花椰菜中總DNA的提取方法

花椰菜中總DNA的提取方法張立勇;朱新軍【摘要】DNA提取是生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)步驟.主要針對(duì)花椰菜組織中多糖嚴(yán)重干擾基因組DNA提取質(zhì)量的問題，本研究用改良CTAB法提取花椰菜中DNA,結(jié)果顯示改良的CTAB法提取DNA量大,產(chǎn)率高，無(wú)明顯降解，雜質(zhì)少,A260/A280比值1.80左右，完全滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求.【期刊名稱】《廣州化工》【年(卷)，期】2013(041)003【總頁(yè)數(shù)】2頁(yè)(P58-59)【關(guān)鍵詞】花椰菜;DNA提取;改良CTAB法【作者】張立勇;朱新軍【作者單位】德州學(xué)院生物系仙東德州I253023;德州學(xué)院生物系仙東德州I253023【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類】TQ016.1花椰菜(BrassicaoleraceaL.var.botrytisL.)，是一種蔬菜。為十字花科蕓薹屬一年生植物，與西蘭花(青花菜)和結(jié)球甘藍(lán)同為甘藍(lán)的變種。原產(chǎn)于地中海東部海岸，約在19世紀(jì)初清光緒年間引進(jìn)中國(guó)。又名花菜、椰花菜、甘藍(lán)花、洋花菜、球花甘藍(lán)?；ㄒ撕械鞍踪|(zhì)、脂肪、磷、鐵、胡蘿卜素、維生素B1、維生素B2和維生素C、維生素A等，是蔬菜中維生素C含量最高的一種。DNA提取是生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)步驟。隨著花椰菜生物技術(shù)研究的開展，建立組織基因組DNA的快速高效提取方法十分必要。在植物DNA提取方法研究中，由于花菜類作物中含有較多的糖類和多酚類物質(zhì)，很容易干擾PCR擴(kuò)增效果，前人多選用真葉［1-5］作為試驗(yàn)材料。因此需針對(duì)具體的作物種類，探索高質(zhì)量DNA提取方法。在DNA提取方法中常用的有CTAB法、SDS法等，王春國(guó)等建立了花椰菜溫敏型雄性不育系的RAPD標(biāo)記［6］,對(duì)細(xì)胞質(zhì)不育系進(jìn)行了克隆和分析［7］。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)基因組DNA提取方法的進(jìn)行改進(jìn)，旨在建立花椰菜基因組DNA的高效提取方法，為花椰菜的相關(guān)分子生物學(xué)研究提供技術(shù)支持。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料供試材料:花椰菜購(gòu)于菜市場(chǎng)。1.2實(shí)驗(yàn)方法①稱取0.2g鮮葉（預(yù)先在-70°C冷凍），加入適量PVP-40T、抗壞血酸和石英砂，置于-70C預(yù)冷的研缽中快速研磨;②轉(zhuǎn)移粉末至1.5mL離心管中，加入750pL2xCTAB（65°C預(yù)熱處理），充分混勻，置于65C水浴中溫浴1h，期間不時(shí)搖晃；③冷卻至室溫，加入750pL氯仿/異戊醇（24:1V/V）溶液，顛倒離心管使之混勻，抽提10min;④離心（20°C,8000x10min）,^移上相至離心管（對(duì)應(yīng)編號(hào)）中，并加入等體積氯仿/異戊醇溶液抽提10min,重復(fù)2~3次⑤取上相，加入2倍體積的冰無(wú)水乙醇（-20C預(yù)冷），-70°C靜置30min，可見絮狀沉淀;⑥離心（20°C,12000x2min），去上清液;⑦加入800pLDNA洗滌緩沖液，冰上放置20min，去上清液;⑧用70%乙醇漂洗沉淀兩次（按⑥離心漂洗，去除無(wú)機(jī)離子），然后自然風(fēng)干，溶于盡可能少的TE緩沖液中（視DNA的量和純度而定），若要使DNA樣品加速溶解并除去其中殘留的DNase活性，可置于65°C水浴中加熱10min。DNA濃度用紫外分光光度法在核酸分析儀(Ultrospec2000型)上測(cè)定。DNA樣品于-20C下保存?zhèn)溆谩?.3瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)電泳檢測(cè)用1%瓊脂糖凝膠電泳，1~5V/cm電壓，紫外燈下拍照。2結(jié)果該法提取所得DNA樣品的紫外吸收掃描曲線極為平滑，260nm的吸收峰呈對(duì)稱分布，A260/A280值在1.7~1.9之間，表明提取所得的DNA樣品具有較高的純度。DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖顯示，條帶整齊，沒有任何DNA降解現(xiàn)象。完全符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)工作需要。DNA樣品于-20C下保存?zhèn)溆?。