口腔微生物分子生物學

口腔微生物分子生物學第一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五生命的主要遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸（DNA）第三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五DNA結(jié)構(gòu)的推衍Chargaff:T+C=A+G A=T G=CX線衍射：

DNA在兩條鏈組成，相互平行第四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五核酸的組成DNA RNA脫氧核糖 核糖腺嘌吟胞嘧啶 腺嘌呤胞嘧啶鳥嘌呤胸腺嘧啶 鳥嘌呤尿嘧啶雙鏈 單鏈第五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五DNA復制半保留復制第八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五DNA復制半不連接復制由于DNA多聚酶只能從5’→

3’方向合成DNA，因而半保留復制不能完全解釋。第九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五DNA復制的特點新合成的子代DNA與親代DNA完全一樣，保證了遺傳的穩(wěn)定性。第十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五RNA信使RNA（mRNA)核蛋白體RNA（rRNA)轉(zhuǎn)運RNA（tRNA)第十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五RNA的生物合成——轉(zhuǎn)錄以DNA為模板合與RNA由RNA多聚酶合成從DNA上特定起始序列（啟動子）開始，至終止信號結(jié)束第十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯遺傳密碼

由3個連續(xù)的核苷酸組成第十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯蛋白質(zhì)合成過程Ⅰ.氨基酸活化Ⅱ.蛋白質(zhì)合成的起始AUG→甲酰化甲硫氨酸（fMet)Ⅲ.蛋白質(zhì)合成的終止終止碼UAA、UGA、UAG第十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第二十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯新生多肽的加工Ⅰ.fMet水解Ⅱ.磷酸化、糖基化、甲基化修飾Ⅲ.信號肽蛋白質(zhì)向細胞外分泌第二十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五基因表達DNA→RNA→蛋白質(zhì)豐富的生命現(xiàn)象第二十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五基因表達的調(diào)節(jié)機體的每一個細胞都有一套完全相同的基因共同表達的基因特異性表達的基因第二十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第二十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五基因表達的調(diào)節(jié)共同表達的基因維持細胞基本結(jié)構(gòu)、功能第二十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五基因表達的調(diào)節(jié)特異性表達的基因紅細胞產(chǎn)生血紅蛋白B淋巴細胞產(chǎn)生抗體成牙本質(zhì)細胞分泌牙本質(zhì)蛋白第二十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五基因表達調(diào)控的原因動力細胞內(nèi)、細胞間，或細胞與外界環(huán)境間關系的變化。第二十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五基因表達調(diào)節(jié)的方式啟動子強啟動子與RNA多聚酶有較強的結(jié)合能力，轉(zhuǎn)錄水平較高；弱啟動子則反之。第二十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五基因表達調(diào)節(jié)的方式調(diào)節(jié)蛋白的作用—負向調(diào)節(jié)—正向調(diào)節(jié)第二十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五負向調(diào)節(jié)乳糖操縱子學說第三十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第三十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第三十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五正向調(diào)節(jié)第三十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五原核生物基因表達的調(diào)節(jié)主要在轉(zhuǎn)錄水平第三十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五真核基因生物調(diào)節(jié)多層次復雜性第三十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五分子克隆技術第三十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五限制性內(nèi)切酶特定的識別序列，4~6個堿基對在識別序列內(nèi)固定位置切割，5’–端磷酸基因，

3’-端羥基基團切割后形成粘性或平滑末端第三十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第三十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五DNA連接酶催化DNA中相鄰3’羥基和5’磷酸基團之間形成3’，5’–磷酸二酯鍵。第三十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五質(zhì)粒細胞內(nèi)獨立于染色體外的環(huán)狀DNA，能自我復制其上基因可借助宿主細胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯系統(tǒng)得以表達分子2000~50000bp第四十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五TpGEM-TVector(3003bp)AmprlacZoriXmnI1994ScaI1875NaeI2695ApaIAatIISphIBstZINcoISacIIT7SpeINotIBstZIPstISaLINdeISacIBstXINsiISP6T1start14202631374655626273758294103112126

pGEM-Tvectormap第四十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五XhoISmaIXhoISmaIXhoISmaIpCIpCIA-PpGEM-T/A-P

