實驗四從瓊脂糖凝膠中回收并純化DNA片段

實驗四從瓊脂糖凝膠中回收并純化DNA片段

一、實驗目的學習經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后回收并純化DNA片段的方法二、實驗原理將DNA樣品在瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切割下含目的DNA片段的凝膠塊；在高鹽和促溶劑的作用下，瓊脂糖聚合物中糖之間的氫鍵斷裂而迅速溶解，DNA就從膠基質中釋放出來并選擇性地吸附到球狀的硅膠顆料或特定的柱子上；然后用高鹽緩沖液洗滌除去殘余的瓊脂糖，再用含乙醇的緩沖液洗去鹽和染料。最后用TE緩沖液或水將球狀硅膠顆粒或柱子上的DNA洗脫下來。回收純化后的DNA可直接用于DNA的連接反應、標記反應、測序反應或DNA的微量注射等研究。

三、實驗材料

水浴鍋、離心機、移液器PCR擴增的Rv1791基因AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0（Taraka）試劑盒采用了獨特的凝膠融解系統(tǒng)，結合DNA制備膜技術，具有高效、快速、方便之特點，全套操作只需30分鐘便可完成。本試劑盒回收純化的DNA片段純度高，完整性好，可直接用于連接反應、PCR擴增、DNA測序等各種分子生物學實驗。四、實驗步驟（1）實驗三中的PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。（2）在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率。切膠時不要將DNA長時間暴露于紫外燈下，以防止DNA損傷。（3）切碎膠塊。膠塊切碎后可以減少步驟6的膠塊融化時間，提高DNA的回收率。（4）稱量膠塊重量，計算膠塊體積。計算膠塊體積時，以1mg=1μl進行計算。（5）向膠塊中加入3倍凝膠體積的膠塊融化液DR-IBuffer。（6）均勻混合后75℃加熱融化膠塊，此時應間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約6～10min）。（7）向上述膠塊融化液中加入DR-IBuffer量的1/2體積量的DR-IIBuffer，均勻混合。當分離小于400bp的DNA片段時，應在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。（8）離心柱放入收集管中，將步驟7的溶液轉移至離心柱中，12,000rpm，1min，棄濾液。如將濾液再加入離心柱中離心一次，可以提高DNA的回收率。（9）將500μl的RinseA加入離心柱中，12,000rpm，30s，棄濾液。（10）將700μl的RinseB加入離心柱中，12,000rpm，30s，棄濾液。（11）重復操作步驟10，將離心柱放入收集管中，12,000rpm，1min。（12）將離心柱放入新的指形管中，在離心柱膜的中央處加入25μl的滅菌蒸餾水或ElutionBuffer，室溫靜置1min。注）把滅菌蒸餾水或ElutionBuffer加熱至60℃使用時有利于提高洗脫效率。（13）12,000rpm，1min，洗脫DNA。五