2葉綠體分離、離體葉綠體還原活性

個(gè)人收集整理資料，僅供溝通學(xué)習(xí)，勿作商業(yè)用途個(gè)人收集整理資料，僅供溝通學(xué)習(xí)，勿作商業(yè)用途8????8試驗(yàn)五葉綠體的分別、離體葉綠體的復(fù)原活性一、試驗(yàn)?zāi)康闹苽渚哂谢钚缘碾x體葉綠體和測(cè)定希爾反響活力是爭(zhēng)論葉綠體構(gòu)造功能和光合作用機(jī)理的重要技術(shù)條件。本試驗(yàn)通過(guò)學(xué)習(xí)分別制備葉綠體的技術(shù)方法，加深對(duì)希爾反響的理解及對(duì)光反響的生疏。二、試驗(yàn)原理光合作用機(jī)制是一個(gè)比較簡(jiǎn)潔的問(wèn)題，可分為光反響和暗反響，大致分為三大步驟：<1〕原初反響<光能的吸取、傳遞和轉(zhuǎn)換過(guò)程〕；<2〕電子傳遞和光合磷酸化<電能轉(zhuǎn)變?yōu)榛顫姷幕瘜W(xué)能〕；<3〕碳同化<活潑的化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的化學(xué)能〕。光反響中，由水至NADP+的電子傳遞是由兩個(gè)反響中心PSⅡ和PSPSⅡ的一個(gè)重要功能是利用光能使水裂解放氧。b5E2RGbCAP2H2O 光子 O2+4H++4e-英國(guó)生物化學(xué)家Hill<1937〕首先將離體葉綠體參與有適當(dāng)氫受體<如草酸高鐵鉀鹽，2,6-二氯酚靛酚，NAD+和NADP+〕的水溶液中，照光后即有O2放出，這就是水的光解，即希爾反響。p1EanqFDPw葉綠體的分別承受離心分級(jí)分別，即利用葉綠體的直徑和沉降系數(shù)與其他細(xì)胞器不同的特點(diǎn)，先用低速離心除去細(xì)胞碎片，后用高速離心沉降葉綠體。希爾反響活力的測(cè)定是將葉綠體參與氫受體，并照光，水被光解放氧，溶液顏色發(fā)生變化，通過(guò)比色測(cè)定。DXDiTa9E3d三、試驗(yàn)材料穎菠菜葉片。四、設(shè)備與試劑分光光度計(jì)，離心機(jī)，照光裝置<2500W〕，試管，移液管，燒杯，紗布，研缽等。0.35MNaCl溶液、0.01MTris溶液五、試驗(yàn)步驟1、離體葉綠體的制備：稱鮮菠菜葉5g，加10ml0.35MNaCl、1mlTris緩沖液、石英砂，研磨。勻漿用脫脂棉過(guò)濾。1000/53000/5去除上清液，保存沉淀。5ml0.35MNaCl，攪勻，得到葉綠體懸浮液。2、希爾反響活力的測(cè)定依據(jù)下面表格，取三支試管，分別進(jìn)展不同的操作。3620nm60cm管號(hào)0.1mlTris緩沖液葉綠體煮沸2.6-二氯吲哚叮酚19.3ml管號(hào)0.1mlTris緩沖液葉綠體煮沸2.6-二氯吲哚叮酚19.3ml0.2ml——0.5ml29.3ml0.2ml5min0.5ml39.8ml0.2ml————六、試驗(yàn)結(jié)果2管號(hào)12345123將所測(cè)光值記錄到上表，畫(huà)出曲線圖，并分析緣由。七、留意事項(xiàng)1、2.6-二氯吲哚叮酚必需在煮沸加熱后滴加。2、溶液參與比色杯就開(kāi)頭計(jì)時(shí)。3、每次測(cè)光時(shí)都應(yīng)調(diào)零和百分比。4、試管加熱時(shí)管口不要對(duì)準(zhǔn)他人。八、思考題1.試管中藍(lán)色褪去的緣由是什么?與光照有什么關(guān)系?2 ． 煮 沸 對(duì) 葉 綠 體 有 何 影 響 ？3．請(qǐng)對(duì)結(jié)果作出解釋。RTCrpUDGiT附錄1：離心機(jī)的構(gòu)造及使用離心機(jī)是利用離心力對(duì)混合液<含有固形物〕進(jìn)展分別和沉淀的一種專用儀器。試驗(yàn)室常用電動(dòng)低速離心機(jī)、高速離心機(jī)和低速、高速冷凍離心機(jī)，以及超速分析、制備兩用冷凍離心機(jī)等多種型號(hào)。其中以低速<包括大容量〕離心機(jī)和高速冷凍離心機(jī)應(yīng)用最為廣泛，是生化試驗(yàn)室用來(lái)分別制備生物大分子必不行少的重要工具。5PCzVD7HxA在試驗(yàn)過(guò)程中，欲使沉淀與母液分開(kāi)，常使用過(guò)濾和離心兩種方法。在下述狀況下，使用離心方法效果較好。沉淀有粘性或母液粘稠。沉淀顆粒小，簡(jiǎn)潔透過(guò)濾紙。沉淀量過(guò)多而疏松。沉淀量很少，需要定量測(cè)定?；蚰敢毫亢苌?，分別時(shí)應(yīng)削減損失。沉淀和母液必需快速分開(kāi)。一般膠體溶液。電動(dòng)低速離心機(jī)的根本構(gòu)造和性能低速離心機(jī)構(gòu)造較簡(jiǎn)潔，可分小型臺(tái)式和落地式兩類，配有驅(qū)動(dòng)電機(jī)、調(diào)速器、定時(shí)器等裝置，操作便利。低速離心機(jī)其轉(zhuǎn)速一般不超過(guò)4000rpm，臺(tái)式高速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速可達(dá)18000rpm。