欖香烯聯(lián)合生物大分子合成抑制劑對Hca

欖香烯聯(lián)合生物大分子合成抑制劑對Hca【摘要】目的本實(shí)驗(yàn)采用欖香烯與生物大分子合成抑制劑聯(lián)合處理小鼠肝癌細(xì)胞Hca-F，觀察腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和形態(tài)學(xué)的變化，探討抑制/干擾腫瘤細(xì)胞的DNA、RNA或蛋白質(zhì)合成對欖香烯抗瘤作用的影響，以期為判斷欖香烯作用的可能靶點(diǎn)提供線索與依據(jù)。方法將Hca-F肝癌細(xì)胞用欖香烯、吡柔比星、單獨(dú)和復(fù)合處理，設(shè)單獨(dú)瘤細(xì)胞為陰性對照。Hca-F細(xì)胞濃度均為1×106/ml，每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)均設(shè)3支復(fù)管，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)算細(xì)胞存活率，在透射電鏡下觀察欖香烯與THP聯(lián)合處理對腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。結(jié)果欖香烯聯(lián)合吡柔比星處理Hca-F比單獨(dú)使用兩種藥物的抑瘤率都高。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)所用生物大分子合成抑制劑不能阻斷欖香烯的抗瘤作用，提示欖香烯抗腫瘤作用對新的蛋白質(zhì)表達(dá)依賴性較低。結(jié)合欖香烯處理后瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，提示欖香烯可能作用于腫瘤細(xì)胞膜或細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)等而直接殺傷腫瘤靶細(xì)胞，使對欖香烯抗瘤作用靶點(diǎn)的認(rèn)識又進(jìn)了一步。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明欖香烯和THP合用可使抗癌作用增強(qiáng)，這對欖香烯聯(lián)合其他藥物治療腫瘤可能有一定參考意義。

【關(guān)鍵詞】欖香烯；抑制劑；肝細(xì)胞癌

Theeffectofelemenecombinedwithinhibitorsofmacromolecularsynthesisforhepaticcancer

【Abstract】ObjectiveInthisexperimentofHca-Fcells(amurinehepaticcellcarcinoma)weretreatedwithelemenecombinedwithinhibitorsofmacromolecularsynthesis，theirproliferation，survival，cellcycle，apoptosisandmorphologywereobserved.ToclarifytheinfluencesofinhibitionofDNA，RNAandproteinontheantitumoreffectsofelemeneandtofindthepossibletargetsiteofTheHca-Fcellsweresingledormingledtreatedwithelemene，aloneorcombinedwithTHP，theHca-Fcells(withouttreatment)wereusedtobethenegativecompare.TheendconsistenceofHca-Fcellsis1×106/ml，threetublesineverytimepoint.Tocalculatetheproportionofsurvivalwithtrypanblue，andobservetheimpactontheultrastructureofHca-FcellstreatedwithelemeneandTHPintransmissionelectronmicroscope，andexaminetheapoptosisandcellcyclesinflowcytometer.ResultsTheinhibitionrateofproliferationofHca-FtreatedwithelemeneandTHPwashigherthanthatofHca-FtreatedwithelemeneTheseresultsshowedthattheantitumoreffectsofelemenecouldnotabolishedbycombinedtreatmentorpretreatmentwiththeinhibitorsofDNA，RNA，proteinsynthesis，whichsuggestthattheantitumoreffectsofelemenemaybeindependentontheirsynthesis.CombinedusageofelemenewithTHPtocancertherapyisadvisable.

