獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

獸醫(yī)微生物試驗(yàn)教案

試驗(yàn)一顯微鏡油浸系使用及細(xì)菌基本形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察【目標(biāo)要求】1.掌握正確使用及護(hù)理顯微鏡方法，尤其是油浸系使用及護(hù)理。2.正確認(rèn)識(shí)細(xì)菌基本形態(tài)和結(jié)構(gòu)。【油浸系原理】 油浸系是在油浸鏡與標(biāo)本之間加1滴香柏油，調(diào)整光源檢驗(yàn)細(xì)菌標(biāo)本方法。油浸鏡是一個(gè)高倍放大物鏡，通常都刻有放大倍數(shù)，如95×、100×等。其鏡頭標(biāo)識(shí)國(guó)產(chǎn)鏡多用“油”字表示，國(guó)外產(chǎn)品則用“Oil”(OilImmersion)或HI(homogenmusImmersion)表示。而且油鏡鏡身較高倍鏡和低倍鏡為長(zhǎng)，鏡片最小，這也是識(shí)別另一個(gè)標(biāo)志。其使用原理是因?yàn)橄惆赜团c玻璃折光率相同(香柏油為1.515，玻璃為1.52)。鏡檢時(shí)，滴加香柏油作用是使光源盡可能多進(jìn)入物鏡中，防止光線經(jīng)過折光率低空氣(折光率為1.O)而散失，因而能提升物鏡分辨率，使物像明亮清楚?！酒鞑募霸噭?.菌種：大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、炭疽桿菌、細(xì)菌三型等標(biāo)本片；2.儀器：普通光學(xué)顯微鏡；3.材料：香柏油，二甲苯，擦鏡紙等?！静僮鞑襟E】(一)細(xì)菌基本形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察1.準(zhǔn)備安置顯微鏡à調(diào)整光源à調(diào)整雙筒目鏡間距à調(diào)整聚光器數(shù)值孔徑值。將光圈完全開放，升高聚光鏡與載物臺(tái)同高，置標(biāo)本片于載物臺(tái)上，在低倍鏡下對(duì)光，用于轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡以調(diào)整之，至視野最亮?xí)r為止。若用天然光源宜用反光鏡平面，較弱光源用凹面。檢驗(yàn)未染色標(biāo)本，光不宜太強(qiáng)，染色標(biāo)本需強(qiáng)光。光線強(qiáng)弱可經(jīng)過放大或縮小光圈、升降聚光鏡、旋轉(zhuǎn)反光鏡調(diào)整之。2.觀察將香柏油一滴滴于標(biāo)本片有顏色觀察區(qū)，并置于載物臺(tái)上，用片夾固定好，用推進(jìn)器將觀察區(qū)置于物鏡正下方，依次用高倍鏡à油鏡觀察。用油浸鏡檢驗(yàn)，使油鏡頭浸入油滴中，幾乎與標(biāo)本面接觸為度。然后由接目鏡注視鏡內(nèi)，同時(shí)慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)整螺旋提起鏡筒(絕對(duì)不能下降鏡筒)至能含糊看到物像時(shí)，再轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)螺旋(細(xì)螺旋轉(zhuǎn)動(dòng)通常不超出1周)，直至物像清楚為止。包含大腸桿菌、葡萄球菌形態(tài)及炭疽芽孢、巴氏桿菌莢膜和大腸桿菌鞭毛等細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)。(二)顯微鏡養(yǎng)護(hù)1.上升鏡筒，取下載玻片。

2.用擦鏡紙拭去鏡頭上鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留油跡，最終再用潔凈擦鏡紙擦去殘留二甲苯。

切忌用手或其余紙擦拭鏡頭，以免使鏡頭沾上污漬或產(chǎn)生劃痕，影響觀察。

3.用擦鏡紙清潔其余物鏡及目鏡；用綢布清潔顯微鏡金屬部件。

4.將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，再向下旋。同時(shí)把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險(xiǎn)。作業(yè)名詞解釋細(xì)菌莢膜芽孢油浸系二．問答題繪制葡萄球菌、大腸桿菌、炭疽桿菌莢膜及芽孢等形態(tài)及排列方式；使用油鏡時(shí)應(yīng)注意哪些問題？加香柏油前載片上可否有水，為何？細(xì)菌有哪些基本形態(tài)，各有哪些特征？

試驗(yàn)二細(xì)菌抹片制備及染色【目標(biāo)要求】(1)掌握細(xì)菌抹片制備方法和幾個(gè)慣用染色方法。(2)認(rèn)識(shí)革蘭氏染色反應(yīng)特征?！净驹怼?.簡(jiǎn)單染色法簡(jiǎn)單染色法是利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色一個(gè)方法，通慣用于觀察個(gè)體形態(tài)與細(xì)菌排列。因?yàn)榧?xì)菌在中性、堿性或弱酸性環(huán)境中帶負(fù)電荷，所以通常采取一個(gè)堿性染料如美藍(lán)、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色。美藍(lán)是美藍(lán)鹽酸鹽，可解離為帶正電荷美藍(lán)，很輕易與細(xì)菌結(jié)合使菌體著色。染色后細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明對(duì)比，在顯微鏡下更易于識(shí)別。2.革蘭氏染色液G—菌:細(xì)胞壁中含有較多類脂質(zhì)，肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁通透性，使初染結(jié)晶紫和碘復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)復(fù)紅復(fù)染后就成紅色。G+菌:細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后使肽聚糖層孔徑縮小，通透性降低，故細(xì)菌仍保留初染時(shí)顏色?！酒鞑募霸噭?.菌種：培養(yǎng)24h大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌斜面菌種；2.儀器：普通光學(xué)顯微鏡；3.材料：載玻片、接種環(huán)、酒精燈、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等；4.染料：美蘭染色液、草酸銨結(jié)晶紫染色液，革蘭氏碘液，95%乙醇，0.5%石炭酸復(fù)紅染色液?！静僮鞑襟E】(一)載玻片處理載玻片應(yīng)清楚透明，清潔而無油漬，滴上水后，能均勻展開，附著性好，如有殘余油漬，可按以下方法處理。1．滴上95%酒精2-3滴，用清潔紗布擦拭，然后以鐘擺速度經(jīng)過酒精燈焰3-4次。2．若上法仍未能除去油漬，可再滴上1-2滴冰醋酸，用紗布擦凈，再在酒精燈火焰上輕輕拖過。玻片潔凈后，用玻璃鉛筆在預(yù)涂材料處反面劃一個(gè)直徑1.5cm圓圈，用以標(biāo)識(shí)。（二）涂片方法1．菌落涂片方法涂片時(shí)，左手握菌種管，右手持接種環(huán)（又稱鉑金耳）取1-2環(huán)生理鹽水，置于載玻片上，然后將接種環(huán)在火焰上滅菌。待冷后，從菌種管內(nèi)取少許菌落，置于生理鹽水中混勻，涂成直徑1.5cm涂膜，此膜應(yīng)既薄又均勻?yàn)楹?，待于即成?．菌液涂片法用滅菌接種環(huán)蘸取菌液（液體培養(yǎng)物、血清、乳汁、組織滲出液等）1-2接種環(huán)，均勻涂抹在載玻片上，使成直徑為1.5cm左右圓形或橢圓形涂膜，自然干燥后備用。3．血液涂片方法先取一張潔凈無油垢、邊緣整齊載玻片，其一端蘸取少許血液，以450角放在另一張潔凈無油垢載玻片一端，從這端向另一端推成薄而均勻血膜，待干后備用。4．組織涂片方法先用鑷子夾持組織局部，然后以滅菌剪刀剪取一小塊，夾出后以其新鮮切面在載玻片上壓印或涂成一薄層。(三)干燥涂片最好在室溫中自然干燥。必要時(shí)，可將標(biāo)本面向上，在離酒精燈火焰遠(yuǎn)處烘干，切勿緊靠火焰，以免標(biāo)本糊焦而不能檢驗(yàn)。 (四)固定有兩種固定方法：1.火焰固定將已干燥好抹片，使涂面向上，以鐘擺速度經(jīng)過酒精燈火焰4次，使固定后標(biāo)本觸及皮膚時(shí)，稍感燒燙為度。放置冷卻后，進(jìn)行染色。2.化學(xué)固定血液、組織臟器等抹片做姬姆薩氏染色或單染色時(shí)，不用火焰固定而用甲醇固定?？蓪⒓焊稍锬ㄆ爰状贾?-3min，取出晾干；或者在抹片上滴加數(shù)滴甲醇使其作用2-3min后，自然揮發(fā)干燥。抹片做瑞特氏染色時(shí)則無須做尤其固定，染色液中含有甲醇可達(dá)成固定目標(biāo)。(五)染色方法1.單染色法只應(yīng)用一個(gè)染料進(jìn)行染色方法，如美藍(lán)染色法。美藍(lán)染色法：在已干燥、固定好抹片上，滴加適量(足夠覆蓋抹片點(diǎn)即可)美藍(lán)染色液，經(jīng)1-2min，水洗，瀝去多出水分，吸干或烘干(不能太熱)，然后鏡檢。2.復(fù)染色法應(yīng)用兩種或兩種以上染料或再加助染劑進(jìn)行染色方法。染色時(shí)，有些是將染料分別先后使用，有些則同時(shí)混合使用。染色后不一樣細(xì)菌和物體或者細(xì)菌結(jié)構(gòu)不一樣部分，能夠展現(xiàn)不一樣顏色，有判別細(xì)菌作用，又可稱為判別染色。如革蘭氏染色法、抗酸染色法、瑞特氏染色法和姬姆薩氏染色法等。(1)革蘭氏染色法①在已干燥、固定好抹片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，經(jīng)1-2min，水洗。②加革蘭氏碘液于抹片上媒染，1-3min，水洗。③加95%酒精于抹片上脫色，約30s至1min，水洗。④加10倍稀釋石炭酸復(fù)紅液復(fù)染1-2min，水洗。⑤吸干或烘干，鏡檢。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性細(xì)菌呈紅色。作業(yè)名詞解釋無菌細(xì)胞壁L型細(xì)菌1.革蘭氏染色法涂片時(shí)為何要涂薄而均勻，脫色程度要控制得當(dāng)？2.敘述革蘭氏染色原理及方法。3.簡(jiǎn)述細(xì)菌抹片制備過程及注意事項(xiàng)。