圖1DNA溶液的紫外掃描曲線圖2DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)3分析和討論3.1影響DNA提取效果的因素影響蔬菜總DNA提取效果的因素很多，根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)和其它文獻(xiàn)，歸納起來有下列關(guān)鍵因素：材料一般嫩的葉片和花組織容易冷凍研磨，老的或纖維含量高的組織不易研磨。所以材料要選擇纖維含量少、處于生長(zhǎng)旺盛期的材料，盡量避免幼小和老齡的材料。操作要準(zhǔn)確迅速首先研磨時(shí)要在液氮冷凍下快速研磨，磨得越細(xì)越好，在實(shí)驗(yàn)中，充分研磨的材料比不充分研磨的材料總DNA得率要高;研磨后要在材料解凍前加入CTAB抽提液(65C預(yù)熱處理)，混勻后置于65C水浴中，并不時(shí)搖晃。多酚類物質(zhì)的去除植物材料中特別是老的或是經(jīng)逆境處理的材料，含有大量的酚類化合物，這些酚類化合物氧化后易與DNA共價(jià)結(jié)合，使DNA帶棕色或褐色，并且能抑制DNA的酶解反應(yīng)。為了防止這類情況出現(xiàn)，可以向提取緩沖液中加入2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或增加抽提緩沖液中的蔬基乙醇的濃度。我們的實(shí)驗(yàn)在研磨時(shí)加入PVP的目的就是去除多酚類物質(zhì)。其他材料可以根據(jù)情況在研磨時(shí)加入，或者配置在抽提液中。⑷多糖的去除加入異丙醇，或者是乙醇沉淀那一步，看到DNA形成絲狀，挑出來，不要其他的了，直接用挑出的DNA，洗滌，溶解，效果比較好。⑸純度的檢測(cè)DNA純品的OD260/OD280為1.8，若比值較高說明含有RNA,比值較低說明有殘余蛋白質(zhì)存在;OD230/OD260的比值應(yīng)在0.4~0.5之間，若比值較高說明有殘余的鹽存在。3.2討論提取高質(zhì)量的基因組DNA是植物分子生物學(xué)研究的前提和基礎(chǔ)。植物中的多酚類化合物和多糖對(duì)于DNA質(zhì)量的影響，是植物分子生物學(xué)研究中最常遇到、必須解決的問題。提取植物總DNA的方法近年來已逐漸成熟，并針對(duì)不同材料被不斷改進(jìn)。Clark[8]的植物總DNA提取方法是應(yīng)用CTAB提取植物總DNA方法中較為經(jīng)典的方法之一，但在具體實(shí)踐中，有些步驟仍可改進(jìn)，實(shí)驗(yàn)操作可作進(jìn)一步技巧化改善。如果獲得的DNA溶液常常粘度大甚至呈膠狀，其原因就是DNA沉淀過程中多糖也同時(shí)被沉淀下來。本方法在研磨時(shí)加入了PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，PVP是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染;同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。結(jié)果證明本提取方法可為下一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)打下良好基礎(chǔ)。本試驗(yàn)使用CTAB法，保證了DNA的質(zhì)量，適合各種要求的分子實(shí)驗(yàn)DNA提取工作。參考文獻(xiàn)[1]俞文政，楊貴，張映南，等.辣椒基因組DNA提取方法研究[J].辣椒雜志，2007(4):39-43.[2]陳靜，王文江.適于AFLP分析的核桃幼葉DNA提取方法[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004,27(6):44-47.[3]王掌軍，馬駿.甜瓜基因組DNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)[J].寧夏農(nóng)林科技，2008(3):29-30.張正奇，鄒敏芬，熊勁芳，等.黃瓜DNA的提取研究[J].湖南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2003(6):13-17.楊麗，張俊環(huán)，孫浩元，等.基于改良SDS法的杏基因組DNA提取[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008,24(4):69-71.[6]王春國(guó)，陳小強(qiáng)，李慧，等.花椰菜溫敏型雄性不育系的RAPD標(biāo)記生物技術(shù)通報(bào)2010(10):118-121,125[7]王春國(guó)，陳小強(qiáng)，李慧，等.花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及保持系中特異序列的克隆、分析[J].分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào)，2008(1):19-27.[8]PorebskiSL,BaileyG,BaumBR.Modificati