淺論34株多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥性及β內(nèi)酰胺酶基因分析

淺論34株多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥性及β內(nèi)酰胺酶基因分析【摘要】目的：對34株多重耐藥銅綠假單胞菌的藥敏結(jié)果和β內(nèi)酰胺酶基因進行分析，以指導臨床合理用藥。方法：用KB法對銅綠假單胞菌進行常規(guī)藥敏試驗，選取34株多重耐藥銅綠假單胞菌，并用PCR擴增方法檢測其β內(nèi)酰胺酶基因：TEM，SHV，PER，VEB。結(jié)果：34株多重耐藥銅綠假單胞菌對12種常用抗生素的耐藥率為%～100%，PCR檢測出TEM為%，SHV為%，VEB為%，PER為0%。結(jié)論：我院多重耐藥銅綠假單胞菌攜帶的β內(nèi)酰胺酶基因以TEM為主。

【關(guān)鍵詞】銅綠假單胞菌；β內(nèi)酰胺酶；多重耐藥

［Abstract］Objective:ToinvestigatedrugresistancepatternandβlactamasegenicofmultidrugresistantPseudomonasaeruginosa,soastoprovidereferenceforreasonableselectionofantimicrobials.Methods：Antimicrobialsusceptibilitywasevaluatedbydiskdiffusiontest(KBmethod).Theβlactamasegenes:TEM,SHV,VEB,PERcarriedonmultidrugresistantPseudomonasaeruginosaweredetectedbypolymerasechainreactionmethod(PCR).Results：Theresistantratesof34strainsmultidrugPseudomonasaeruginosato12kindsofantimicrobialswerefrom%to100%.ThepositiverateofβlactamasegenesTEM,SHV,VEB,PERexpressionwas%(15/34),%(4/34),%(2/34),and0%.Conclusion：TEMtypeβlactamasewasthemaintypeofPseudomonasaeruginosageneinourhospital.

［Keywords］Pseudomonasaeruginosa;βlactamase;multidrugresistant

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)廣泛分布于自然界，是臨床常見的條件致病菌之一，常引起肺部、泌尿系及燒傷創(chuàng)面感染。近年來PA在醫(yī)院感染分離菌的分離率居首位，其耐藥率不斷升高，對多種抗生素表現(xiàn)出固有或獲得性耐藥，對3類或3類以上抗菌藥表現(xiàn)耐藥的多重耐藥(multidrugresistant，MDR)的PA不斷增加［1-5］。為了使臨床能有效控制感染，對多重耐藥菌耐藥特征的研究成了人們關(guān)注的熱點?，F(xiàn)對我院2005年1月～2007年12月間部分多重耐藥PA的耐藥性及β內(nèi)酰胺酶基因進行分析，報告如下。

1材料和方法

材料

實驗菌株的收集與篩選

收集2005年1月～2007年12月我院臨床微生物科分離所得的PA，利用KB法篩選出多重耐藥的菌株。根據(jù)NCCLS2005年標準進行敏感、中敏、耐藥的判斷，3類或3類以上抗菌藥物耐藥的菌株判為多重耐藥PA。銅綠假單胞菌ATCC27853作為質(zhì)控菌。共收集了34株，其中痰標本19株、尿標本2株、其他標本13株。全部細菌用法國生物梅里埃公司API鑒定系統(tǒng)鑒定到種。

儀器和材料

溫箱、低溫冰箱、PCR擴增儀和電泳儀等。MullerHinton(MH)瓊脂為OXOIDE公司產(chǎn)品。

抗菌藥物紙片

氨曲南(ATM)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)、頭孢哌酮、亞胺培南(IPM)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、環(huán)丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)、妥布霉素、磺胺甲惡唑/甲氧芐氨嘧啶(SXT)，均購自中國藥品生物制品檢定所。

方法

藥敏

根據(jù)NCCLS2005年標準，用KB法對銅綠假單胞菌進行常規(guī)藥敏試驗。

PCR檢測細菌β

內(nèi)酰胺酶基因檢測模板提?。禾艏兣囵B(yǎng)細菌菌落少許置入50μl滅菌水中，置100℃水浴10min，8000r/min30s，上清液即為DNA模板液。

