分子遺傳學(xué)復(fù)制詳解演示文稿

分子遺傳學(xué)復(fù)制詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有60頁\編于星期三\0點優(yōu)選分子遺傳學(xué)復(fù)制當(dāng)前第2頁\共有60頁\編于星期三\0點雙螺旋模型的提出，預(yù)示了DNA的半保留復(fù)制機(jī)制。對于DNA復(fù)制，必須了解其起始、過程、終止、酶學(xué)、類型和單位。當(dāng)前第3頁\共有60頁\編于星期三\0點第一節(jié)復(fù)制原點、方向、方式和基本單位當(dāng)前第4頁\共有60頁\編于星期三\0點一、復(fù)制原點

DNA復(fù)制必須在特定的位置開始，這樣的位置稱為復(fù)制原點。大腸桿菌只有一個復(fù)制原點（oriC），它包含4個dnaA盒：dnaA蛋白結(jié)合的位點1個富含A/T區(qū)：呼吸作用強(qiáng)烈的區(qū)段真核生物染色體具有許多復(fù)制原點，它們都有一個富含A-T的自動復(fù)制序列（ARS）元件，其共有序列為：(A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T)。被原點識別復(fù)合體（ORC）所識別。當(dāng)前第5頁\共有60頁\編于星期三\0點大腸桿菌的復(fù)制原點序列當(dāng)前第6頁\共有60頁\編于星期三\0點二、復(fù)制方向

DNA復(fù)制的方向是指復(fù)制叉移動的方向。復(fù)制叉復(fù)制眼復(fù)制方向有3種方式：雙向復(fù)制（多數(shù)情況）單向復(fù)制不對稱雙向復(fù)制復(fù)制起點環(huán)狀DNA雙向復(fù)制形成的結(jié)構(gòu)當(dāng)前第7頁\共有60頁\編于星期三\0點大腸桿菌DNA復(fù)制的電鏡照片電鏡照片的模式圖當(dāng)前第8頁\共有60頁\編于星期三\0點對于環(huán)狀DNA，不論是雙向復(fù)制，還是單向復(fù)制，都會形成結(jié)構(gòu)?？梢杂梅派湫詷?biāo)記法來觀察鑒別復(fù)制方向：雙向復(fù)制：兩個復(fù)制叉都有放射活性單向復(fù)制：僅一個復(fù)制叉有放射活性雙向復(fù)制一般等速進(jìn)行，最終兩個復(fù)制叉在與原點相對的位置相遇而使復(fù)制結(jié)束。單向復(fù)制的終點就是復(fù)制原點。當(dāng)前第9頁\共有60頁\編于星期三\0點大腸桿菌有促使復(fù)制終止的序列，稱為ter位點，長度約23bp。已發(fā)現(xiàn)兩個終止區(qū)，位于交匯點兩側(cè)約100bp處。當(dāng)前第10頁\共有60頁\編于星期三\0點在雙向復(fù)制中，當(dāng)兩個復(fù)制叉因故不等速時，ter位點會迫使較快的復(fù)制叉停頓下來，等待較慢的復(fù)制叉，從而保證復(fù)制在終止區(qū)內(nèi)結(jié)束。每條單鏈的ter位點都結(jié)合上ter結(jié)合蛋白，從而阻止復(fù)制叉的通過。當(dāng)前第11頁\共有60頁\編于星期三\0點大腸桿菌DNA復(fù)制的整個過程當(dāng)前第12頁\共有60頁\編于星期三\0點真核生物的復(fù)制都是雙向的，且沒有固定的復(fù)制終點。當(dāng)前第13頁\共有60頁\編于星期三\0點通常復(fù)制原點是位于兩條鏈的同一處，因而兩條鏈的復(fù)制是對稱的。但哺乳動物線粒體DNA的兩條鏈的復(fù)制原點的位置不同，因而兩條鏈復(fù)制起始的位置和時間不同，造成不對稱雙向復(fù)制。重鏈（H）輕鏈（L）重鏈復(fù)制原點輕鏈復(fù)制原點取代環(huán)（D環(huán)）當(dāng)前第14頁\共有60頁\編于星期三\0點當(dāng)前第15頁\共有60頁\編于星期三\0點當(dāng)前第16頁\共有60頁\編于星期三\0點三、復(fù)制方式