試驗(yàn)三培養(yǎng)基制備【目標(biāo)要求】(1)掌握通常培養(yǎng)基制備標(biāo)準(zhǔn)和要求。(2)熟悉通常營(yíng)養(yǎng)肉湯和普通培養(yǎng)基制備過程。(3)了解高壓蒸汽滅菌基本原理及應(yīng)用范圍；(4)掌握高壓蒸汽滅菌器使用方法及注意事項(xiàng)。【原理】培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物所需各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成一個(gè)基質(zhì)。它包含碳源、氮源、能源、生長(zhǎng)因子、無機(jī)鹽和水六類營(yíng)養(yǎng)要素。因?yàn)椴灰粯游⑸锛?xì)胞組成不一樣，因而所需營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)不一樣，為了分離、培養(yǎng)和判定不一樣微生物，必須依照其需要，配制適宜培養(yǎng)基?！酒鞑募霸噭?.藥品：瓊脂，1NNaOH溶液，1NHCl溶液，牛肉膏，蛋白胨，氯化鈉；2.材料：具刻度1000ml塘瓷盅，托盤天平，10×200mm試管，量筒，小燒杯，玻璃棒，骨匙，pH試紙，分裝漏斗，紗布，棉花，報(bào)紙，棉繩，標(biāo)簽，蒸餾水，高壓鍋，電爐?！静僮鞑襟E】通常培養(yǎng)基制備過程1%蛋白胨；0.5%NaCl；1%蛋白胨；0.5%NaCl；1-1.5%牛肉膏加適量蒸餾水定容100ml準(zhǔn)確稱量試劑加熱溶解NaOH調(diào)PH值準(zhǔn)確稱量試劑加熱溶解NaOH調(diào)PH值高壓滅菌高壓滅菌分裝，包裹過濾分裝，包裹過濾調(diào)PH7.2-7.6調(diào)PH7.2-7.6高壓滅菌分裝，包裹按2%加瓊脂高壓滅菌分裝，包裹按2%加瓊脂（二）營(yíng)養(yǎng)肉湯及普通瓊脂培養(yǎng)基制備1.準(zhǔn)確稱量牛肉膏1g，NaCl0.5g，蛋白胨1g，倒于瓷缸中，加適量（約100ml）蒸餾水，加熱煮沸(邊加熱邊攪拌)；2.待充分溶解后，定容至100ml，從中取5ml放入試管中，先用1/10mol/LNaCl調(diào)PH值至7.2-7.6，計(jì)算出所用1/10mol/LNaCl量，并換算出需用1mol/LNaCl量，并對(duì)剩下95ml培養(yǎng)基調(diào)PH值7.2-7.6；3.分裝3管每管3ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，將所剩下營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基按2%加入瓊脂，加熱煮沸（邊加熱邊攪拌）后分裝3管每管4ml普通瓊脂培養(yǎng)基，最終將所剩下培養(yǎng)基倒入三角瓶中；4.包裹，高壓滅菌后制備瓊脂斜面和普通瓊脂平板；5.無菌檢驗(yàn)合格后，備用。作業(yè)一．相關(guān)名詞解釋培養(yǎng)基滅菌碳源氮源生長(zhǎng)因子消毒固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基判別培養(yǎng)基加富培養(yǎng)基二．問答題1.制備培養(yǎng)基通常過程是什么？2.在制備培養(yǎng)基時(shí)要注意些什么問題？3.滅菌在微生物學(xué)試驗(yàn)操作中有何主要意義？4.敘述高壓滅菌器使用方法及注意事項(xiàng)。

試驗(yàn)四細(xì)菌及真菌分離培養(yǎng)及移植【目標(biāo)要求】1.學(xué)習(xí)、掌握細(xì)菌分離培養(yǎng)基本要領(lǐng)和技術(shù)；2.掌握釣菌、純培養(yǎng)及移植技術(shù)；3.掌握厭氧菌培養(yǎng)原理及其方法；4.熟悉真菌小培養(yǎng)方法?！驹怼繌幕祀s細(xì)菌群體中取得只含有一個(gè)或某一株細(xì)菌過程稱為細(xì)菌分離與純培養(yǎng)。平板劃線法是最慣用方法之一，經(jīng)過沾有樣本接種環(huán)在平板上劃線，將樣本“稀釋”，培養(yǎng)后使之形成單個(gè)菌落，從而達(dá)成分離目標(biāo)?！酒鞑募霸噭科鞑木凭珶?、接種環(huán)、恒溫箱、記號(hào)筆；培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)肉湯、普通瓊脂斜面、普通瓊脂平板；菌種枯草桿菌、綠膿桿菌及大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、炭疽芽孢桿菌混合菌菌種。【操作步驟】一、平板劃線分離法1連續(xù)劃線法2分區(qū)劃線法3劃線分離示意圖1.連續(xù)劃線法以無菌操作用接種環(huán)直接取平板上待分離純化菌落。將菌種點(diǎn)種在平板邊緣一處，取出接種環(huán)，燒去多出菌體。將接種環(huán)再次經(jīng)過稍打開皿蓋縫隙伸入平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環(huán)冷卻，然后從接種細(xì)菌部位在平板上自左向右輕輕劃線。劃線時(shí)平板面與接種環(huán)面成30-40O角，以手腕力量在平板表面輕巧滑動(dòng)劃線。接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi)劃破培養(yǎng)基，線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重合。劃線完成，關(guān)上皿蓋。灼燒接種環(huán)，待冷卻后放置于接種架上。培養(yǎng)皿倒置于適宜恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)后，在劃線平板上觀察沿劃線處長(zhǎng)出菌落形態(tài)，涂片鏡檢為純種后再接種斜面。2.分區(qū)劃線法(四分區(qū)劃線法)取菌、接種、培養(yǎng)方法與“連續(xù)劃線法”相同。分區(qū)劃線法劃線分離時(shí)平板分4個(gè)區(qū)，故又稱四分區(qū)劃線法。其中第4區(qū)是單菌落主要分布區(qū)，故其劃線面積應(yīng)最大。為預(yù)防第4區(qū)內(nèi)劃線與1、2、3區(qū)線條相接觸，應(yīng)使4區(qū)線條與1區(qū)線條相平行，這么區(qū)與區(qū)間線條夾角最好在保持1200左右。先將接種環(huán)蘸取少許菌在平板上1區(qū)劃3-5條平行線，取出接種環(huán)，左手關(guān)上皿蓋，將平板轉(zhuǎn)動(dòng)60-700。灼燒接種環(huán)，待在平板邊緣上冷卻后，再按以上方法以1區(qū)劃線菌體為菌源，由1區(qū)向2區(qū)做第2次平行劃線。第2次劃線完成，同時(shí)再把平皿轉(zhuǎn)動(dòng)60-700，一樣依次在3、4區(qū)劃線。劃線完成，灼燒接種環(huán)，關(guān)上皿蓋，倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h后，二、細(xì)菌釣菌、純培養(yǎng)和移植圖實(shí)4-15斜面接種時(shí)試管拿法1.接種環(huán)移植法兩試管斜面移植時(shí)，左手斜持菌種管和新鮮空白瓊脂斜面各一管，使管口相互并齊，稍上斜，管底握于手中，松動(dòng)兩管棉塞，方便接種時(shí)輕易拔出(圖實(shí)4-15)。右手食指和拇指執(zhí)接種環(huán)，燒灼接種環(huán)，以右手小指扭開第1管棉塞，無名指扭開第2管棉塞。棉塞頭向掌心內(nèi)，將試管口經(jīng)過酒精燈火焰滅菌，待冷卻后將接種環(huán)插入菌種管中，釣取細(xì)菌少許取出接種環(huán)立刻接種在新鮮空白瓊脂斜面上，不要碰及管壁，直達(dá)斜面底部。從斜面底部開始劃由曲線或直線，向上至斜面頂端為止，管口經(jīng)過火焰滅菌后，塞好棉塞。接種完成，將接種環(huán)燒灼滅菌后放好。用蠟筆在試管上標(biāo)明細(xì)菌名稱和接種日期，圖實(shí)4-15斜面接種時(shí)試管拿法三、穿刺培養(yǎng) 明膠穿刺和瓊脂柱穿刺方法基本上與純培養(yǎng)接種相同，不一樣是用接種針挑取菌落，垂直插入培養(yǎng)基中。要從培養(yǎng)基表面中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。圖圖4斜面接種無菌操作過程作業(yè)名詞解釋真菌菌落菌苔抑菌作用殺菌作用二．問答題在細(xì)菌分離純化及移植中有哪些注意事項(xiàng)？什么叫純培養(yǎng)？常見細(xì)菌分離培養(yǎng)方法有哪些，簡(jiǎn)述其操作過程？

