核酸提取及常見問題分析

核酸提取及常見問題分析第一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六DNA提取

及常見問題分析TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.第二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六DNA提取的原則

DNA提取的方法

DNA提取常見問題分析DNA提取及常見問題分析第三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六

保證DNA一級結(jié)構(gòu)的完整性排除其它分子的污染

RNA、蛋白質(zhì)、多糖等DNA提取的原則第四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六基因組DNA的提取

CTAB法

SDS法質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結(jié)合SDS裂解法DNA提取的方法第五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六基因組DNA提取主要方法CTAB法適用于植物組織，真菌等

SDS法適用于動物組織，血液，細(xì)胞，細(xì)菌，酵母等第六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六CTAB法(植物DNA提取經(jīng)典法)原理CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。注：CTAB溶液在低于15℃時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時溫度不要低于15℃。第七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六

CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇

終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl

提供一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除基因組DNA－CTAB法第八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六

CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇

終濃度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖?；蚪MDNA－CTAB法第九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液第十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六植物基因組DNA提取試劑盒

緩沖液GP1緩沖液GP2去蛋白液GD洗脫緩沖液TE吸附柱CB2(20μg)收集管每個離心柱處理材料的量為鮮重：100mg干重：30mg第十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六SDS法

原理SDS陰離子去垢劑

高溫（55～65℃）裂解細(xì)胞，蛋白變性，染色體離析高鹽(KAc或NH4Ac)或降低溫度（冰?。?/p>

使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提

乙醇沉淀水相中的DNA第十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClSDS

終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)SDS提取緩沖液的配方Tris-HCl（pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl

提供一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；SDS裂解細(xì)胞，使蛋白變性，染色體離析；第十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六動物組織細(xì)胞裂解液上層溶液抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液組織勻漿SDS法流程圖第十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒病毒基因組提取試劑盒酵母基因組DNA提取試劑盒

CB2：20(μg)SDS提取試劑盒第十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒

1－5ml細(xì)菌菌液/離心柱10-40μg

血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒全血

100μl－1ml3-30μg動物細(xì)胞培養(yǎng)液106－107cells5-30μg動物組織30mg10-30μg病毒基因組提取試劑盒

DNARNA酵母基因組DNA提取試劑盒

Lyticase(20U/μg）不同材料對SDS提取試劑盒提取量第十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六96血液基因組DNA試劑盒

一次實驗可提取96個樣品，快捷、方便。不同材料對SDS提取試劑盒提取量第十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六基因組DNA－其它裂解方法

根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠、超聲波、研磨、凍融化學(xué)方式：異硫氰酸胍、堿裂解生物方式：酶法第十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六基因組DNA純化的方法

吸附材料結(jié)合法：吸附材料純化原理硅質(zhì)材料高鹽低pH值結(jié)合核酸低鹽高pH值洗脫陰離子交換樹脂低鹽高pH值結(jié)合核酸高鹽低pH值洗脫磁珠磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的第十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六硅基質(zhì)膜(離心柱型)DNA產(chǎn)物純化試劑盒超薄普通大量寡核苷酸96CB1CB2CB3CB2CB25μg20μg40μg20μg20μg100bp-40kp100bp-40kp100bp-40kp20bp-10kb100bp-40kp第二十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六質(zhì)粒DNA提取TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.第二十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六

堿裂解法煮沸法第二十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六堿裂解法原理

染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。第二十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液上層溶液抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀質(zhì)粒DNA溶液第二十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六離心柱型質(zhì)粒DNA提取試劑盒小提小提中量大提高純度小提高純度小提中量無內(nèi)毒素小提酵母1－5ml5-15ml100-200ml1-5ml5-15ml1－5ml1－5mlCB3CB4CB5CB3CB4CB3CB340μg70μg1000μg40μg70μg40μg40μg去蛋白液去蛋白液去內(nèi)毒素樹脂去蛋白液Lyticase第二十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六96系列96高純質(zhì)粒小提試劑盒96快速質(zhì)粒小提試劑盒96個樣品96個樣品去蛋白液CB3(40μg)異丙醇或者酒精沉淀第二十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六細(xì)胞器DNA提取TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.第二十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六細(xì)胞器DNA

線粒體葉綠體差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。第二十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步驟第二十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六

基因組DNA新鮮材料，低溫保存血液基因組DNA提取選擇有核細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長含病毒的液體材料提取前先富集

質(zhì)粒DNA對數(shù)期的菌體培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力低拷貝或大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步驟第三十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六