jLBHrnAILg離心機(jī)的一般使用規(guī)程1、離心前，先將離心的物質(zhì)轉(zhuǎn)移入適宜的離心管中，其量以距離管口1~2cm為宜，以免在離心時(shí)甩出。將離心管放入外套管中，在外套管與離心管間注入緩沖水，使離心管不易破損。xHAQX74J0X2、取一對(duì)外套管<內(nèi)已有離心管〕放在臺(tái)秤上平衡。如不平衡，可調(diào)整緩沖用水或離心物質(zhì)的量。將平衡好的套管放在離心機(jī)十字轉(zhuǎn)蓋。LDAYtRyKfE3、接通電源，開(kāi)啟開(kāi)關(guān)。4、待離心機(jī)自行停頓轉(zhuǎn)動(dòng)手，翻開(kāi)機(jī)蓋，取出離心樣品。5、將外套管、橡膠墊沖洗干凈，倒置枯燥備用。留意事項(xiàng)1、低速離心機(jī)要放在平坦和結(jié)實(shí)的地面或試驗(yàn)臺(tái)上，不允許傾斜。2、一年檢查一次電動(dòng)機(jī)的電刷及軸承磨損狀況，必要時(shí)更換電刷或軸承。3、關(guān)閉電源后，要等候離心機(jī)自動(dòng)停頓。不允許用手或其他物件迫使 離 心 機(jī) 停 轉(zhuǎn) 4、離心機(jī)應(yīng)接地線，以確保安全。 5、離心機(jī)啟動(dòng)后，如有不正常的噪音及振動(dòng)時(shí)，可能離心管裂開(kāi)或相對(duì)位置上的兩管重量不平衡，應(yīng)馬上關(guān)機(jī)處理。Zzz6ZB2Ltk2：721吸取光譜原理物質(zhì)中分子內(nèi)部的運(yùn)動(dòng)可分為電子的運(yùn)動(dòng)、分子內(nèi)原子的振動(dòng)和分子自身的轉(zhuǎn)動(dòng)，因此具有電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。當(dāng)分子被光照耀時(shí)，將吸取能量引起能級(jí)躍遷，即從基態(tài)能級(jí)躍遷到激發(fā)態(tài)能級(jí)。而三種能級(jí)躍遷所需能量是不同的，需用不同波長(zhǎng)的電磁波去激發(fā)。電子能級(jí)躍遷所需的能量較大，一般 在1eV～20eV，吸取光譜主要處于紫外及可見(jiàn)光區(qū)，這種光譜稱為紫外及可見(jiàn)光譜。假設(shè)用紅外線(能量為1eV～0.025eV>照耀分子，此能量缺乏以引起電子能級(jí)的躍遷，而只能引發(fā)振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷，得到的光譜為紅外光譜。假設(shè)以能量更低的遠(yuǎn)紅外線(0.025eV～0.003eV>照耀分子，只能引起轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷，這種光譜稱為遠(yuǎn)紅外光譜。由于物質(zhì)構(gòu)造不同對(duì)上述各能級(jí)躍遷所需能量都不一樣，因此對(duì)光的吸取也就不一樣，各種物質(zhì)都有各自的吸取光帶，因而就可以對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)展鑒定分析，這是光度法進(jìn)展定性分析的基礎(chǔ)。dvzfvkwMI1依據(jù)朗伯—比耳定律:當(dāng)入射光波長(zhǎng)、溶質(zhì)、溶劑以及溶液的溫度確定時(shí)，溶液的光密度和溶液層厚度及溶液的濃度成正比，假設(shè)液層的厚度確定，則溶液的光密度只與溶液的濃度有關(guān)，rqyn14ZNXIITε為摩爾消光系數(shù)，lEmxvxOtOco在待測(cè)物質(zhì)的厚度l確定時(shí)，吸光度與被測(cè)物質(zhì)的濃度成正比，這就是光度法定量分析的依據(jù)。分光光度計(jì)的構(gòu)造原理將一束復(fù)合光通過(guò)分光系統(tǒng)，將其分成一系列波長(zhǎng)的單色光，任意選取某一波長(zhǎng)的光，依據(jù)被測(cè)物質(zhì)對(duì)光的吸取強(qiáng)弱進(jìn)展物質(zhì)的測(cè)定分析，這種方法稱為分光光度法，分光光度法所使用的儀器稱SixE2yXPq572721752型等。各種型號(hào)的分光光度計(jì)的根本構(gòu)造都一樣，由如下五局部組成:6ewMyirQFL源>；⑤信號(hào)指示系統(tǒng)(檢流計(jì)、微安表、數(shù)字電壓表、示波器、微處理機(jī)顯像管>。光源→單色器→樣品吸取池→檢測(cè)系統(tǒng)→信號(hào)指示系統(tǒng)2.分光光度計(jì)的使用方法在儀器尚未接通電源時(shí)，電表指針必需于“0”刻線上，假設(shè)不是這種狀況，則可以用電表上的校正螺絲進(jìn)展調(diào)整。將儀器電源開(kāi)通，翻開(kāi)比色皿暗箱蓋，選擇需用的波長(zhǎng)，然后將比色皿暗箱蓋合上，比色皿座處于蒸餾水校正位置，使光電管受光，旋轉(zhuǎn)調(diào)“100%”電位器，使電表指針到滿度四周，儀器預(yù)熱20分鐘。放大器靈敏度有五檔，是逐步增加的，“1”最低。其選擇原100%”的狀況下，盡可能承受靈敏1”，靈敏度不夠時(shí)再漸漸上升，但轉(zhuǎn)變靈敏度后需按“4”重校正“0