試驗(yàn)五細(xì)菌分離培養(yǎng)及培養(yǎng)性狀觀察【目標(biāo)要求】1.掌握細(xì)菌菌落形態(tài)及其在各種培養(yǎng)基上培養(yǎng)性狀。2.了解培養(yǎng)性狀對(duì)細(xì)菌判別主要意義。【原理】將細(xì)菌經(jīng)接種于培養(yǎng)基上,會(huì)出現(xiàn)經(jīng)典培養(yǎng)特征,所謂培養(yǎng)特征是指微生物在培養(yǎng)基上所表現(xiàn)群體形態(tài)和生長(zhǎng)情況。細(xì)菌培養(yǎng)特征常規(guī)檢驗(yàn)包含平皿培養(yǎng)基上菌落特征；斜面培養(yǎng)基上菌苔特征；液體培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)特征。菌落是指?jìng)€(gè)體微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖成肉眼可見群落。菌落連成一片形成菌苔。在一定培養(yǎng)條件下，不一樣微生物形成菌落其性狀是不相同，它是判別各種微生物依據(jù)之一?！酒鞑募霸噭?.器材放大鏡；2.培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌及混合菌分別在營(yíng)養(yǎng)肉湯、普通瓊脂斜面、普通瓊脂平板培養(yǎng)性狀；3.標(biāo)本葡萄球菌、鏈球菌、沙門氏菌、酵母菌、青霉、毛霉等多個(gè)霉菌等制備保留各培養(yǎng)性狀標(biāo)本。【操作步驟】（一）細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)表現(xiàn)1.瓊脂平皿上生長(zhǎng)表現(xiàn)細(xì)菌于固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)繁殖，形成單個(gè)肉眼可見細(xì)菌集落群體，稱為菌落。各種細(xì)菌菌落，按其特征不一樣，能夠在一定程度上判別某種細(xì)菌。如葡萄球菌在瓊脂平皿上，因?yàn)楫a(chǎn)生色素不一樣，形成各種顏色圓形而突起菌落；炭疽桿菌形成扁平干燥、邊緣不整齊火焰狀菌落，用放大鏡觀察時(shí)，呈卷發(fā)樣結(jié)構(gòu)；腸道桿菌屬細(xì)菌，形成圓形、濕潤(rùn)、粘稠、扁平、大小不等菌落；巴氏桿菌和豬丹毒桿菌，形成細(xì)小露珠狀菌落。觀察菌落方法除肉眼外，還可用放大鏡，必要時(shí)也可用低倍顯微鏡進(jìn)行檢驗(yàn)。觀察主要內(nèi)容有(圖1、2)：圖圖1菌落形狀、邊緣和表面結(jié)構(gòu)1.圓形、邊緣整齊，表面光滑2.圓形、葉狀邊緣，表面有放射狀皺褶3.圓形、邊緣整齊，表面有同心圓4.圓形、鋸齒狀邊緣，表面較不光滑5.不規(guī)則形、波浪狀邊緣，表面有不規(guī)則皺紋6.圓形、邊緣殘缺不全，表面呈顆粒狀7.毛狀8.根狀圖2菌落隆起度1.扁平狀2.低隆起3.隆起4.臺(tái)狀5.臍狀6.紐扣狀7.乳頭狀8.褶皺凸面(1)大小菌落大小圖2菌落隆起度1.扁平狀2.低隆起3.隆起4.臺(tái)狀5.臍狀6.紐扣狀7.乳頭狀8.褶皺凸面(2)形狀菌落外形有圓形、不規(guī)則形、根足形、葡萄葉形。(3)邊緣菌落邊緣有整齊、鋸齒狀、網(wǎng)狀、樹葉狀、蟲蝕狀、放射狀等。(4)表面性狀觀察其是否平滑、粗糙、皺襞狀、漩渦狀、荷包蛋狀，甚至有子菌落等。(5)隆起度表面有隆起、輕度隆起、中央隆起，也有陷凹或堤狀者。(6)顏色及透明度菌落有沒有色、灰白色，有能產(chǎn)生各種色素；菌落是否有光澤；其透明度可分為透明、半透明及石透明。(7)硬度粘液狀、膜狀、干燥或濕潤(rùn)等。(8)溶血情況若是鮮血瓊脂平皿，應(yīng)看其是否溶血、溶血情況怎樣。 2．瓊脂斜面上生長(zhǎng)表現(xiàn)(圖3)將各種細(xì)菌分別以接種針直線接種于瓊脂斜面上(自底部向上劃一直線)，培養(yǎng)后觀察其生長(zhǎng)表現(xiàn)。 3．瓊脂柱穿刺培養(yǎng)中生長(zhǎng)表現(xiàn)將各種細(xì)菌分別以接種針穿刺接種于瓊脂柱中，培養(yǎng)后觀察其生長(zhǎng)表現(xiàn)(圖4)。 (二)細(xì)菌在明膠柱穿刺培養(yǎng)中生長(zhǎng)表現(xiàn)取大腸桿菌、枯草桿菌和其余細(xì)菌分別以接種針穿刺接種于明膠柱，置22℃溫箱中培養(yǎng)后觀察其液化是否和液化情況，不一樣細(xì)菌對(duì)明膠柱液化作用各不相同(圖5) 圖3圖3瓊脂斜面直線接種培養(yǎng)菌落表現(xiàn)1.線狀2.棘狀3.珠狀4.擴(kuò)散狀5.根狀圖4瓊脂柱穿刺培養(yǎng)菌落表現(xiàn)1.線狀2.棘狀3.珠狀4.絨毛狀5.根狀(三)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)表現(xiàn)(圖6)將馬腺疫鏈球菌、綠膿桿菌、葡萄球菌、大腸桿菌、炭疽桿菌等分別接種于肉湯中，培養(yǎng)后觀察其生長(zhǎng)情況，主要觀察其渾濁度、沉淀物、菌膜、菌環(huán)和顏色等。 1.渾濁度細(xì)菌接種在液體培養(yǎng)基中經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后其表現(xiàn)性狀不一樣，有均勻渾濁、輕度混濁或培養(yǎng)基保持透明(表面有菌膜或底部有沉淀物)。 2.沉淀物細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中所形成沉淀有：顆粒狀沉淀、粘稠沉淀、絮狀沉淀、小塊狀沉淀。另外還有不生成沉淀細(xì)菌。 3.表面性狀主要是觀察細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后有元菌膜或菌環(huán)形成等。 4.顏色有細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過程中能產(chǎn)生色素，色素能溶于水，所以細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，所產(chǎn)生色素會(huì)使培養(yǎng)基顏色發(fā)生改變。圖5圖5細(xì)菌明膠柱穿刺培養(yǎng)生長(zhǎng)表現(xiàn)1.不液化2.火山口狀3.蕪菁狀4.漏斗狀5.囊狀6.層狀圖6細(xì)菌在肉湯中生長(zhǎng)表現(xiàn)1.絮狀2.環(huán)狀3.厚膜狀4.均勻狀作業(yè)1.什么叫菌落？什么叫菌苔？2.細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)特征包含哪些方面？3．描述大腸桿菌、炭疽桿菌、葡萄球菌菌落特點(diǎn)。