【Keywords】elemene；inhibitor；hepatocellularcarcinoma

欖香烯(elemene)是從中藥溫莪術(shù)揮發(fā)油中提取的抗癌有效成分，它是一種僅含碳?xì)?C15H24)，分子量只有204的小分子、脂溶性的倍半萜類化合物，此類物質(zhì)有抗癌活性屬我國首報(bào)［1］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床應(yīng)用均表明欖香烯的抗癌作用確切，而且不良反應(yīng)很低。我們過去的研究表明欖香烯處理除可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡外，還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，欖香烯處理能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞膜HSP70的表達(dá)，用表達(dá)譜基因芯片技術(shù)的研究表明欖香烯處理引起基因表達(dá)譜的變化。過去對欖香烯抗癌作用機(jī)制的研究僅限于欖香烯對腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡、免疫原性等的影響，關(guān)于它的作用靶點(diǎn)及其信號傳導(dǎo)通路迄今研究很少。本實(shí)驗(yàn)在上述研究的基礎(chǔ)上，采用欖香烯與生物大分子合成抑制劑聯(lián)合處理小鼠肝癌細(xì)胞Hca-F，觀察腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和形態(tài)學(xué)的變化，探討抑制或干擾腫瘤細(xì)胞的DNA、RNA或蛋白質(zhì)合成對欖香烯抗瘤作用的影響，以期為判斷欖香烯作用的可能靶點(diǎn)提供線索與依據(jù)。

1材料與方法

1．1動(dòng)物Balb/c系小鼠，引自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京藥物研究所，由本室自行繁殖提供。

1．2瘤株小鼠腹水型肝癌H22的高淋巴道轉(zhuǎn)移亞系Hca-F［2］，由本校病理學(xué)教研室凌茂英教授贈(zèng)送，本室常規(guī)傳代、保種。

主要藥品和試劑1%欖香烯注射液(elemene，大連市醫(yī)藥科學(xué)研究所)。吡柔比星(Pirarubicin，THP，深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。RPMI1640培養(yǎng)基。

Hca-F細(xì)胞懸液的制備將傳代保種的Hca-F腹水型肝癌細(xì)胞常規(guī)接種于小鼠腹腔，/只，收集第7～8天的腹水，HS液破除紅細(xì)胞，PBS洗3次，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，用含20%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞數(shù)至所需濃度。

Hca-F肝癌細(xì)胞的處理將Hca-F肝癌細(xì)胞用欖香烯、吡柔比星按本室常規(guī)方法單獨(dú)或復(fù)合處理，設(shè)單獨(dú)瘤細(xì)胞對照。Hca-F細(xì)胞濃度均為1×106/ml，每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)均設(shè)3支復(fù)管，加入相應(yīng)的藥品，以臺(tái)盼藍(lán)拒染法于不同時(shí)間計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算存活率。

單純欖香烯處理和欖香烯聯(lián)合THP處理對Hca-F增殖的影響用MTT法測其OD值。

欖香烯聯(lián)合THP處理對瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響［3］Hca-F細(xì)胞用欖香烯、THP單一或復(fù)合處理，細(xì)胞濃度和處理方法同前，處理時(shí)間為1h，收細(xì)胞，用PBS洗3次，以%戊二醛固定，常規(guī)包埋制片，鈾—鉛雙染色，透射電鏡下觀察攝片。

細(xì)胞凋亡的檢測和細(xì)胞周期的測定細(xì)胞收集同前，用PBS洗3次，加入PI染色液染色30min。上機(jī)檢測，Cellquest軟件低速獲取。用軟件分析。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

欖香烯聯(lián)合THP處理對Hca-F存活的影響單純用欖香烯處理，Hca-F的存活率就明顯降低，在30min～1h的時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞死亡率隨著藥物濃度增加而增加，單用THP處理，也可導(dǎo)致Hca-F細(xì)胞死亡、藍(lán)染，其細(xì)胞死亡率也隨著藥物濃度增加而增加，欖香烯聯(lián)合THP處理，腫瘤細(xì)胞死亡率可達(dá)100%。

表1欖香烯單獨(dú)或聯(lián)合THP處理對Hca-F細(xì)胞存活的影

欖香烯和THP聯(lián)合處理對Hca-F細(xì)胞周期與凋亡的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明欖香烯與THP聯(lián)合處理對Hca-F細(xì)胞周期變化的影響及凋亡細(xì)胞百分率變化與單用THP相比也無明顯區(qū)別，欖香烯處理與不處理Hca-F對照組細(xì)胞各時(shí)相百分率及凋亡細(xì)胞百分率變化無明顯區(qū)別。

