兔自身免疫性干眼模型制作及檢測

兔自身免疫性干眼模型制作及檢測第一頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型概要通過體外分離、培養(yǎng)兔淚腺上皮細胞和自體外周血淋巴細胞，建立二者的共培養(yǎng)體系。將體外激活的自體外周血淋巴細胞通過耳緣靜脈注射的方法誘發(fā)自身免疫性淚腺炎。從而建立穩(wěn)定的兔自身免疫性干眼模型，對干眼臨床指標及淚腺細胞因子表達進行檢測。第二頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型實驗動物：成年雌性新西蘭白兔，體質量2.6～3.5kg。實驗前進行兔子臨床眼科檢查,排除已患有眼部炎癥和其他疾病的動物，建立正常兔眼的臨床檢查指標的基線水平。飼養(yǎng)環(huán)境符合醫(yī)學實驗動物環(huán)境的要求，動物飼養(yǎng)房溫度為25±2℃，相對濕度50%～75%，12小時光照晝夜循環(huán)，通風狀況好。第三頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型實驗所用的主要儀器、設備及材料：生物超凈工作臺CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱移液槍-80℃超低溫冰箱倒置相差顯微鏡臺式離心機裂隙燈顯微鏡攝像系統(tǒng)離心管、槍頭PCR儀實時定量PCR儀流式細胞儀流式管超純水裝置低溫水箱裂隙燈顯微鏡恒溫水浴鍋眼科手術器械禍旋儀高壓蒸汽消毒器電子天平鼓風式干燥箱磁力攪拌器PH測量計熒光顯微鏡SY-600恒溫水箱Nylon細胞濾網第四頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型主要試劑及溶液配制：淋巴細胞培養(yǎng)基（CM）RPMI1640細胞培養(yǎng)基450ml胎牛血清（FBS）10%青鏈霉素100U/mlL-谷氨酰胺2mM2-mercaptoethano0.5ml淚腺上皮細胞培養(yǎng)基（DMEM）DMEM（1Xhighglucose）450ml胎牛血清（FBS）10%青鏈霉素100U/mlL-谷氨酰胺2mM第五頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型主要試劑及溶液配制：Ham's液Ham'sF-12

1LHepes

10ml/L牛血清蛋白蛋白（BSA）100U/ml胰蛋白酶抑制劑50mg/L丁酸0.22g/L青鏈霉素100U/mlL-谷氨酰胺2mM亞油酸1mg/ml42ul各組分充分溶解于900mlHam’sF-12后調節(jié)PH值至7.4，Ham’sF-12定容至1000ml，0.22μm濾器過濾，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。第六頁，共二十七頁，編輯?023年，星期五兔自身免疫性干眼模型主要試劑及溶液配制：Hank's液HanksSalts

1bottleHepes

2.38gEDTA0.76g各組分充分溶解于900ml超純水后調節(jié)PH值至7.4，超純水定容至1000mL，0.22μm濾器過濾，4℃冰箱避光保存?；旌舷福–DH）膠原酶collagenaseⅠ