基因組DNA材料過多影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠

質(zhì)粒DNA菌體量適當(dāng)，除凈培養(yǎng)基變性的時間不要過長（5分鐘）控制復(fù)性時間，避免基因組DNA的污染G＋菌、酵母細(xì)胞酶或機(jī)械處理材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步驟第三十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六采用吸附材料吸附分離DNA，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)溶劑（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分而輕柔的混勻離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步驟第三十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑（SDS、異硫氰酸胍等）蛋白酶處理材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步驟第三十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六多糖的去除：多糖水解酶在提取緩沖液中加1/2體積氯苯，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步驟第三十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六多酚的去除：加入還原劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG，可防止酚類與DNA的結(jié)合鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步驟第三十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六預(yù)冷的乙醇或異丙醇更充分沉淀加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存

若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解

pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解DNA提取基本步驟第三十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六問題一：DNA降解材料不新鮮、反復(fù)凍融或細(xì)胞衰老提取操作過于劇烈，DNA被打斷外源核酸酶污染低溫保存，避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液增加裂解液中螯合劑的含量細(xì)胞裂解后操作應(yīng)盡量輕柔試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌DNA分裝保存于緩沖液，避免反復(fù)凍融第三十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六問題二：DNA樣品不純DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）第三十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六實驗材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時DNA丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁高溫裂解時，時間適當(dāng)延長（對于動物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長沉淀時間加輔助物，促進(jìn)沉淀洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒問題三：DNA提取量少第三十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六RNA提取

及常見問題分析TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.第四十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六

RNA提取相關(guān)知識及注意事項

RNA提取方法

RNA提取常見問題分析第四十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六

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個細(xì)胞10μg30mg動物組織，

30-100mg植物組織rRNA占80－85％mRNA占1-5%AAAAAA細(xì)胞中RNA的含量AAAAAAtRNAmRNArRNARNAase第四十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六mRNA的應(yīng)用RT-PCR,Northern雜交，cDNA文庫構(gòu)建

mRNA末端快速擴(kuò)增(RACE)，差異表達(dá)(DDRT-PCR)，引物延伸反應(yīng)，體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)記，RNA酶保護(hù)試驗，RNA微注射(RNAMicroinjection)第四十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六

RNA的不穩(wěn)定性內(nèi)因：核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，易被水解外因：內(nèi)源、外源RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活性，不易失活第四十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六常用的RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯（DEPC）與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑

異硫氰酸胍目前是最有效的RNA酶抑制劑，裂解組織的同時也使RNA酶失活。第四十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六RNasin

從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白?？梢院投喾NRNA酶結(jié)合，使其失活氧釩核糖核苷復(fù)合物由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性

SDS、尿素、硅藻土等常用的RNA酶抑制劑第四十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六RNAsafeRNA酶抑制劑第四十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六提取RNA的注意事項

經(jīng)常更換新手套。皮膚和實驗室用品上可能有RNase，會導(dǎo)致RNase污染塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡4-10小時，再滅菌玻璃器皿可在180℃烘烤4小時塑料制品和槍頭避免交叉污染第四十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六RNA提取相關(guān)知識及注意事項

RNA提取方法

RNA提取常見問題分析第四十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六異硫氰酸胍/苯酚法細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離第五十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六動植物材料研磨或勻漿細(xì)胞裂解基因組DNA水相有機(jī)相RNA氯仿純化pH5.7離心加入裂解液(TRNzol)RNA提取流程示意圖第五十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六等體積異丙醇沉淀70％乙醇洗滌沉淀晾干溶解RNA吸附柱去蛋白液漂洗洗脫水相RNA傳統(tǒng)方法：有機(jī)溶劑抽提，得率高柱純化法：純度高，無有機(jī)溶劑RNA提取流程示意圖第五十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六TRNzol(DP405)RNAprep(DP401)RNAultra(DP406)RNAprep(DP402)RNAplant(DP407)普遍適用動物組織富含多糖和酚類的植物組織50-100mg/500μl30-100mg/離心柱30-100mg/離心柱50-100mg/1ml可選擇的RNA提取產(chǎn)品第五十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期六材料準(zhǔn)備TRNzol裂解細(xì)胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱純化RNA溶解保存植物組織選取雜質(zhì)少生長較快的幼嫩部位培養(yǎng)細(xì)胞除盡培養(yǎng)液消化系統(tǒng)的組織選取雜質(zhì)少的部位細(xì)菌和酵母需要破壁處理樣品切成小塊投入液氮或?qū)ｉT的RN