細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)之精

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)之精

實(shí)驗(yàn)?zāi)康募?xì)胞凋亡的檢測——了解細(xì)胞凋亡的檢測方法加深對細(xì)胞凋亡現(xiàn)象及本質(zhì)的理解練習(xí)從形態(tài)學(xué)角度評價(jià)細(xì)胞凋亡掌握熒光顯微鏡的使用方法細(xì)胞凋亡的檢測——

實(shí)驗(yàn)原理基本概念：細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是指細(xì)胞基因調(diào)控的一種自主性的自殺現(xiàn)象?；蛘哒f在一定的生理或病理?xiàng)l件下，細(xì)胞遵循自身的程序，自我結(jié)束生命的死亡方式。由于這種死亡方式是由基因調(diào)控的死亡過程，因此又稱之為程序性細(xì)胞死亡(ProgrammedCellDeath)。細(xì)胞凋亡有別于細(xì)胞壞死。似秋葉的凋零，告別生命之輝煌；那難以計(jì)數(shù)的攻擊、誘導(dǎo)，輕啟著道道程序，逼細(xì)胞步步走向生命的末端；啊，活性氧處處肆虐，鈣波濤驚石裂岸，線粒體把生命之光一點(diǎn)一點(diǎn)擰淡;危難中的細(xì)胞啊，你沉穩(wěn)不亂，DNA片片切割，化云梯直通天堂；細(xì)胞體分團(tuán)相聚，把生命的凝重濃集在小體上；分別了朝夕相處的伙伴，再見了快樂美好的時光；這一切的一切又融入臨近的胞體，騰出的空間再寫生命的篇章。

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別—————————————————————————————————————————————————————————壞死凋亡強(qiáng)烈刺激，隨機(jī)發(fā)生較弱刺激，非隨機(jī)發(fā)生被動過程，無新蛋白合成，不耗能主動過程，有新蛋白合成，耗能細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞、細(xì)胞腫脹

胞膜及細(xì)胞器相對完整細(xì)胞皺縮，核固縮彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀DNA片段化（180-200bp），電泳呈“梯”狀條帶溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng)溶酶體相對完整，局部無炎癥反應(yīng)有病理性，非特異性生理性或病理性，特異性無有無細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征（1）凋亡的起始；微絨毛的消失，細(xì)胞間接觸的消失，與周圍的細(xì)胞脫離，細(xì)胞質(zhì)中，線拉體大體完整，染色質(zhì)固縮（2）細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞漿，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面（3）凋亡小體的形成。核膜核仁破碎，核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞膜所包圍（4）凋亡小體逐漸被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬。細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征細(xì)胞凋亡與疾病細(xì)胞凋亡不足：腫瘤，自身免疫病細(xì)胞凋亡過度：心肌缺血，心力衰竭，神經(jīng)元退行性疾病，病毒感染細(xì)胞凋亡檢測方法基于形態(tài)學(xué)觀察的染色法基于DNA片斷化的檢測法膜聯(lián)蛋白檢測法Caspase酶分析法流式細(xì)胞儀定量分析法細(xì)胞凋亡的檢測——

實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞凋亡的檢測——

實(shí)驗(yàn)儀器、材料及試劑1、儀器、用具：熒光顯微鏡、顯微載玻片、蓋玻片、微量2、培養(yǎng)的細(xì)胞材料：HeLa細(xì)胞3、試劑：吖碇橙/溴化乙錠（AO/EB)的PBS溶液：PBS溶液中分別加入100μg/mL

的AO與100μg/mL

的EB，配成兩種溶液，用時再混合。磷酸鹽緩沖液（PBS)：800mL蒸餾水中溶解8gNaCL、0.2gKCL、1.44gNa2HPO4

kH2PO4

，用鹽酸調(diào)pH到7.4，加水定容到1L。高壓滅菌保存。移液器、高壓滅菌鍋、細(xì)胞培養(yǎng)用具細(xì)胞凋亡的檢測——

實(shí)驗(yàn)步驟（1）Hela細(xì)胞貼壁生長于DMEM培養(yǎng)液中含10%胎牛血清，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3天，待細(xì)胞形成單層融合狀態(tài)。（2）去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入0.215mol/L雙氧水的10%胎牛血清培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)24~36小時。（3）收集細(xì)胞：用細(xì)胞消化液消化細(xì)胞使細(xì)胞脫壁，制成單細(xì)胞懸液。1000Xg離心力離心5分鐘，棄上清。（4）取25μl培養(yǎng)的細(xì)胞懸液滴于載玻片上，稍風(fēng)干后，加入AO/EB1:1混合液染色，并蓋上蓋玻片。（5）熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞凋亡的檢測——

注意事項(xiàng)1、EB為強(qiáng)誘變劑，使用時要注意防護(hù)2、試劑與細(xì)胞孵育完畢后，要立即檢測3、正確使用顯微鏡，保護(hù)好鏡頭和濾光片細(xì)胞凋亡的檢測——

課后作業(yè)及思考1、練習(xí)用AO/EB法檢測凋亡的細(xì)胞，掌握熒光顯微鏡的使用2、查閱相關(guān)文獻(xiàn)，理清細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別3、了解其它可用于細(xì)胞凋亡檢測的方法及其原理1