表2欖香烯聯(lián)合THP處理對Hca-F細(xì)胞周期與凋亡的影響

欖香烯聯(lián)合THP處理對Hca-F細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響見圖2。圖2可示：當(dāng)欖香烯與THP聯(lián)合處理的腫瘤細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮，核縮小，細(xì)胞腫脹破裂，細(xì)胞完整性受到明顯破壞，而單純用THP處理的30min內(nèi)大多數(shù)沒有明顯改變，受損細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化不典型，偶可見到凋亡、壞死的細(xì)胞，但比率并不高。圖1A：對照組；B：欖香烯50μg/ml；C：THP10μmol/ml；

D：欖香烯50μg/ml聯(lián)合THP10μmol/ml對Hca-F細(xì)胞周期影響的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果

圖1流式細(xì)胞儀分析結(jié)果

A：THP10μmol/ml；B：欖香烯50μg/ml聯(lián)合THP10μmol/ml；

C：對照組；D：欖香烯50μg/ml

圖2欖香烯聯(lián)合THP處理對后Hca-F細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變【摘要】目的本實(shí)驗(yàn)采用欖香烯與生物大分子合成抑制劑聯(lián)合處理小鼠肝癌細(xì)胞Hca-F，觀察腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和形態(tài)學(xué)的變化，探討抑制/干擾腫瘤細(xì)胞的DNA、RNA或蛋白質(zhì)合成對欖香烯抗瘤作用的影響，以期為判斷欖香烯作用的可能靶點(diǎn)提供線索與依據(jù)。方法將Hca-F肝癌細(xì)胞用欖香烯、吡柔比星、單獨(dú)和復(fù)合處理，設(shè)單獨(dú)瘤細(xì)胞為陰性對照。Hca-F細(xì)胞濃度均為1×106/ml，每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)均設(shè)3支復(fù)管，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)算細(xì)胞存活率，在透射電鏡下觀察欖香烯與THP聯(lián)合處理對腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。結(jié)果欖香烯聯(lián)合吡柔比星處理Hca-F比單獨(dú)使用兩種藥物的抑瘤率都高。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)所用生物大分子合成抑制劑不能阻斷欖香烯的抗瘤作用，提示欖香烯抗腫瘤作用對新的蛋白質(zhì)表達(dá)依賴性較低。結(jié)合欖香烯處理后瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，提示欖香烯可能作用于腫瘤細(xì)胞膜或細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)等而直接殺傷腫瘤靶細(xì)胞，使對欖香烯抗瘤作用靶點(diǎn)的認(rèn)識又進(jìn)了一步。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明欖香烯和THP合用可使抗癌作用增強(qiáng)，這對欖香烯聯(lián)合其他藥物治療腫瘤可能有一定參考意義。

【關(guān)鍵詞】欖香烯；抑制劑；肝細(xì)胞癌

Theeffectofelemenecombinedwithinhibitorsofmacromolecularsynthesisforhepaticcancer

【Abstract】ObjectiveInthisexperimentofHca-Fcells(amurinehepaticcellcarcinoma)weretreatedwithelemenecombinedwithinhibitorsofmacromolecularsynthesis，theirproliferation，survival，cellcycle，apoptosisandmorphologywereobserved.ToclarifytheinfluencesofinhibitionofDNA，RNAandproteinontheantitumoreffectsofelemeneandtofindthepossibletargetsiteofTheHca-Fcellsweresingledormingledtreatedwithelemene，aloneorcombinedwithTHP，theHca-Fcells(withouttreatment)wereusedtobethenegativecompare.TheendconsistenceofHca-Fcellsis1×106/ml，threetublesineverytimepoint.Tocalculatetheproportionofsurvivalwithtrypanblue，andobservetheimpactontheultrastructureofHca-FcellstreatedwithelemeneandTHPintransmissionelectronmicroscope，andexaminetheapoptosisandcellcyclesinflowcytometer.ResultsTheinhibitionrateofproliferationofHca-FtreatedwithelemeneandTHPwashigherthanthatofHca-FtreatedwithelemeneTheseresultsshowedthattheantitumoreffectsofelemenecouldnotabolishedbycombinedtreatmentorpretreatmentwiththeinhibitorsofDNA，RNA，proteinsynthesis，whichsuggestthattheantitumoreffectsofelemenemaybeindependentontheirsynthesis.CombinedusageofelemenewithTHPtocancertherapyisadvisable.