試驗(yàn)六細(xì)菌生理生化試驗(yàn)【目標(biāo)要求】1．掌握細(xì)菌判定中慣用生理生化試驗(yàn)原理和試驗(yàn)方法。2．了解生理生化試驗(yàn)結(jié)果對(duì)細(xì)菌判別主要意義?！驹囼?yàn)原理】1.糖發(fā)酵試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)是慣用判別微生物生化反應(yīng)，在腸道細(xì)菌判定中尤為主要，絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源，不過它們?cè)诜纸馓悄芰ι嫌泻艽蟛町悾河行┘?xì)菌能分解某種糖并產(chǎn)酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫、甲烷、二氧化碳等）；有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。比如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；傷寒桿菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解乳糖；普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。酸產(chǎn)生可利用指示劑來斷定。在配制培養(yǎng)基時(shí)預(yù)先加入溴甲酚紫[pH5.2（黃色）-6.8（紫色）]，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。氣體產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置德漢氏小管中有沒有氣泡來證實(shí)。2.M.R試驗(yàn)一些細(xì)菌(如大腸桿菌、志賀氏菌、產(chǎn)氣桿菌等)在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再深入分解為乙酸、乳酸、琥珀酸等。酸類增加愈多，則使培養(yǎng)基中pH值愈下降，當(dāng)降至pH4.5以下時(shí)，指示劑甲基紅則呈紅色，即為陽(yáng)性反應(yīng)。如pH值高于4.5時(shí)則指示劑呈黃色，即為陽(yáng)性反應(yīng)。所以,在培養(yǎng)物中加入1滴甲基紅試劑，立刻能夠觀察到上述結(jié)果之一。3.乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V-P反應(yīng))一些細(xì)菌（如產(chǎn)氣桿菌）在糖代謝過程中，利用葡萄糖，產(chǎn)生丙酮酸，再將丙酮酸縮合。脫羧而成為中性乙酰甲基甲醇，該物質(zhì)在堿性條件下能被空氣中氧氣氧化生成二乙酰。二乙酰能與培養(yǎng)基中含胍基化合物發(fā)生反應(yīng)，立刻或于數(shù)分鐘內(nèi)生成紅色化合物；即為V-P試驗(yàn)陽(yáng)性。假如培養(yǎng)基含胍基太少，可加入肌酸或肌酐酸等含胍基化合物。當(dāng)加入α-萘酚時(shí)也可使反應(yīng)加速進(jìn)行。4.靛基質(zhì)試驗(yàn)（吲哚試驗(yàn)）一些微生物如大腸桿菌、變形桿菌、霍亂弧菌等在代謝過程中產(chǎn)生色氨酸酶，能分解培養(yǎng)基中色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)(indolo)。靛基質(zhì)與對(duì)二甲氨苯甲醛作用時(shí)，形成玫瑰靛基質(zhì)而呈紅色。5.三糖鐵瓊脂試驗(yàn)該培養(yǎng)基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖百分比為10:10:1，只能利用葡萄糖細(xì)菌，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成少許酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面日后又變紅，底部因?yàn)槭窃趨捬鯛顟B(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。而發(fā)酵乳糖細(xì)菌(E.coli)，則產(chǎn)生大量酸，使整個(gè)培養(yǎng)基展現(xiàn)黃色。如培養(yǎng)基接種后產(chǎn)生黑色沉淀，是因?yàn)橐恍┘?xì)菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氫，硫化氫和培養(yǎng)基中鐵鹽反應(yīng)，生成黑色硫化亞鐵沉淀。【器材及試劑】1.器材酒精燈、接種環(huán)、恒溫箱、記號(hào)筆；2.培養(yǎng)基葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖等糖發(fā)酵管；蛋白胨水；葡萄糖蛋白胨水、三糖鐵培養(yǎng)基等；3.菌種大腸桿菌、沙門氏菌菌種?！静僮鞑襟E】一、糖類分解（發(fā)酵）試驗(yàn)1．試驗(yàn)方法（1）瓊脂斜面培養(yǎng)物用接種針挑取少許菌穿刺接種于糖發(fā)酵管深部（勿穿到管底?。?。（2）將接種管標(biāo)識(shí)清楚放入37℃孵育，24-48h觀察結(jié)果。2．結(jié)果判定無改變-培養(yǎng)基不變色產(chǎn)酸+培養(yǎng)基變黃產(chǎn)酸產(chǎn)氣⊕培養(yǎng)基變黃并有氣泡二、吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)1．試驗(yàn)方法①以接種環(huán)將待檢菌新鮮斜面培養(yǎng)物接種于蛋白胨水溶液中，置37℃培養(yǎng)24-48h（可延長(zhǎng)4-5d）。②于培養(yǎng)液中加入戊醇或二甲苯2-3m1，搖勻，靜置片刻后，沿試管壁加入歐立希氏或Kovacs試劑2m1。③三、甲基紅（M.R）試驗(yàn)／維倍（V-P）二氏試驗(yàn)1．試驗(yàn)方法（1）M.R試驗(yàn)接種細(xì)菌于培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)24-48h后。于培養(yǎng)物中加入幾滴試劑，變紅色者為陽(yáng)性反應(yīng)，桔紅到黃色則為陰性。（2）V-P試驗(yàn)①取出培養(yǎng)24hV.P試驗(yàn)用葡萄糖蛋白胨溶液lm1。②將6％小萘酚酒精溶液0.5ml加入，隨即加16％KOH0.5m1，輕搖，然后讓其靜置10-15min。③在15min內(nèi)出現(xiàn)紅色者則為陽(yáng)性，1h后可出現(xiàn)假陽(yáng)性。④或者加等量硫酸銅試劑于培養(yǎng)物中混合，靜置，強(qiáng)陽(yáng)性者約5min后可產(chǎn)生粉紅色反應(yīng)。四、三糖鐵瓊脂試驗(yàn)以接種針挑取待試菌可疑菌落或者純培養(yǎng)物穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃，18-24h觀察結(jié)果。作業(yè)一名詞解釋吲哚試驗(yàn)二問答題1.細(xì)菌糖發(fā)酵試驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)有哪些，代表什么含義？2.簡(jiǎn)述三糖鐵瓊脂試驗(yàn)單糖種類、百分比及其主要試驗(yàn)現(xiàn)象？

