淺論烏司他丁對(duì)心肺復(fù)蘇后大鼠血清神經(jīng)元特異性-烯醇化酶的影響及作用

淺論烏司他丁對(duì)心肺復(fù)蘇后大鼠血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶的影響及作用【摘要】目的：探討心肺復(fù)蘇后大鼠血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶的變化、大腦皮層病理改變及烏司他丁的干預(yù)作用。方法：成年雄性SD大鼠120只，隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組、復(fù)蘇組、烏司他丁組，每組按氣管切開(kāi)后或自主循環(huán)恢復(fù)后、3、6、12h和24h分為5個(gè)亞組。復(fù)蘇組和藥物組采用窒息致大鼠心臟驟停和心肺復(fù)蘇模型，藥物組于ROSC后2min內(nèi)經(jīng)頸動(dòng)脈推注烏司他丁。對(duì)照組僅行麻醉、氣管切開(kāi)和血管穿刺。各組分別于各時(shí)間點(diǎn)取血和組織標(biāo)本，以ELISA法檢測(cè)血清NSE濃度，光鏡下觀察大腦皮層的病理改變。結(jié)果：與對(duì)照組比較，復(fù)蘇組和藥物組ROSC后各亞組各時(shí)間點(diǎn)血清NSE含量明顯升高；與復(fù)蘇組比較，藥物組ROSC后6、12、24h血清NSE含量顯著降低(P或P)。藥物組病理?yè)p害輕于復(fù)蘇組。結(jié)論：烏司他丁通過(guò)降低血清NSE濃度對(duì)心肺復(fù)蘇后腦損傷具有一定的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】心肺復(fù)蘇；神經(jīng)元特異性烯醇化酶；烏司他??；腦損傷

Abstract:Objective:Toinvestigatetheserumconcentrationofneuron-specificenolase(NSE)andthehistopathologicalchangesofcerebralcortexinasphyxiaratswithbolusulinastatinforinjectionaftercardiopulmonaryresuscitation(CPR).Methods：OnehundredandtwentymaleadultSDratswererandomlydividedinto3groups:sham-operationcontrolgroup，CPRgroupandUlinastatingroup.Eachgroupwasdividedinto5subgroups(n=8)byvariousintervals(at，3，6，12，24haftertracheotomyincontrolgrouporafterROSCinCPRgroupandulinastatingroup).AsphyxiationcardiacarrestandCPRmodelwasusedinCPRgroupandUlinastatingroup，withbolusulinastatinforInjection100000U/kgviaarteriacarotiswithin2minafterROSC.Anaesthesia，tracheotomyandvascularcentesiswereperformedinratswithoutasphyxiationinsham-operationgroup.Samplesweretakenateachintervalsofsubgroups.SerumlevelsofNSEweremeasuredwithenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA).Thepathologicalchangesofcortexwereobservedunderlightmicroscope.Results：TheserumlevelsofNSEelevatedsignificantlyafterROSCinCPRgroupandulinastatingroupthanthoseincontrolgroup(PorP).SerumNSEleveldecreasedat6，12and24hafterROSCinulinastatingroupcomparedwithCPRgroup(PorP).ThereweremilderpathologicalchangesinulinastatingroupthanthoseinCPRgroup.Conclusion：Ulinastatincanalleviatecerebralinjuryaftercardiopulmonaryresuscitationbydecreasingthelevelofserumneuron-specificenolase.

Keywords:cardiopulmonaryresuscitation；neuron-specificenolase；ulinastatin；cerebralinjury

神經(jīng)元特異性烯醇酶(neuronspecificenolase，NSE)是神經(jīng)元損傷的敏感性指標(biāo)，具有高度特異性。有研究表明血清NSE水平與心臟驟停后腦損傷程度密切相關(guān)，可作為評(píng)價(jià)腦損傷程度及預(yù)后的早期敏感指標(biāo)[1-3]。烏司他丁能減輕炎癥反應(yīng)，清除氧自由基，對(duì)腦損傷具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)采用窒息型大鼠心肺復(fù)蘇模型，觀察了大鼠CPR后血清NSE蛋白及腦組織病理改變及烏司他丁的干預(yù)作用，以進(jìn)一步明確烏司他丁對(duì)CPR后腦損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組成年雄性SD大鼠120只，體重300～400g，平均g，隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組、復(fù)蘇組、藥物組，再分別按氣管切開(kāi)后或自主循環(huán)恢復(fù)后、3、6、12、24h分為5個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只。術(shù)前禁食12h，自由飲水。

大鼠心肺復(fù)蘇模型制作及處理采用窒息法并加以改進(jìn)建立大鼠心肺復(fù)蘇模型。以5%水合氯醛g/kg腹腔注射誘導(dǎo)麻醉繼以g·kg-1·h-1補(bǔ)充麻醉。實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)計(jì)和記錄均參照復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)研究的Utstein模式。復(fù)蘇組和藥物組于呼氣末夾閉氣管插管，待大鼠心跳停止5min后開(kāi)放氣道，進(jìn)行CPR，并快速經(jīng)頸動(dòng)脈推注腎上腺素20μg/kg，出現(xiàn)自主心律、脈搏波且頸動(dòng)脈平均動(dòng)脈壓60mmHg并持續(xù)10min以上判斷為ROSC。藥物組在ROSC后2min內(nèi)經(jīng)頸動(dòng)脈推注烏司他丁100000U/kg，復(fù)蘇組推注等量生理鹽水。對(duì)照組動(dòng)物僅行麻醉和氣管插管、血管穿刺，不進(jìn)行夾管窒息及CPR。空調(diào)控制室溫23～26℃。各組大鼠體重、水合氯醛麻醉用量、基線血壓、腎上腺素用量等參數(shù)比較，差異均無(wú)顯著性(均P)。