A-PfragmentSub-cloningconstructionofrecombinantpCIA-PinsertionofA-PDNAfragmentintoplasmidpCIXhoISmaIT4LigaseA-Pfragment第四十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五構(gòu)建質(zhì)粒的特點Ori區(qū)：復制起點Par區(qū)：保證質(zhì)粒均勻分布于子細胞多克隆區(qū)：人為構(gòu)建，便于克隆操作選擇因子：含特定基因，如耐抗生素基因，使克隆后便于挑選第四十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五接合在適當?shù)臈l件下，雄性菌和雌性菌混合時形成配對的雄性-雌性菌，并有遺傳物質(zhì)的單向轉(zhuǎn)移。雄性菌：含F(xiàn)性因子，染色體外環(huán)狀DNA第四十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第四十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五轉(zhuǎn)化外源DNA能進入細胞內(nèi)并通過整合至宿主DNA中或獨立復制保存于宿主細胞內(nèi)。第四十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五轉(zhuǎn)錄利用噬菌體為媒介，將供體DNA轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)的現(xiàn)象，能在自然狀態(tài)下發(fā)生。第四十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第四十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五分子克隆常用技術DNA電泳基因轉(zhuǎn)移核酸雜交聚合酶鏈反應PCR第四十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五DNA電泳可分離不同分子量的DNA第五十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第五十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五

Ladder1234567891011121314Ladder對臨床菌株的第二次PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜分析

Lane1~7:臨床菌株S.sobrinus;Lane8~14:臨床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW第五十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五核酸雜交原理：在一定條件下（溫度、pH值等）DNA雙股螺旋可解開并分離在一定條件下，兩股游離的互補的核苷酸可自行配對形成雙股第五十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五SouthernBlot電泳、轉(zhuǎn)移、雜交確定分子量第五十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第五十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五第五十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五斑點雜交目標序列的存在目標序列的量第五十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五聚合酶鏈反應PCR第五十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五與齲病相關微生物的定量檢測方法細菌形態(tài)生化反應免疫反應分子生物學方法----分子探針雜交----RFLP----PCR唾液在與齲病相關微生物檢測中的應用第五十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五在人類口腔中檢出率很高茸毛鏈球菌可能比變形鏈球菌與齲損活躍性之間的關系更密切變形鏈球菌和茸毛鏈球菌唾液在與齲病相關微生物檢測中的應用第六十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五套式PCR快速檢測人類唾液中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌.譚海平，邊專，樊明文，陳智，范兵.中華口腔醫(yī)學雜志，2003，38：223-226唾液在與齲病相關微生物檢測中的應用第六十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五套式PCR(NestedPCR)5′

3′

TemplateOuterprimer2Outerprimer1ThefirstPCR5′

3′

Interprimer2Interprimer1NexttemplateThesecondPCR5′

3′

ThesecondPCRproduct第六十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五本套式PCR的引物是分別根據(jù)變形鏈球菌gtfB基因和茸毛鏈球菌gtfI基因設計的內(nèi)、外兩套引物（outerprimer,interprimer）gtfBgeneofS.mutansOuterprimerthp4Outerprimerthp3ThefirstPCRInterprimerthp8Interprimerthp7Outerprimerthp6gtfIgeneofS.sobrinusOuterprimerthp5ThefirstPCRInterprimerthp10Interprimerthp9ThesecondPCRThesecondPCR

第六十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五抽提細菌染色體DNA(Igarashietal.1996)----細菌----唾液PCR反應過程第一次PCR反應

預變性:94℃4min

變性:94℃1min

退火:51℃1min30cycles

延伸:72℃2min

最后延伸:72℃5min

第二次PCR反應第六十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五

abcdefghLadder12345678選擇外引物行第一次PCR后擴增產(chǎn)物電泳圖譜分析以變鏈菌組(MutansStreptococci)染色體DNA為模板

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7;6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.

MW(Kb)2.01.00.250.10.750.5第六十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五

abcdefghLadder12345678選擇內(nèi)引物行第二次PCR后擴增產(chǎn)物電泳圖譜分析

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7:6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.Marker:DL2,000Ladder

MW(Kb)2.00.750.51.00.250.1第六十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五

Ladder123456第一次PCR的靈敏度

變形鏈球菌S.mutansIngbritt的數(shù)量

Lane1:108CFU;Lane2:107CFU;Lane3:106CFU;Lane4:105CFUMW(Kb)2.00.750.51.00.25第六十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五

2.0

0.5

Ladder1234561.00.750.25MW(Kb)第二次PCR的靈敏度

變形鏈球菌S.mutansIngbritt的數(shù)量

Lane1:104CFU,Lane2:103CFU

第六十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五

Ladder1234567891011121314Ladder對臨床菌株的第二次PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜分析

Lane1~7:臨床菌株S.sobrinus;Lane8~14:臨床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW第六十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期五

Ladder12345LadderMW1.0(Kb)0.750.50.250.1