試驗(yàn)七細(xì)菌藥敏試驗(yàn)[目標(biāo)要求]1.掌握紙片擴(kuò)散法、稀釋法細(xì)菌藥敏試驗(yàn)原理、操作方法、結(jié)果判讀及臨床意義。 2.熟悉紙片擴(kuò)散法、稀釋法質(zhì)量控制立法。 一、紙片擴(kuò)散法(一)原理含有定量抗菌藥品紙片貼在已接種測(cè)試菌瓊脂平板上，紙片中所含藥品吸收瓊脂中水分溶解后便不停地向紙片周圍擴(kuò)散，形成遞減梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)被抑制，形成透明抑菌圈。抑菌圈大小反應(yīng)測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥品敏感程度，并與該藥對(duì)測(cè)試菌最小抑菌濃度(minima1idIibitoryconcentration,MIC)呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。(二)試驗(yàn)材料1.抗菌素紙片可購(gòu)用或按以下方法制備。(1)將質(zhì)量很好濾紙用打孔機(jī)打成直徑6mm圓片，每100片放入一小瓶中，高壓滅菌(1.02kg30min)后在(2)用無菌操作法將待測(cè)抗菌藥品溶液1ml,(含藥量按表實(shí)17-1所列計(jì)算，比如，慶大霉素10μg/片×100片=1000μg/ml，加入100片紙片中，置冰箱內(nèi)浸泡1-2h，如立刻試驗(yàn)可不烘干，若保留備用可，用以下一個(gè)方法烘干(干燥抗菌素紙片可保留6個(gè)月)。 培養(yǎng)皿烘干法將浸有抗菌藥液紙片攤平在培養(yǎng)皿中，于37℃溫箱內(nèi)保持2-3h即可干燥，或放在無 真空抽干法將放有抗菌藥品紙片試管，置干燥器內(nèi)，用真空抽氣機(jī)抽干。將制好各種藥品紙片裝入無菌小瓶中，置冰箱、內(nèi)保留備用。并用標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株作敏感性試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)抑菌圈直徑，若抑菌圈比標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株原來縮小，則表明該抗菌藥品已失效，不能再用。表實(shí)17-1紙片法藥敏試驗(yàn)紙片含藥量和結(jié)果解釋抗菌藥品紙片含藥量抑菌圈直徑(mm)耐藥(R)中介度(I)敏感(S)阿米卡星(AMO)30μg≤1415~16≥17慶大霉素(GEN)10μg≤1213~14≥15青霉素〈PEN)10units≤28—≥29苯唑西林(OXA)1μg≤1011~12≥13氨芐西林(AMP)10μg≤1314~16≥17哌拉西林(PIP)100μg≤17—≥18頭孢唑林(FZN)30μg≤1415~17≥18環(huán)丙沙星(CIP)5μg≤1516~20≥21萬(wàn)古霉素(VAN)30μg——≥15克林霉素(CLI)2μg≤1415~20≥21復(fù)方新諾明(SXT)1.25/23.75μg≤1011~15≥16注：敏感(S)表示被測(cè)菌株感染，可用該抗菌藥慣用劑量治愈。 耐藥(R)表示被測(cè)菌株感染，用該抗菌藥慣用劑量治療，預(yù)期元效。 中介度(I)出現(xiàn)此結(jié)果，有可能因試驗(yàn)技術(shù)原因引發(fā)誤差，不應(yīng)匯報(bào)，必要時(shí)用稀釋法重做。 2.培養(yǎng)基Muelk-Hinton(M-H)瓊脂3.試劑及菌種無菌生理鹽水、0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管(McFarlandstanard，相當(dāng)于1.5×108cfu/ml)。菌種：金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希氏菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。(三)試驗(yàn)方法1.用培養(yǎng)16~24h血平板上菌落接種于生理鹽水管中，校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)(相當(dāng)于1.5×108cfu/ml)。 2.用無菌棉拭于蘸取少許菌液，在M-H瓊脂表面均勻涂抹接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60℃,3.將接種平板置室溫下干燥3~5min后，用無菌鑷圖實(shí)17-1藥品抑菌試驗(yàn)示意圖子取含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心相距應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm，置35℃培養(yǎng)16~18h后觀察結(jié)果。藥品選擇參考表實(shí)17-2藥敏紙片選擇待測(cè)菌藥品金黃色葡萄球菌ATCC25923PEN、OXA、CLI、VAN、CIP、GEN、SXT大腸埃希菌ATCC25922AMP、FZN、GEN、AMS、FRX、CIP、IMP銅綠假單胞菌ATCC27853CAZ、GEN、PIP、AMK、ATM、CIP、IMP(四)結(jié)果判定依照抗菌藥紙片周圍抑菌區(qū)大小，測(cè)定其藥品敏感性。用毫米尺測(cè)量抑菌圈直徑，參考表實(shí)17-1標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。按敏感(S)或耐藥(R)匯報(bào)。(五)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌圈應(yīng)在表實(shí)17-3所表示預(yù)期范圍內(nèi)。假如超出該范圍，應(yīng)視為失控而不發(fā)匯報(bào)，及時(shí)查找原因，給予糾正。表實(shí)17-3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌圈預(yù)期值范圍抗菌藥品紙片含藥量抑菌圈直徑(mm)金黃色葡萄球菌ATCC25923大腸埃希菌ATCC25922銅綠假單胞菌ATCC27853阿米卡星(AMO)30μg19~2620~2618~26慶大霉素(GEN)10μg19~2619~2716~21青霉素〈PEN)10units—26~37—苯唑西林(OXA)1μg—18~24—氨芐西林(AMP)10μg16~2227~35—哌拉西林(PIP)100μg24~30—25~33頭孢唑林(FZN)30μg29~3523~29—亞胺配南(IMP)10μg26~32—20~28環(huán)丙沙星(CIP)5μg30~4022~3025~33萬(wàn)古霉素(VAN)30μg—17~21—克林霉素(CLI)2μg—24~30—復(fù)方新諾明(SXT)1.25/23.75μg24~3224~32—作業(yè)：名詞解釋藥敏試驗(yàn)；最小抑菌濃度；半數(shù)致死量；抑菌圈問答題紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)原理、操作結(jié)果片段及其有何臨床意義？