血清NSE蛋白含量測(cè)定按各分組時(shí)間點(diǎn)取大鼠頸動(dòng)脈血2mL，靜置后離心，取上清液于EP管，置于－70℃冰箱保存，待測(cè)。采用ELISA法測(cè)定血清NSE蛋白濃度，試劑盒購(gòu)自美國(guó)USCNLIFE公司，測(cè)定步驟嚴(yán)格按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

大腦枕葉皮層組織病理觀察各時(shí)間點(diǎn)取血后大鼠活去腦，取左側(cè)枕葉皮層約5mm×5mm大小組織塊，置于10%福爾馬林中固定24h后，脫水、包埋，常規(guī)石蠟切片，片厚4μm，HE染色，脫水，封片后光鏡觀察并照相。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用單因素方差分析，方差齊性用Levene檢驗(yàn)。

2結(jié)果

各組血清NSE蛋白含量變化與對(duì)照組比較，復(fù)蘇組和藥物組ROSC后h起血清NSE蛋白含量即開(kāi)始升高，至24h各時(shí)間點(diǎn)一直呈持續(xù)上升趨勢(shì)，差異均有顯著性；與復(fù)蘇組相比，藥物組ROSC后6、12、24h顯著降低(或)。

大腦枕葉皮層組織病理改變光鏡下，對(duì)照組神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞大小正常，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，錐體細(xì)胞突起明顯，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰；復(fù)蘇組ROSC后12h神經(jīng)元固縮、深染，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞周?chē)障睹黠@增大，膠質(zhì)細(xì)胞周?chē)g隙擴(kuò)大，空泡樣改變，血管周?chē)g隙擴(kuò)大；藥物組ROSC后12h腦組織病理改變要輕于復(fù)蘇組，神經(jīng)元大小基本正常，形態(tài)及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)模糊，膠質(zhì)細(xì)胞輕度水腫，細(xì)胞和血管周?chē)障队性龃蟆?/p>

3討論

近年來(lái)，隨著心肺復(fù)蘇技術(shù)的進(jìn)步和藥物的不斷更新，心肺復(fù)蘇的成功率有所提高，但最終的出院生存率仍然為2%～14%，主要原因是心肺驟停后所引起的腦損害。心肺復(fù)蘇的本質(zhì)就是全身組織器官的缺血再灌注損傷，而腦組織對(duì)缺血低氧最敏感。心肺驟停后血流中斷啟動(dòng)了腦損害，循環(huán)恢復(fù)后腦組織又經(jīng)歷了無(wú)復(fù)流期、反應(yīng)性充血期、延遲性低灌注期，這是腦缺血低氧損害的最重要階段，此期可持續(xù)2～12h。本實(shí)驗(yàn)見(jiàn)光鏡下ROSC12h后皮層神經(jīng)元固縮、深染，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞周?chē)障睹黠@增大，膠質(zhì)細(xì)胞周?chē)g隙擴(kuò)大，空泡樣改變，血管周?chē)g隙擴(kuò)大，提示ROSC12h腦組織損傷達(dá)到一高峰。

NSE是糖酵解過(guò)程中烯醇化酶的同工酶，特異性分布于神經(jīng)元及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，是神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物。正常情況下，腦脊液和血清中有少量的NSE存在。當(dāng)腦缺血、低氧、中毒或創(chuàng)傷時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞膜的完整性受到破壞，且血腦屏障的通透性增加，NSE蛋白會(huì)泄漏到血清或腦脊液中，含量出現(xiàn)明顯變化。研究表明，血清NSE水平同腦脊液NSE水平存在高度相關(guān)性，故檢測(cè)血清NSE可確切反映腦組織的損傷程度，且可用作評(píng)價(jià)CPR后腦損傷的早期診斷指標(biāo)，并可預(yù)測(cè)心肺復(fù)蘇患者腦損傷程度[10]以及出院生存率和神經(jīng)功能恢復(fù)情況[11-12]。本實(shí)驗(yàn)觀察到ROSCh后血清NSE濃度明顯升高，3、6、12、24h持續(xù)升高，提示ROSCh后神經(jīng)元細(xì)胞已有破壞，隨著再灌注時(shí)間的推移，神經(jīng)元損傷增多，釋放NSE進(jìn)入外周血亦隨之增多。此外，從變化趨勢(shì)看，ROSC后h，NSE蛋白在血清中的含量隨時(shí)間的推移而逐漸增高，病理切片上神經(jīng)細(xì)胞損傷的情況也逐漸加重，但血清學(xué)的變化更為敏感。因此，血清NSE蛋白的動(dòng)態(tài)變化可以較好地反映出神經(jīng)細(xì)胞損傷情況。

烏司他丁是一種廣譜的水解酶抑制劑，能抑制炎癥遞質(zhì)的過(guò)度釋放，清除氧自由基，減輕再灌注損傷，半衰期為40min，給藥后6h給藥量的24%從尿中排泄。我們已研究證明，烏司他丁可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL-6、IL-10)等炎性細(xì)胞因子的水平對(duì)大鼠心肺腦復(fù)蘇后腦損傷起到一定的保護(hù)作用[13]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，藥物組血清NSEROSC后6、12、24h較復(fù)蘇組顯著減低，光鏡示，與復(fù)蘇組比較，藥物組ROSC后12h皮層神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞及血管間隙變窄，提示烏司他丁可能通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞及微粒體膜，清除氧自由基，減輕血腦屏障通透性，降低血清NSE水平，減輕缺血低氧對(duì)腦組織的損害。ROSC后24h復(fù)蘇組與藥物組大腦枕葉皮層組織病理改變差別不明顯，考慮與烏司他丁半衰期有關(guān)，但最適宜的給藥時(shí)間有待進(jìn)一步研究。

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