【Keywords】elemene；inhibitor；hepatocellularcarcinoma

欖香烯(elemene)是從中藥溫莪術(shù)揮發(fā)油中提取的抗癌有效成分，它是一種僅含碳?xì)?C15H24)，分子量只有204的小分子、脂溶性的倍半萜類化合物，此類物質(zhì)有抗癌活性屬我國首報(bào)［1］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床應(yīng)用均表明欖香烯的抗癌作用確切，而且不良反應(yīng)很低。我們過去的研究表明欖香烯處理除可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡外，還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，欖香烯處理能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞膜HSP70的表達(dá)，用表達(dá)譜基因芯片技術(shù)的研究表明欖香烯處理引起基因表達(dá)譜的變化。過去對欖香烯抗癌作用機(jī)制的研究僅限于欖香烯對腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡、免疫原性等的影響，關(guān)于它的作用靶點(diǎn)及其信號傳導(dǎo)通路迄今研究很少。本實(shí)驗(yàn)在上述研究的基礎(chǔ)上，采用欖香烯與生物大分子合成抑制劑聯(lián)合處理小鼠肝癌細(xì)胞Hca-F，觀察腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和形態(tài)學(xué)的變化，探討抑制或干擾腫瘤細(xì)胞的DNA、RNA或蛋白質(zhì)合成對欖香烯抗瘤作用的影響，以期為判斷欖香烯作用的可能靶點(diǎn)提供線索與依據(jù)。

1材料與方法

1．1動(dòng)物Balb/c系小鼠，引自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京藥物研究所，由本室自行繁殖提供。

1．2瘤株小鼠腹水型肝癌H22的高淋巴道轉(zhuǎn)移亞系Hca-F［2］，由本校病理學(xué)教研室凌茂英教授贈(zèng)送，本室常規(guī)傳代、保種。

主要藥品和試劑1%欖香烯注射液(elemene，大連市醫(yī)藥科學(xué)研究所)。吡柔比星(Pirarubicin，THP，深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。RPMI1640培養(yǎng)基。

Hca-F細(xì)胞懸液的制備將傳代保種的Hca-F腹水型肝癌細(xì)胞常規(guī)接種于小鼠腹腔，/只，收集第7～8天的腹水，HS液破除紅細(xì)胞，PBS洗3次，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，用含20%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞數(shù)至所需濃度。

Hca-F肝癌細(xì)胞的處理將Hca-F肝癌細(xì)胞用欖香烯、吡柔比星按本室常規(guī)方法單獨(dú)或復(fù)合處理，設(shè)單獨(dú)瘤細(xì)胞對照。Hca-F細(xì)胞濃度均為1×106/ml，每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)均設(shè)3支復(fù)管，加入相應(yīng)的藥品，以臺(tái)盼藍(lán)拒染法于不同時(shí)間計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算存活率。

單純欖香烯處理和欖香烯聯(lián)合THP處理對Hca-F增殖的影響用MTT法測其OD值。

欖香烯聯(lián)合THP處理對瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響［3］Hca-F細(xì)胞用欖香烯、THP單一或復(fù)合處理，細(xì)胞濃度和處理方法同前，處理時(shí)間為1h，收細(xì)胞，用PBS洗3次，以%戊二醛固定，常規(guī)包埋制片，鈾—鉛雙染色，透射電鏡下觀察攝片。

細(xì)胞凋亡的檢測和細(xì)胞