試驗(yàn)八小動(dòng)物試驗(yàn)法【試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)】1．學(xué)習(xí)并掌握試驗(yàn)動(dòng)物接種方法。2．學(xué)習(xí)并掌握試驗(yàn)動(dòng)物剖檢方法。3.掌握病料采集、包裝和運(yùn)輸基本標(biāo)準(zhǔn)和操作技術(shù)?！驹囼?yàn)用途】在微生物試驗(yàn)和研究工作中，動(dòng)物試驗(yàn)是慣用技術(shù)之一，其主要用途有以下幾方面：1．進(jìn)行病原體分離和判定有些直接分離培養(yǎng)有困難病原菌或需判定細(xì)菌，經(jīng)過易感動(dòng)物體就可達(dá)成目標(biāo)。如從子宮分泌物中分離布魯氏菌，可用豚鼠接種法。2．確定病原體致病力有些細(xì)菌在形態(tài)、生物學(xué)特征等方面性狀相同，僅在致病性上不一樣，可利用動(dòng)物試驗(yàn)判別。3．恢復(fù)或增強(qiáng)細(xì)菌毒力多數(shù)病原菌長(zhǎng)久經(jīng)過人工傳代保留后，其毒力減弱，須經(jīng)過易感動(dòng)物恢復(fù)或增強(qiáng)其致病力。4．測(cè)定一些細(xì)菌外毒素如產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素測(cè)定。5．制備疫苗或診療用抗原如兔化豬瘟疫苗。6．制備作診療或治療用免疫血清如作判定用沙門氏菌診療血清。7．用于檢驗(yàn)藥品治療效果及毒性等（一）試驗(yàn)動(dòng)物接種法1．接種材料細(xì)菌培養(yǎng)物（肉湯培養(yǎng)物或細(xì)菌懸液）、尿液、腦脊液、血液、分泌物、臟器組織懸液等。2．試驗(yàn)動(dòng)物慣用動(dòng)物有家兔、豚鼠（也稱海豚、荷蘭豬、天竺鼠）、大白鼠、小白鼠及綿羊等。所需試驗(yàn)動(dòng)物以自行繁殖為最方便可靠，如必須向外購(gòu)置、要選擇健康無病未做過任何試驗(yàn)動(dòng)物。3．試驗(yàn)動(dòng)物慣用接種方法（1）皮膚劃痕接種試驗(yàn)動(dòng)物多用家兔，用剪毛剪剪去脅腹部長(zhǎng)毛，必要時(shí)再用剃刀或脫毛劑脫去被毛，以75％酒精消毒，待干，用無菌小刀在皮膚上劃成幾條平行線。劃痕口可略見出血，然后用刀將接種材料涂在劃痕口上。（2）皮下接種家兔皮下接種由助手把家兔伏臥或仰臥保定，于其背側(cè)或腹側(cè)皮下結(jié)締組織疏松部分剪毛消毒，術(shù)者右手持注射器，以左手拇指，食指和中指捏起皮膚使成一個(gè)三角形皺褶，或用鑷子夾起皮膚、于其底部進(jìn)針，感到針頭可隨意撥動(dòng)即表示插入皮下。當(dāng)推入注射物時(shí)感到流利通暢也表示在皮下，撥出注射針頭時(shí)用消毒棉球按針孔并稍加按摩。豚鼠皮下接種保定和術(shù)式同家兔。小白鼠皮下接種無須助手幫助保定，術(shù)者在做好接種準(zhǔn)備后，先用右手抓住鼠尾，令其前爪抓住喂養(yǎng)罐鐵絲蓋，然后用左手拇指及食指捏住頸部皮膚，并翻轉(zhuǎn)左手使小鼠腹部朝上，將其尾巴挾在左手掌與小手指之間，右手消毒術(shù)部，把持注射器、以針頭稍微挑起皮膚插入皮下，注入時(shí)見有水泡微微鼓起即表示注入皮下。拔出針頭后，同家兔皮下注射時(shí)一樣處理。（3）皮內(nèi)接種作家兔、豚鼠及小白鼠皮內(nèi)接種時(shí)，均需助手保定動(dòng)物，其保定方法同皮下接種。接種時(shí)術(shù)者以左手拇指及食指夾起皮膚，右手持注射器、用細(xì)針頭插入拇指及食指之間皮膚內(nèi)針頭插入不宜過深，同時(shí)插入角度要小，注入時(shí)感到有阻力且注射完成后皮膚上有小硬皰即為注入皮內(nèi)。皮內(nèi)接種要慢，以防使皮膚脹裂或自針孔流出注射物而散播傳染。（4）肌肉接種肌肉注射部位在禽類為胸肌，其它動(dòng)物為后肢內(nèi)股部。術(shù)者消毒后，將針頭刺入肌肉內(nèi)注射感染材料。（5）腹腔內(nèi)接種在家兔、豚鼠、小白鼠作腹腔接種，宜采取仰臥保定、接種時(shí)稍抬高后軀，使其內(nèi)臟傾向前腔，在腹后側(cè)面插入針頭，先刺入皮下，后進(jìn)入腹腔、注射時(shí)應(yīng)無阻力，皮膚也隆起。（6）靜脈注射家兔靜脈注射將家兔納入保定器內(nèi)或由助手把握住它前、后軀保定、選一側(cè)耳邊緣靜脈，先用75％酒精涂擦兔耳或以手指輕彈耳朵，使靜脈擴(kuò)張。注射時(shí)，用左手拇指和食指拉緊兔耳，右手持注射器，使針頭與靜脈平行，向心臟方向刺入靜脈內(nèi)，注射時(shí)無阻力且有血向前流動(dòng)表示注入靜脈、緩緩注射感染材料，注射完成用消毒棉球緊壓針孔，以免流血或注射物溢出。豚鼠靜脈內(nèi)接種使豚鼠伏臥保定。腹面向下，將其后肢剃毛、用75％酒精消毒皮膚，施以全身麻醉，用銳利刀片向后肢內(nèi)上側(cè)向外下方切一長(zhǎng)約1厘米切口，使露出皮下靜脈，用最小號(hào)針頭刺入靜脈內(nèi)慢慢注入感染材料。接種完成，將切口縫合一兩針。小白鼠靜脈接種其注射部位為尾側(cè)靜脈。選15～20g體重小白鼠，注射前將尾部血管擴(kuò)張易于注射。用一燒杯扣住小白鼠，露出尾部，最小號(hào)針頭（4號(hào)）刺入側(cè)尾靜脈，緩緩注入接種物，注射時(shí)無阻力，皮膚不變白、不隆起，表示注入到靜脈內(nèi)。（7）腦內(nèi)接種法作病毒試驗(yàn)研究時(shí)，有時(shí)用腦內(nèi)接種法，通常多用小白鼠，尤其是乳鼠（1～3日齡），注射部位是耳根連線中點(diǎn)略偏左（或右）處。接種時(shí)用乙醚使小白鼠輕度麻醉，術(shù)部用碘酒，酒精棉球消毒，在注射部位用最小號(hào)針頭經(jīng)皮膚和顱骨稍向后下刺入腦內(nèi)進(jìn)行注射，先后以棉球壓住針孔片刻，接種乳鼠時(shí)通常不麻醉，不用碘酒消毒。家兔和豚鼠腦內(nèi)接種法基本同小白鼠，唯其顱骨稍硬厚，事先用短錐鉆孔，然后再注射、深度宜淺，以免傷及腦組織。4．注射量家兔0.2m1，豚鼠0（二）試驗(yàn)動(dòng)物采血法如欲取得清楚透明血清，宜于早晨沒有飼喂前抽取血液。如采血量較多則應(yīng)在采血后，以生理鹽水作靜脈（或腹腔內(nèi)）注射或飲用鹽水以補(bǔ)充水份。家兔采血法可采自其耳靜脈或心臟，耳邊緣靜脈采血方法基本與靜脈接種相同，不一樣之處是以針尖向耳尖反向抽吸其血，通常可采血1～2m1。如采大量血液，則專心臟采血法。動(dòng)物左仰臥由助手保定，或以繩索將四肢固定，術(shù)者在動(dòng)物左前肢腋下處局部剪毛及消毒，在胸部心臟跳動(dòng)最顯著處下針。用一寸半長(zhǎng)12號(hào)針頭，直刺心臟，感到針頭跳動(dòng)或有血液向針管內(nèi)流動(dòng)時(shí)，即可抽血，一次可采血15～20m1。如采其全血，可自頸動(dòng)脈放血。將動(dòng)物保定，左頸部剃毛消毒，動(dòng)物稍加麻醉，用刀片在頸靜脈溝內(nèi)切一長(zhǎng)口，露出頸動(dòng)脈并結(jié)扎，于近心端插入一玻璃導(dǎo)管，使血液自行流至無菌容器內(nèi)，凝后析出血清；如利用全血，可直接流入含抗凝劑瓶?jī)?nèi)，或含有玻璃珠三角瓶?jī)?nèi)振蕩脫纖防凝。放血可達(dá)50ml以上。2．豚鼠采血法豚鼠通常從心臟采血。助手使動(dòng)物仰臥保定，術(shù)者在動(dòng)物胸部心跳最顯著處剪毛消毒，用針頭插入胸壁稍向右下方刺入。刺入心臟則血液可自行流入針管，一次未刺中心臟稍偏時(shí)，可將針頭稍提起向另一方向再刺。如數(shù)次沒有刺中，應(yīng)換一動(dòng)物，不然有心臟出血致死亡可能。3．小白鼠采血法可將尾部消毒，用剪刀斷尾少許，使血液溢出，即得血液數(shù)滴，采血后用燒烙法止血。也可自心臟采血，或摘除眼球放血。4．綿羊采血法在微生物試驗(yàn)室中綿羊血最慣用。采血時(shí)由一助手半坐騎在羊背上，兩手各持其一耳（或角）或下顎，因?yàn)檠蛄?xí)慣好后退，令尾靠住墻根。術(shù)者在其頸部上1/3處剪毛消毒，一手壓在靜脈溝下部使靜脈努張，右手持針頭猛力刺入皮膚，此時(shí)血液流入注射器或直接流入無菌容器內(nèi)，一切應(yīng)無菌操作，以取得無菌血液。5．雞采血法剪破雞冠可采血數(shù)滴供作血片用。少許采血可從翅靜脈采取，將翅靜脈刺破以試管盛之，或用注射器采血，需大量血可專心臟采取：固定家禽使側(cè)臥于桌上，左胸部朝上，從胸骨脊前端至背部下凹處連線中點(diǎn)垂直刺入，約1寸深即可采得心血。一次可采10～20ml血液。（三）病料采集、包裝和運(yùn)輸1、病料采集、包裝、運(yùn)輸基本標(biāo)準(zhǔn)（1）要分離病原微生物，必須準(zhǔn)確采集含菌(病毒)最多病料。這就必須充分了解各種病原微生物在患畜(禽)體內(nèi)及其分泌物和排泄物中分布情況。不一樣病原微生物在患畜(禽)體內(nèi)分布情況是不一樣，即使是同一個(gè)病原微生物，在病程不一樣時(shí)期和不一樣病型中分布也不相同。所以，在采集病料之前，必須依照該傳染病流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床表現(xiàn)和病了解剖檢驗(yàn)結(jié)果，對(duì)被檢動(dòng)物可能患什么傳染病做出初步診療，然后采集最適宜病料。（2）采集病料時(shí)應(yīng)盡可能防止雜菌污染。要求盡可能做到無菌操作，所用器械、容器等均要求無菌。（3）采集病料應(yīng)盡快送檢，不宜久置。患畜(禽)死后，應(yīng)立刻剖檢采取病料送檢，不然組織腐敗、不利于病原體分離。因故不能及時(shí)送檢時(shí)，則需冷凍保留；但保留時(shí)間也不應(yīng)太久。小動(dòng)物(如家禽、家兔、羔羊、仔豬等)可將其整個(gè)尸體裝入塑料袋內(nèi)送檢。（4）進(jìn)行人畜共患傳染病病尸剖檢時(shí)，須做好個(gè)人防護(hù)工作和環(huán)境消毒工作，以免發(fā)生本身感染和散播病原。凡認(rèn)為動(dòng)物死于炭疽或可疑為炭疽時(shí)，禁止剖檢，應(yīng)立刻匯報(bào)上級(jí)防疫部門，嚴(yán)格診療處理。（5）剖檢時(shí)要對(duì)病例各個(gè)組織器官病理改變進(jìn)行詳細(xì)統(tǒng)計(jì)。2、各種病料采集與保留（1）涂片或觸片病畜(禽)病灶組織、膿汁、血液等可制成涂片或觸片，待自然干燥后送檢。血液涂片可制兩種，一個(gè)為薄血片，供顯微鏡檢驗(yàn)用；另一個(gè)為厚片，供細(xì)菌分離或接種試驗(yàn)動(dòng)物用。全部涂片或觸片一端應(yīng)貼上標(biāo)簽，注明起源、是否固定等。（2）檢驗(yàn)包涵體病料，采集早期病灶組織，浸泡在固定液中保留，以供制備病理切片。固定液配方：40%甲醛50ml；冰醋酸120ml；96%酒1100ml；苦味酸8g；蒸餾水1000ml。（3）細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)病料，可采集組織臟器，如肝、脾、腎、心肌、淋巴結(jié)、腦組織等，盛入無菌容器中送檢。液態(tài)病料，如痰、粘液、膿汁、腹水、腦脊液、關(guān)節(jié)液及膽汁等，可用無菌注射器吸收后裝入無菌試管中，或用無菌棉球、無菌棉簽蘸取后放入無菌試管中送檢。凡裝有病料容器均要求直立瓶口或試管口棉塞要用融化石蠟密封，并貼好標(biāo)簽。（4）供病毒學(xué)檢驗(yàn)病料采集、保留應(yīng)按不一樣病料用不一樣方法。（5）供血清學(xué)檢驗(yàn)用材料血清學(xué)檢驗(yàn)包含判定抗原或抗體。作為病毒樣抗原樣品取材要準(zhǔn)確，并注意保持病毒抗原性。用熒光抗體檢驗(yàn)病毒病料，應(yīng)立刻置丙酮中在低溫下固定，然后送檢。供判定抗體血清，采血時(shí)不加抗凝劑，直接在無菌條件下分離血清，將血清裝入滅菌試管、小瓶或臺(tái)式微量離心管中，并可在血清中加入抗菌素(青霉素和鏈霉素各100Ou/ml)、0.5%石炭酸或0.01%硫柳汞或0.08%疊氮化鈉防腐。3、病料包裝和運(yùn)輸（1）將盛病料容器表面用消毒劑擦拭好，以免散播病原。然后貼上標(biāo)簽，注明病料起源、種類、保留方法、采集時(shí)間等。為預(yù)防病料外漏，須用融化石蠟嚴(yán)封瓶口或管口。 （2）各種病料裝好后，全部置于密封箱膜袋或金屬容器內(nèi)，再置于內(nèi)有冰塊泡沫箱或廣口保溫瓶中。（3）指派專員將病料送到檢驗(yàn)機(jī)關(guān)。送檢人員應(yīng)了解病料起源及疫病流行等情況，同時(shí)要攜帶一份病料送檢單，其主要內(nèi)容、格式可參考下表。表1病料送檢單第號(hào)年月日項(xiàng)目記錄送檢單位、電話、郵編病畜(禽)種類、年紀(jì)、性別特征喂養(yǎng)管理、衛(wèi)生、放牧、使役、牲畜數(shù)字等情況流行病學(xué)情況主要臨床癥狀病了解剖改變病料種類、數(shù)量、保留方法、采集日期送檢目標(biāo)及要求病料送出時(shí)間 送檢單位(蓋章)畜牧獸醫(yī)責(zé)任人(署名) 送檢人員(署名)作業(yè)1.相關(guān)名詞解釋毒力外毒素內(nèi)毒素致病力小白鼠保定法2.問答題1.簡(jiǎn)述試驗(yàn)動(dòng)物接種路徑、適用范圍及注意事項(xiàng)2.簡(jiǎn)述家兔心臟采血步驟及注意事項(xiàng)3.簡(jiǎn)述雞心臟采血和翅下靜脈采血方法