DNA復(fù)制有兩種方式：

復(fù)制叉式復(fù)制：即在復(fù)制原點形成復(fù)制叉，其新鏈合成所需的引物是新合成的，故稱為從新開始。這是最常見的復(fù)制方式。滾環(huán)式復(fù)制：環(huán)狀DNA采取的一種復(fù)制方式。其新鏈合成無須合成引物，而是利用一條親鏈切斷后產(chǎn)生的3端，由此不斷延伸，合成出新鏈，故稱為共價延伸。新合成的鏈不斷從環(huán)中甩出，樣子猶如滾環(huán)。當(dāng)前第17頁\共有60頁\編于星期三\0點復(fù)制原點因負(fù)超螺旋而松纏，形成單鏈區(qū)，A蛋白切斷正鏈，并結(jié)合到5端上。以自由3端為引物，以負(fù)鏈為模板合成新鏈，并將正鏈置換出來。復(fù)制叉回到復(fù)制原點后，A蛋白切斷正鏈，結(jié)合到新的5端上，開始新一輪復(fù)制，釋放出的正鏈可作為模板合成負(fù)鏈。噬菌體X174的復(fù)制模式當(dāng)前第18頁\共有60頁\編于星期三\0點當(dāng)前第19頁\共有60頁\編于星期三\0點

許多噬菌體都采用滾環(huán)式復(fù)制。某些真核生物的卵母細(xì)胞中采用滾環(huán)式復(fù)制來擴(kuò)增rDNA（即rRNA基因），以滿足大量合成蛋白質(zhì)的需要。rDNA的每個重復(fù)單位先形成環(huán)狀DNA，然后開始復(fù)制。當(dāng)前第20頁\共有60頁\編于星期三\0點四、復(fù)制單位

DNA復(fù)制是以復(fù)制子（replicon）為單位進(jìn)行的。每個復(fù)制子應(yīng)包含一個復(fù)制原點，還可能包含一個復(fù)制終點。在每個細(xì)胞周期中，一個復(fù)制子只能被激活一次。一個原核生物的基因組就是一個復(fù)制子。每條真核生物的染色體包含許多復(fù)制子，相鄰復(fù)制原點間的平均距離就是復(fù)制子的平均長度。真核生物的復(fù)制子較短，且復(fù)制速度較慢。當(dāng)前第21頁\共有60頁\編于星期三\0點幾種生物復(fù)制子的數(shù)量、長度、復(fù)制速度當(dāng)前第22頁\共有60頁\編于星期三\0點第二節(jié)DNA復(fù)制有關(guān)的酶當(dāng)前第23頁\共有60頁\編于星期三\0點DNA復(fù)制主要涉及到5種酶DNA聚合酶DNA連接酶解旋酶（螺旋酶）旋轉(zhuǎn)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶II）引發(fā)酶當(dāng)前第24頁\共有60頁\編于星期三\0點一、DNA聚合酶

指能夠利用DNA模板合成DNA新鏈的酶，其中只有某些負(fù)責(zé)DNA的復(fù)制，又特稱為復(fù)制酶。大腸桿菌中有3種DNA聚合酶，分別記為polI、polII和polIII，其中polI和polII主要在DNA修復(fù)中發(fā)揮作用，polIII才是復(fù)制酶。當(dāng)前第25頁\共有60頁\編于星期三\0點DNA聚合酶有6個結(jié)合位點：(1)模板結(jié)合位點；(2)引物結(jié)合位點；(3)引物3‘－OH結(jié)合位點；(4)底物dNTP結(jié)合位點；(5)5‘→3’外切酶結(jié)合位點；(6)3'→5'校正位點。