根據(jù)文獻［6］和基因庫檢索，設(shè)計引物序列

TEMP1：5′GAGTATTCAACATTTCCGTGTC3′，

TEMP2：5′TAATCAGTGAGGCACCTATCTC3′，擴增產(chǎn)物為535bp；

SHVP1：5′TGGTTATGCGTTATATTCGCC3′，

SHVP2：5′GCTTAGCGTTGCCAGTGCT3′，擴增產(chǎn)物為865bp；

PERP1：5′ATGAATGTCATTATAAAAGC3′，

PERP2：5′AATTTGGGCTTAGGGCAGAA3′，擴增產(chǎn)物為978bp；

VEBP1：5′CGACTTCCATTTCCCGATGC3′，

VEBP2：5′GGACTCTGCAACAAATACGC3′，擴增產(chǎn)物為961bp。引物由上海生工生物工程公司合成。

反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液μl，dNTP2μl，P1和P2各μl，TaqDNA聚合酶1U，擴增模板液μl，反應(yīng)體系25μl。熱循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min，然后按94℃1min→55℃45s→72℃1min，共35個循環(huán)；取反應(yīng)管內(nèi)液體5μl與1μl電泳指示劑混勻，點樣于%瓊脂糖凝膠，以100V電壓電泳30min后，EB染色，在紫外光下觀察結(jié)果。

2結(jié)果

34株多重耐藥PA藥敏結(jié)果

34株多重耐藥PA對12種常用藥物的耐藥率由%至100%，具體結(jié)果見表1。表134株多重耐藥PA對12種常用藥物的藥敏結(jié)果

PCR結(jié)果

PCR結(jié)果顯示，34株多重耐藥PA中，TEM陽性為14株，陽性率為%；SHV陽性4株，陽性率％；VEB陽性2株，陽性率％；PER陽性率0％。其中有3株同時攜帶SHV和TEM基因。

3討論

多重耐藥PA感染是臨床抗感染治療的難點之一，根據(jù)對本院近年來分離到的PA藥敏結(jié)果分析，3類或3類以上抗菌藥物耐藥的PA感染已呈上升趨勢。從藥敏結(jié)果中可以看到，34株多重耐藥PA對12種臨床常用抗生素的耐藥率在%～100%，對β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類均顯示出較高的耐藥性。第三代頭孢中頭孢他啶是經(jīng)典的抗PA藥物，但耐藥菌株增加迅速，本研究顯示其耐藥率達到50%，亞胺培南的耐藥率也達到了%，對一些常規(guī)藥物幾乎全部耐藥，符合多重耐藥的特征。

由于PA耐藥率的不斷升高，耐藥機制復雜，以及細菌耐藥存在區(qū)域性差異，對多重耐藥菌耐藥特征的研究成了人們關(guān)注的熱點［7-9］。研究認為，PA對β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機制是產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶和膜泵出系統(tǒng)的相互作用。β內(nèi)酰胺酶是細菌產(chǎn)生的酶類,能夠破壞滲透入菌體內(nèi)的β內(nèi)酰胺類抗生素的活性。β內(nèi)酰胺酶種類很多，特性各樣，按分子生物學分類，可以分為A～D4類［10，11］，除B類為金屬酶外，其他3類的活性位點均為絲氨酸殘基。本研究利用PCR方法檢測了多重耐藥PA攜帶的A類β內(nèi)酰胺酶基因：TEM，SHV，PER，VEB。TEM和PER是由質(zhì)粒介導的，攜帶TEM的PA對所有的抗假單胞菌的β內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗生素耐藥，PER被認為是一組新的A類β內(nèi)酰胺酶基因，決定可轉(zhuǎn)移的對氧亞氨基頭孢菌素、氨曲南的耐藥性。結(jié)果顯示，在34株多重耐藥PA中，TEM的檢出率達到了%，但沒有檢測出PER，說明我院的多重耐藥PA攜帶的β內(nèi)酰胺酶基因型以TEM為主。

SHV和VEB通常是由轉(zhuǎn)坐子或整合子介導的，常在其他腸桿菌科的細菌中檢出。本組34株多重耐藥PA中，4株攜帶SHV基因，2株攜帶VEB基因，兩者之間沒有重疊。有3株同時攜帶SHV和TEM基因，說明PA可以同時攜帶多種β內(nèi)酰胺酶基因，與其他文獻報道相符［9］。

PA作為一種常見的條件致病菌，其耐藥菌株有隨著抗菌藥物使用頻率的增加而逐年增多的趨勢。PA的耐藥現(xiàn)狀不容樂觀，目前NCCLS/CLSI推薦的超廣譜β內(nèi)酰胺酶的表型初篩及確證實驗不適合檢測PA是否產(chǎn)ESBLs，用分子生物學的方法可以很好地分析PA中的耐藥基因型，為臨床工作者更好地控制PA感染和使用抗菌藥物提供了依據(jù)，同時，也有利于加強實驗室對院內(nèi)感染菌的監(jiān)控。

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