試驗(yàn)九主要病原菌認(rèn)識(shí)【目標(biāo)要求】掌握結(jié)核桿菌抗酸染色法、布氏桿菌柯氏染色法；熟悉結(jié)核桿菌、布氏桿菌形態(tài)特征及培養(yǎng)特征；認(rèn)識(shí)金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、炭疽桿菌等形態(tài)特征。【原理】抗酸染色法分枝桿菌細(xì)胞壁含脂質(zhì)較多,其中主要成份為分枝菌酸,此物具備抗酸性,染色時(shí)與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢靠,能抵抗酸性乙醇脫色作用,所以抗酸菌能保持復(fù)紅顏色,達(dá)成染色目標(biāo)。科茲洛夫斯基染色法因?yàn)楸揪杖玖线^程較慢，較其余細(xì)菌難于著色，所以，慣用科茲洛夫斯基染色法染色，布魯氏菌呈紅色，其余細(xì)菌呈綠色?！酒鞑募霸噭?.菌種：結(jié)核分枝桿菌、布氏桿菌弱毒疫苗；2.儀器：普通光學(xué)顯微鏡；3.材料：載玻片、接種環(huán)、酒精燈、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等；4.染料：石炭酸復(fù)紅染色液、3%鹽酸酒精脫色、美藍(lán)染色液、2％沙黃、1％孔雀綠。5.標(biāo)本片:金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、炭疽桿菌、魏氏梭菌、破傷風(fēng)梭菌、豬丹毒桿菌等。【操作步驟】1.抗酸染色法（1）細(xì)菌抹片制備；（2）滴加較多石炭酸復(fù)紅染色液，在微火上加熱至有蒸汽出現(xiàn)（切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時(shí)離開），不停補(bǔ)充染色液，加熱3-5分鐘，水洗；（3）用3%鹽酸酒精脫色30秒-1分鐘，直至乙醇液呈淡紅色或無色，水洗；（4）用美藍(lán)染色液染1分鐘，水洗；（5）干燥、鏡檢，分枝桿菌為紅色，其余菌為蘭色。2.科茲洛夫斯基法

