典型的胚性愈傷組織外表呈松脆顆粒狀。（2）胚性細(xì)胞DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的合成更活躍，淀粉、可溶性糖含量增加，內(nèi)源多胺含量升高，同工酶和內(nèi)源激素合成變化明顯。如胡蘿卜胚性愈傷組織淀粉含量高出非胚性愈傷組織的15~40倍。2、胚性和非胚性細(xì)胞或愈傷組織生理狀態(tài)的差異第五十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日3、體細(xì)胞胚胎發(fā)生的基因表達(dá)機(jī)理

植物體胚發(fā)生的過程非常復(fù)雜，牽涉到4000多個相關(guān)基因，以體胚發(fā)育后期，表達(dá)的基因可達(dá)1000多個。在植物體胚發(fā)生過程中，會出現(xiàn)與基因表達(dá)有關(guān)的一系列生物大分子的有規(guī)律變化.如蛋白質(zhì)含量變化和特異蛋白質(zhì)（胚性蛋白）出現(xiàn)與消失。由于其復(fù)雜性，目前對體胚發(fā)生的機(jī)制了解不多。第五十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日三、植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑1、直接途徑：指從外植體某些部位的胚性細(xì)胞直接誘導(dǎo)分化出體細(xì)胞胚胎，如子葉、花序、珠心等外植體。DirectsomaticembryogenesisinBrassicanapus第五十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日2、間接途徑:

外植體先脫分化形成愈傷組織，再由愈傷組織的某些細(xì)胞重新“決定”為胚性細(xì)胞，進(jìn)而分化出體細(xì)胞胚胎。多數(shù)體細(xì)胞胚胎通過該途徑形成的。通常包括2個階段：（1）胚胎發(fā)生叢（Embryogenicclump）EC是由液泡小、細(xì)胞質(zhì)濃的小細(xì)胞構(gòu)成。（2）胚狀體的發(fā)育。將EC轉(zhuǎn)入降低或除去生長素、降低還原氮的培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可。第五十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日SomaticEmbryogenesisInductioninDelonixregia(Boger.)Raf(RoyalPoinciana)第五十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日花椰菜體胚發(fā)育的不同階段第五十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日菊花花瓣體細(xì)胞胚胎發(fā)生及體胚發(fā)育過程的掃描電鏡觀察第六十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日四、體細(xì)胞胚胎發(fā)生的機(jī)理

1、體細(xì)胞胚胎的起源：

起源存在爭論，但絕大多數(shù)體細(xì)胞胚胎起源于單細(xì)胞。 細(xì)胞胚發(fā)生的實(shí)質(zhì)是細(xì)胞分化，即細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)部分基因開放，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的表達(dá)。第六十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日

2、體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理：

體胚具有兩個明顯特點(diǎn)：極性和生理隔離

極性：單個胚性細(xì)胞第一次分裂多為不均等分裂，頂細(xì)胞繼續(xù)分裂形成多細(xì)胞原胚，基細(xì)胞進(jìn)行少數(shù)幾次分裂形成胚柄。極性獲得的誘因是激素和外界刺激。

生理隔離：在早期胚性細(xì)胞與周圍細(xì)胞存在胞間連絲，但是隨著胚性細(xì)胞的發(fā)育，細(xì)胞壁加厚，胞間連絲消失或被堵塞（類似小孢子發(fā)生）。第六十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日第六十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日第六十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日3、體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的的生理生化：（1）蛋白質(zhì)與核酸代謝；（2）多胺代謝變化；（3）糖類、礦質(zhì)營養(yǎng)變化；（4）內(nèi)源激素變化；（5）活性氧代謝變化。第六十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日第四節(jié)影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素