當(dāng)前第26頁\共有60頁\編于星期三\0點DNA聚合酶以dNTP（N=A、T、G、C）為底物，根據(jù)模板鏈和堿基配對規(guī)則，催化正確的核苷酸的5位與正在合成的鏈的3端產(chǎn)生磷酸二酯鍵。當(dāng)前第27頁\共有60頁\編于星期三\0點DNA聚合酶催化DNA的合成必須提供3位的自由OH基，亦即需要一個引物。DNA聚合酶催化DNA的合成（亦即新鏈的延伸）只能朝53的方向。當(dāng)前第28頁\共有60頁\編于星期三\0點DNA聚合酶除了聚合功能外，還具有35外切酶活性。當(dāng)前第29頁\共有60頁\編于星期三\0點DNA聚合酶具有一種校對功能?？紤]堿基配對互作，錯配率預(yù)期為10-3，而細(xì)菌中實際為10-8~10-10。這主要歸功于校對功能。當(dāng)前第30頁\共有60頁\編于星期三\0點polI有很強(qiáng)的缺口（即DNA單鏈區(qū)）填補(bǔ)功能，可以對因DNA復(fù)制或損傷產(chǎn)生的缺口進(jìn)行填補(bǔ)，但最后會留下一個切刻（即填補(bǔ)的最后一個核苷酸的3位的OH不能與其后面原來存在的核苷酸的5位的磷酸根產(chǎn)生酯鍵）。

polI（又稱Klenow）還具有內(nèi)切酶和53外切酶活性，能產(chǎn)生切刻平移。該功能可用來對DNA進(jìn)行放射性標(biāo)記。當(dāng)前第31頁\共有60頁\編于星期三\0點當(dāng)前第32頁\共有60頁\編于星期三\0點哺乳動物中名稱與細(xì)菌的類比polIpolIIIpolII細(xì)胞中位置細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞核線粒體功能復(fù)制修復(fù)復(fù)制修復(fù)復(fù)制真核生物中的DNA聚合酶當(dāng)前第33頁\共有60頁\編于星期三\0點二、其它有關(guān)的酶

名稱功能DNA連接酶共價連接切刻（產(chǎn)生磷酸二酯鍵），將兩條不連續(xù)的單鏈連成整體。解旋酶解開雙鏈，使復(fù)制叉向前移動。旋轉(zhuǎn)酶產(chǎn)生負(fù)超螺旋，使雙鏈松纏，并消除復(fù)制叉移動時產(chǎn)生的正超螺旋。引發(fā)酶合成RNA引物。當(dāng)前第34頁\共有60頁\編于星期三\0點第三節(jié)復(fù)制起始和過程當(dāng)前第35頁\共有60頁\編于星期三\0點一、復(fù)制起始

以大腸桿菌為例第一步：在HU和IHF蛋白的協(xié)助下，DnaA蛋白與復(fù)制原點上的4個dnaA盒結(jié)合，使富含A/T區(qū)解開，暴露出兩條單鏈。當(dāng)前第36頁\共有60頁\編于星期三\0點第二步：在DnaA和DnaC蛋白的輔助下，DnaB蛋白（解旋酶）進(jìn)入單鏈區(qū)，并按53方向移動。當(dāng)前第37頁\共有60頁\編于星期三\0點第三步：隨著解旋酶的移動，單鏈區(qū)逐漸擴(kuò)大，引發(fā)酶和單鏈結(jié)合蛋白（SSB）遂與單鏈結(jié)合，這標(biāo)志著復(fù)制已經(jīng)啟動。當(dāng)前第38頁\共有60頁\編于星期三\0點當(dāng)前第39頁\共有60頁\編于星期三\0點二、復(fù)制過程