（1）細(xì)菌抹片制備；（2）用2％沙黃（即番紅花紅）水溶液加溫染色，出現(xiàn)氣泡為止（約1.5分鐘），充分水洗1～2分鐘；（3）再用1％孔雀綠水溶液染色0.5～1分鐘（亦可用美蘭液代替孔雀綠），水洗、干燥、鏡檢。(4)本菌呈紅色，其余菌呈綠色（最好40分鐘內(nèi)鏡檢，經(jīng)久則紅色褪去）3.其余標(biāo)本片觀察（1）金黃色葡萄球菌 革蘭氏染色陽(yáng)性。呈葡萄串狀。無芽孢，無莢膜。（2）鏈球菌為革蘭氏染色陽(yáng)性菌，呈鏈狀排列。（3）大腸埃希氏菌革蘭氏陰性短桿菌，常單獨(dú)存在，偶呈短鏈排列，無芽孢，不形成莢膜。（4）沙門氏菌為革蘭氏陰性兩端鈍圓小桿菌，多單個(gè)散在，偶有呈2-3個(gè)菌體相連短鏈，無芽孢及莢膜。（5）巴氏桿菌革蘭氏陰性類球桿菌，菌體兩端鈍圓，單個(gè)散在，偶有成雙排列，本菌呈經(jīng)典兩極染色。（6）炭疽桿菌在瑞氏或美藍(lán)染色組織標(biāo)本中為兩端平截粗大桿菌，單個(gè)存在或成雙、或呈短鏈排列，竹節(jié)狀，有莢膜，無芽孢。但在人工培養(yǎng)物涂片標(biāo)本中，革蘭氏染色為陽(yáng)性大桿菌，呈長(zhǎng)鏈排列，無莢膜，有卵圓形中央芽孢。（7）梭狀芽孢桿菌魏氏梭菌在組織(腸粘膜)和純培養(yǎng)染片中，均為大桿菌，多數(shù)單個(gè)散在，少數(shù)兩個(gè)相連，革蘭氏陽(yáng)性，菌體兩端較齊，不論組織片或純培養(yǎng)都少見芽孢，若偶然見到，芽孢呈橢圓，不比菌體寬，位于菌體中心或偏端。破傷風(fēng)梭菌在培養(yǎng)物染片中，繁殖菌體細(xì)長(zhǎng)，兩端鈍圓，革蘭氏陽(yáng)性，芽孢圓形，位于菌體一末端，且比菌體寬許多，呈“鼓槌狀”。（8）豬丹毒桿菌為革蘭氏陽(yáng)性，平直或微彎纖細(xì)短桿菌。不形成莢膜和芽孢。一．名詞解釋抗酸染色法二問答題1．簡(jiǎn)述結(jié)核桿菌形態(tài)學(xué)特征2.簡(jiǎn)述布氏桿菌形態(tài)學(xué)特征

試驗(yàn)十病毒雞胚培養(yǎng)【目標(biāo)要求】1.了解動(dòng)物病毒用雞胚培養(yǎng)意義及用途2.掌握雞胚接種方法；3.掌握病毒雞胚培養(yǎng)基本方法【原理】雞胚是正在發(fā)育活機(jī)體，組織分化程度低，細(xì)胞代謝旺盛，適于許多人類和動(dòng)物病毒生長(zhǎng)增殖，是慣用病毒分離培養(yǎng)方法之一（衣原體、立克次體分離亦用雞胚）?，F(xiàn)在，雞胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、皰疹病毒及腦炎病毒，尤其在禽類病毒研究上應(yīng)用較多。可用于病毒分離、判定，抗原和疫苗制備，以及病毒性質(zhì)研究等。雞胚培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)是，起源充分，價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，無需特殊設(shè)備或條件，易感病毒譜較廣，對(duì)接種病毒不產(chǎn)生抗體等。通常說來，孵育至9-12天雞胚最有利于病毒生長(zhǎng)，因?yàn)榇穗A段雞胚發(fā)育日趨完善，各種臟器均已形成，已能經(jīng)受接種物適當(dāng)刺激，同時(shí)胚胎細(xì)胞幼嫩，骨胳不健全，還未長(zhǎng)出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同時(shí)也有利于收獲高滴度病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛漸生，已不便感染病毒，尤其是已不利于收獲病毒材料。圖1雞胚基本結(jié)構(gòu)1.氣室2.卵殼3.卵黃囊4.卵白5.尿囊腔6.絨毛尿囊7.胚胎8.羊水腔9.胚外體液膜用雞胚孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黃陷入胚胎腹部，另一部分則仍留在體外，胚胎已發(fā)育成小雞，破殼而出。雞胚基本結(jié)構(gòu)如圖1，從圖中能夠看出，雞胚最外層為石灰質(zhì)卵殼，上有氣孔供氣體交換，卵殼之下為殼膜，很易與卵殼分離，其功效是使氣體分子與胚胎內(nèi)液體分子在內(nèi)外進(jìn)行交換，所以在孵育時(shí)需要有一定濕度和空氣。假如濕度太低，雞胚就輕易脫水、引發(fā)雞胚死亡。氣流不通，雞胚缺氧，一樣會(huì)造成雞胚死亡。雞胚鈍頭（俗稱“圖1雞胚基本結(jié)構(gòu)1.氣室2.卵殼3.卵黃囊4.卵白5.尿囊腔6.絨毛尿囊7.胚胎8.羊水腔9.胚外體液膜用雞胚羊膜是胚胎最內(nèi)層包被，系外胚層和中胚層形成，羊膜腔內(nèi)含羊水，胚胎浸于其中，羊水在起初是單純生理鹽水溶液，以后蛋白質(zhì)含量增加。羊水量在8-15日齡時(shí)最高，平均約為1毫升左右。附著于胚胎上是卵黃囊，其膜系由內(nèi)胚層和中胚層形成，內(nèi)包卵黃，是胚胎發(fā)育養(yǎng)料。卵尖端（俗稱“小頭”）是卵白，是胚胎發(fā)育晚期養(yǎng)料。除雞胚外，其它禽類胚胎也慣用于動(dòng)物病毒分離培養(yǎng)等研究上，如鴨胚、鵝胚、鴿胚等，其操作技術(shù)不作詳述，可參考雞胚之操作進(jìn)行。【試驗(yàn)器材】孵化箱、檢卵器（檢卵箱或手持檢卵燈）、卵架、打孔器、鑷子、酒精燈、無菌眼科鑷子和剪刀、吸頭、洗耳球、注射器、適用針頭、無菌試管、平皿、三角瓶、燒杯、消毒膠布、石蠟和滅菌生理鹽水等，NDV毒種，9-12日齡雞胚?！静僮鞑襟E】1．雞胚試驗(yàn)室孵育選擇試驗(yàn)室用雞卵，最好用白色薄殼雞蛋，其易于觀察胚胎生活情況。試驗(yàn)用卵通常不宜保留過長(zhǎng)時(shí)間，通常保留期不應(yīng)超出10天，5天以內(nèi)最好。而且不宜在高溫下保留，通常保留于4-20℃，以10℃條件下最好。適宜孵育溫度為38-39℃，相對(duì)濕度為45-60％，并注意空氣流通。孵育3天后天天應(yīng)翻卵1-2次，以確保氣體交換均勻，發(fā)育齊全，從而防止半邊發(fā)育現(xiàn)象出現(xiàn)。孵后第四天用檢卵器對(duì)雞卵進(jìn)行檢視，檢出未受精卵和死亡雞胚。經(jīng)四天孵育后，未受精卵不見有雞胚跡象，僅見含糊卵黃暗影；受精卵則可見清楚血管小團(tuán)，其中有雞胚跡象，較大雞胚可見到胚胎主動(dòng)運(yùn)動(dòng);瀕死或死亡雞胚則見到胚胎運(yùn)動(dòng)呆滯或不運(yùn)動(dòng)，血管昏暗、折斷或漂落，這種雞胚應(yīng)剔出不用。2．雞胚接種、剖視和收獲依照欲接種病毒不一樣，選取不一樣接種路徑，主要應(yīng)考慮最適病毒感染部位、最好接種胚齡和取得最大病毒滴度。慣用接種路徑有尿囊腔、絨毛尿囊膜、羊膜腔、卵黃囊和靜脈等。（1）尿囊腔接種法①選取9-12日齡發(fā)育良好雞胚，照蛋標(biāo)出氣室及胚胎位置，在氣室底邊胚胎附近無大血管處標(biāo)出尿囊腔注射部位。圖2尿囊腔接種法②圖2尿囊腔接種法③在所標(biāo)識(shí)注射部位用剪刀尖端打孔，注意用力要穩(wěn)，恰好使蛋殼打通而不傷及殼膜。為預(yù)防注射接種物時(shí)因胚胎內(nèi)產(chǎn)生壓力而使接種物溢出，可在氣室頂端也打一小孔。④用1毫升注射器抽取接種物，針頭斜面（與卵殼成30o角）刺入注射部位3-5毫米達(dá)尿囊腔內(nèi)，注入接種物。通常接種量為0.1-0.2毫升。⑤另一個(gè)接種方法是只開一小孔，在距氣室底邊0.5厘米處卵殼上打一個(gè)孔，由此孔進(jìn)針注射接種物。⑥注射完成，用熔好石蠟或消毒膠布封閉注射孔和氣室孔。氣室朝上于35-37℃溫箱中孵育。棄去二十四小時(shí)內(nèi)死亡雞胚，因多系機(jī)械損傷、細(xì)菌或霉菌污染等非特異性原因所引發(fā)，以后天天檢卵1-2次。⑦