菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測定演示文稿

菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測定演示文稿當(dāng)前第1頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)測定當(dāng)前第2頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)主要內(nèi)容菌落總數(shù)測定大腸菌群測定MPN法原理（拓展內(nèi)容）當(dāng)前第3頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)菌落總數(shù)測定掌握菌落總數(shù)測定方法實(shí)驗(yàn)原理 不同稀釋度的樣品，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，36℃，48h（水產(chǎn)品30℃，72h），菌落數(shù)當(dāng)前第4頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)菌落總數(shù)測定器材與試劑：樣品，無菌生理鹽水，平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，1ml吸管，培養(yǎng)皿當(dāng)前第5頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)菌落總數(shù)測定當(dāng)前第6頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)傾注培養(yǎng)當(dāng)前第7頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)培養(yǎng)結(jié)果當(dāng)前第8頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)菌落總數(shù)測定實(shí)驗(yàn)步驟

5.菌落計(jì)數(shù)：肉眼觀察，可用放大鏡，可標(biāo)記必要時(shí)分區(qū)計(jì)數(shù)，菌落成片者作廢計(jì)算方法某稀釋度的菌落數(shù)：兩平板菌落數(shù)取平均值選擇菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度（1）僅有一個(gè)稀釋度在此范圍：菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)當(dāng)前第9頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)菌落總數(shù)測定計(jì)算方法：（2）有兩個(gè)稀釋度在30-300之間菌落數(shù)之比>2，選較小值菌落數(shù)之比<2，取平均值（3）所有稀釋度均>300

取稀釋倍數(shù)最大者（4）所有稀釋度均<30

取稀釋倍數(shù)最小者（5）沒有任何稀釋度在30-300之間選最接近該范圍者結(jié)果單位：CFU/ml（g）當(dāng)前第10頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)菌落總數(shù)測定注意事項(xiàng)：

1.無菌操作

2.標(biāo)記

3.何時(shí)更換吸管

4.吸吹混勻

5.瓊脂培養(yǎng)基保溫

6.安全常識當(dāng)前第11頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)大腸菌群數(shù)測定實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理

36℃，48h，產(chǎn)氣（小倒管）三步法：初發(fā)酵、復(fù)發(fā)酵器材與試劑樣品、無菌生理鹽水、LST肉湯，BGLB肉湯

1ml吸管、10ml吸管、試管、小倒管當(dāng)前第12頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)初發(fā)酵器材與試劑樣品、225ml無菌生理鹽水、9ml無菌生理鹽水、雙料LST肉湯，單料LST肉湯，10ml吸管、1ml吸管、吸球當(dāng)前第13頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)大腸菌群數(shù)測定實(shí)驗(yàn)步驟：

1.初發(fā)酵

當(dāng)前第14頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)當(dāng)前第15頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)當(dāng)前第16頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)吸取樣品方法當(dāng)前第17頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)加注樣品當(dāng)前第18頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)初發(fā)酵結(jié)果右邊為陽性結(jié)果，小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生。當(dāng)前第19頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)實(shí)驗(yàn)步驟

3.復(fù)發(fā)酵（1）選取產(chǎn)氣試管（2）接種至10mlBGLB肉湯中（3）培養(yǎng)：36℃，48h

（4）觀察指標(biāo)：若產(chǎn)氣則報(bào)告大腸菌群陽性。當(dāng)前第20頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)大腸菌群數(shù)測定實(shí)驗(yàn)步驟

2.分離培養(yǎng)（1）制備伊紅美藍(lán)平板：

45℃，無菌，傾注，15ml

（2）選產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管（3）接種至伊紅美藍(lán)平板分區(qū)劃線法（4）培養(yǎng)：36℃，48h當(dāng)前第21頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)分離培養(yǎng)器材與試劑初發(fā)酵結(jié)果（4只發(fā)酵管）、酒精燈、接種環(huán)、伊紅美蘭平板培養(yǎng)基當(dāng)前第22頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)當(dāng)前第23頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)分區(qū)劃線法操作要點(diǎn)

1.劃下一個(gè)區(qū)前必須滅菌接種環(huán)

2.劃線時(shí)接種環(huán)同平板呈30-40°角

3.每次劃線應(yīng)該壓到上一個(gè)區(qū)域的2-3條線

4.用接種環(huán)的“面”而不是“弧”在平板上滑動(dòng)當(dāng)前第24頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)大腸菌群數(shù)測定實(shí)驗(yàn)步驟

2.分離培養(yǎng)：

（5）菌落特征：深紫黑色、有金屬光澤紫黑色、無或略有金屬光澤淡紫紅色、中心顏色深（6）革蘭染色、鏡檢：選特征菌落當(dāng)前第25頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)革蘭染色法器材與試劑結(jié)晶紫、盧戈碘液、95%乙醇、酸性復(fù)紅、生理鹽水、酒精燈、載玻片、濾紙當(dāng)前第26頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)革蘭染色法涂片：接種環(huán)，挑取菌落，生理鹽水一滴，涂勻熱固定：通過火焰若干次初染：結(jié)晶紫一滴，1min，水洗媒染：盧戈碘液一滴，1min，水洗脫色：95%乙醇，30s或至無色為止復(fù)染：復(fù)紅一滴，30s當(dāng)前第27頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)涂片當(dāng)前第28頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)熱固定當(dāng)前第29頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)初染當(dāng)前第30頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)媒染當(dāng)前第31頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)脫色當(dāng)前第32頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)復(fù)染當(dāng)前第33頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)革蘭氏染色陰性革蘭氏染色陽性革蘭染色法當(dāng)前第34頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)復(fù)發(fā)酵器材與試劑培養(yǎng)24小時(shí)后的伊紅美蘭平板、酒精燈、接種環(huán)、復(fù)發(fā)酵管當(dāng)前第35頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)大腸菌群數(shù)測定實(shí)驗(yàn)步驟

3.復(fù)發(fā)酵（1）選取鑒定為無芽孢G-桿菌的菌落1-3個(gè)（2）接種至10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（3）培養(yǎng)：37℃，24h

（4）觀察指標(biāo)：產(chǎn)酸，產(chǎn)氣當(dāng)前第36頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)液體接種當(dāng)前第37頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)復(fù)發(fā)酵復(fù)發(fā)酵陽性結(jié)果，培養(yǎng)基變成黃色，小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生當(dāng)前第38頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)大腸菌群數(shù)測定注意事項(xiàng)：

1.無菌操作

2.吸管使用

3.洗去染液的方法

4.顯微鏡保養(yǎng)

5.液體接種當(dāng)前第39頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)MPN法原理MPN法（MostProbableNumberMethod）目的：對某種細(xì)菌進(jìn)行選擇性計(jì)數(shù)核心思想：泊松分布實(shí)施方法：多次稀釋直至無菌，每個(gè)稀釋度分別接種若干培養(yǎng)管，根據(jù)陽性管數(shù)估算MPN值當(dāng)前第40頁\共有41頁\編于星期三\14點(diǎn)MPN法原理MPN法（MostProbableNumberMethod）1.細(xì)菌進(jìn)入發(fā)酵管的概率近