解旋酶打破氫鍵，在復(fù)制叉處解開雙鏈，SSB隨之結(jié)合到親本單鏈上，防止單鏈恢復(fù)成雙鏈。拓?fù)洚悩?gòu)酶（旋轉(zhuǎn)酶）位于解旋酶前方，消除由雙鏈解開而造成的正超螺旋。引發(fā)酶合成RNA引物，polIII隨之合成新鏈。

polI切除RNA引物，并將缺口填上。DNA連接酶將新合成的DNA鏈片段共價連接起來。注意：先導(dǎo)鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，而后隨鏈則需在暴露出一定長度的單鏈后沿相反方向合成，因而是間斷的。因此DNA合成是半連續(xù)的。當(dāng)前第40頁\共有60頁\編于星期三\0點DNA復(fù)制過程圖解當(dāng)前第41頁\共有60頁\編于星期三\0點第四節(jié)線形DNA末端的復(fù)制問題當(dāng)前第42頁\共有60頁\編于星期三\0點由于所有的DNA聚合酶都只能催化53方向的合成，因而造成線形DNA末端的復(fù)制問題。當(dāng)前第43頁\共有60頁\編于星期三\0點當(dāng)前第44頁\共有60頁\編于星期三\0點不同的生物有不同的解決辦法：

辦法一：將線形DNA環(huán)化。如：噬菌體。

辦法二：幾個線形DNA分子首尾連接形成多聚體（連環(huán)）分子。如：T7噬菌體。辦法三：利用特殊的蛋白質(zhì)從末端終止位點起始復(fù)制。如：腺病毒，噬菌體29。辦法四：利用可變末端。如：真核生物中的端粒結(jié)構(gòu)。當(dāng)前第45頁\共有60頁\編于星期三\0點末端蛋白大小為55kD，它通過絲氨酸殘基與DNA5端上的自由磷酸根共價結(jié)合當(dāng)前第46頁\共有60頁\編于星期三\0點末端蛋白還能與DNA聚合酶結(jié)合，并攜帶一個胞嘧啶作為復(fù)制起始的引物當(dāng)前第47頁\共有60頁\編于星期三\0點腺病毒依賴一種末端蛋白可以從平頭末端開始復(fù)制先對一條鏈進(jìn)行復(fù)制，新鏈取代舊鏈?zhǔn)怪尫懦鰜?。被取代出來的單鏈兩末端具有互補(bǔ)性，可以自配對形成雙鏈末端，于是復(fù)制可以啟動。當(dāng)前第48頁\共有60頁\編于星期三\0點真核染色體的端粒是一段由很短的重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，并存在一個單鏈的3末端。當(dāng)前第49頁\共有60頁\編于星期三\0點不同生物的端粒序列有一定的差異當(dāng)前第50頁\共有60頁\編于星期三\0點端粒的總體長度是受遺傳控制的。DNA復(fù)制時，端粒序列會縮短，但通過端粒酶，可以使端粒伸長，從而達(dá)到一種動態(tài)平衡。端粒酶是一種核酸蛋白復(fù)合體，含有RNA，可以作為合成端粒一條鏈的模板。因此，端粒酶是一種反轉(zhuǎn)錄酶。當(dāng)前第51頁\共有60頁\編于星期三\0點四膜蟲端粒的合成當(dāng)前第52頁\共有60頁\編于星期三\0點當(dāng)前第53頁\共有60頁\編于星期三\0點當(dāng)前第54頁\共有60頁\編于星期三\0點第五節(jié)真核生物核小體的復(fù)制當(dāng)前第55頁\共有60頁\編于星期三\0點復(fù)制中雙鏈解開時，核小體即解體。但雙鏈一旦合成，即組裝新的核小體。新核小體中的組蛋白是隨機(jī)組裝的，既包含舊的，也包含新合成的。當(dāng)前第56頁\共有60頁\編于星期三\0點實驗證據(jù)先將細(xì)胞培養(yǎng)在含重氨基酸的條件下產(chǎn)生重組蛋白。然后將細(xì)胞培養(yǎng)在含輕氨基酸的條件下進(jìn)行DNA復(fù)制。培養(yǎng)一段時間后，提取核小體八聚體，進(jìn)行梯度離心，預(yù)計可能有兩種結(jié)果：結(jié)果一：如果核小體不是重新組裝的，則將出現(xiàn)兩個分離的帶區(qū)，重的（下面）帶區(qū)為舊的核小體，輕的（上面）帶區(qū)為新的核小體。結(jié)果二：如果核小體是重新組裝的，則出現(xiàn)一個寬的連續(xù)變化的帶區(qū)，中間部分較多。實驗得到的