western blot注意事項(xiàng)及常見問(wèn)題分析解決

ActiveActiveProteinWesternBlot常見問(wèn)題本文主要介紹了westernblot實(shí)驗(yàn)常見問(wèn)題分析，從雜帶多，背景高等方面入手，幫助我們更好的解決western實(shí)驗(yàn)相關(guān)問(wèn)題。摘自原文 /material-Westernblot實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：據(jù)nbt驗(yàn)理知通電的用蛋到VDF上如在過(guò)中任通VDF般按以順序綿層紙VDFD-GE膠層紙綿墊，緊這VDF轉(zhuǎn)膜前PVDF，5mn3（。Westernblot膜封閉不夠——，一般建議脫脂牛奶封閉60min左右（輕搖晃25ml3ul次孵育完畢收集孵育液，-20收藏，可連續(xù)用三次(單獨(dú)使用的二抗?jié)舛?:5000）一，二抗孵育的溫度偏高——室溫?fù)u床輕輕震蕩封閉60min或4℃過(guò)檢測(cè)時(shí)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)——減少時(shí)間，選擇合適方Westernblot（一抗特異性不高——重新選擇或高特異性的抗體Westernblot檢測(cè)樣本不表達(dá)目的蛋白——選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，用于確定檢測(cè)樣本是否為抗不識(shí)測(cè)種的關(guān)白——抗前當(dāng)真讀體明書確其否夠叉識(shí)一抗孵育時(shí)間不足——室溫?fù)u床輕輕震蕩封閉60min或4洗膜過(guò)度——洗膜時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，建議洗膜緩沖液加入0.1%Tween-20Westernblot反白（條帶顯白色）WesternblotTBSPBS化中進(jìn)行陰離子交換層析，陽(yáng)離子緩沖液首選TBS；陽(yáng)離子交換層析時(shí)，陰離子緩沖液則首選PBS。Westernblot中使用TBS和PBS均可，只是要根據(jù)需要選擇合適的濃度。通常情況下只加一種種一抗。做n在同一張膜上檢測(cè)目的蛋白和內(nèi)對(duì)照，也是先上目的蛋白的一ELELenVFCPVDFNC價(jià)格比較便宜，應(yīng)用較廣，結(jié)合牢固性PVDF差，韌性也不PVDF，不能重復(fù)使用，但蛋白電流不會(huì)通過(guò)膠和慮紙。轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過(guò)程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的，最后結(jié)束時(shí)一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般BufferWesternBlot陰子較常的特是基脫快背低測(cè)限可到.5μg考斯藍(lán)然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。S和快綠在檢測(cè)后容易從蛋白質(zhì)中除去，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞。不能用語(yǔ)正電賀的膠體金，靈敏度高，檢測(cè)范圍可到pg生物素化靈敏度位于1、2（NC以延長(zhǎng)高分子量蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度.%SS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；選用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)。太大時(shí)還可以考慮用瓊脂糖膠；提高WesternblotDABB顯色在辣根過(guò)氧化酶的作用下能形成一種灰褐色的產(chǎn)物，該產(chǎn)物難溶于醇和其他，B的氧化還能引起聚合作用，導(dǎo)致與四氧化鋨反應(yīng)而增加其染色強(qiáng)度和電子密度。堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶（底物顯色原性氮。WesternELISA一般來(lái)說(shuō)用于western的抗體主要識(shí)別氨基酸序列特異性