450unit/ml透明質酸酶hyyaluronidase

200unit/mlDNA酶Ⅰ25unit/ml分別稱取計算好的Ⅰ型膠原酶和透明質酸酶，將其充分溶解于一定體積的Ham’s液中，加入溶解分裝好的DNA酶充分混勻，0.22μm濾器過濾，4℃冰箱備用。第七頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型主要試劑及溶液配制：10%FicollFicoll粉與DPBS按比例配制高壓滅菌,分裝后-20'C避光保存。實時突光定量PCR試劑盒SYBRGreen(Roche491385001)PE-Anti-HumanFoxp3(Biolegend)Anti-RabbitCD4(Mouseanti-RabbitMonoclonalAntibodyAbD)淋巴細胞分離液無RNA酶水（DEPC水）第八頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型實驗方法：1、兔淚腺上皮細胞分離、純化、培養(yǎng)（1）新西蘭大白兔肌肉注射陸眠寧和氯胺酮（兩者的比例為2:3，0.3-0.4ml/kg）進行麻醉，剪去兔左眼睫毛，將生理鹽水和碘伏按1:1稀釋，充分清洗術眼結膜囊，再用生理鹽水清洗，以免碘伏刺激眼表，后用0.5%鹽酸丁卡因滴眼液滴術眼，后用無菌手術器械將麻醉后的兔子在超凈臺中操作摘取兔左下淚腺,將淚腺轉移到提前配置好的裝有雙抗和Ham’s液的50ml離心管中。（2）在細胞間超凈臺進行以下操作，將淚腺和少量的Ham’s液放入培養(yǎng)皿中，先剔除淚腺組織周圍的血管、脂肪組織和筋膜，無菌刀將腺體切碎至約1mm×1mm的組織塊，用移液槍加入Hank’s液后吹打吹散組織塊，轉移到50ml離心管中傾斜靜置15min，棄掉上清。（3）然后再加入Ham’s液吹打均勻傾斜靜置15min，小心棄掉上清，以防組織塊的丟失。（4）加入配置好的消化酶（膠原酶，透明質酸酶，DNA酶）,磁力攪拌器提前設置好溫度和轉速，37℃恒溫水浴消化10min。第九頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型實驗方法：1、兔淚腺上皮細胞分離、純化、培養(yǎng)（5）取出后靜置15min，棄掉上清，加入10mlHank’s液反復吹打后靜置15min，棄掉上清。（6）再加入配置好剩余的消化酶，37℃水浴消化30min，觀察組織塊的大小，可適當的增減10min。（7）然后用Ham’s液浸潤40μm無菌細胞篩，將其置于50ml離心管上，將稀釋后的混合液吹打均勻后過濾，1000rpm離心6min，棄上清。（8）加入20mlHank’s液吹打均勻，離心1000rpm，6min，棄上清，加入5mlHam’s液充分混勻。（9）提前準備質量分數為10%的Ficoll（SigmaFicoll粉與Ham’s液配制），用Ham’s液稀釋到2%、3%、4%，從下到上依次為4%、3%、2%各5ml加入50ml離心管中，將細胞懸液緩慢加入到Ficoll液面上，進行密度梯度離心，400rpm離心10min，上下加速度為0。第十頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型實驗方法：1、兔淚腺上皮細胞分離、純化、培養(yǎng)（10）離心后，細胞在最底層。棄上清，用PBS緩沖液洗兩遍細胞，洗掉雜質和Ficoll，離心結束盡可能棄干凈上清。（11）加入DMEM完全培養(yǎng)基（10%FBS+1%雙抗+1%谷氨酰胺+DMEM基礎培養(yǎng)基），進行細胞計數和細胞活性觀察，細胞計數后取一定數量105細胞于100μLPBS內吹打均勻，再加入100μL的臺盼藍，顯微鏡下觀察計數板上細胞染色情況，計錄未著染的細胞百分比。（12）將分離的淚腺上皮細胞1.5×105/孔放置24孔板中于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第十一頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型實驗方法：2、兔外周血淋巴細胞分離、培養(yǎng)（1）將新西蘭大白兔固定，兔耳中動脈碘伏消毒后用酒精棉球擦拭使其血管擴張，用提前準備的靜脈采血針和采血管采血，每只兔預計抽大約20mL的外周血。（2）用提前預熱的37℃的PBS緩沖液將外周血稀釋3倍后裝在50mL離心管中（每管約30ml）。（3）將每管約30ml稀釋的外周血緩慢加入到10mL淋巴細胞分離液液面上，離心2000rpm，20min，上下加速度為0。（4）離心后可見離心管中分三層，在上、中間層界面處有一以淋巴細胞為主的白色云霧狀狹窄帶，這一層細胞即為所需要，吸取收集該層淋巴細胞帶放入新的50mL離心管中。（5）加入PBS緩沖液，離心2000rpm，10min,棄上清，再加入PBS緩沖液離心。第十二頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型實驗方法：2、兔外周血淋巴細胞分離、培養(yǎng)（6）加淋巴細胞培養(yǎng)基（10%FBS+1%雙抗+1%谷氨酰胺+RPMI1640培養(yǎng)基+β巰基乙醇），計數，進行細胞計數和細胞活性觀察，細胞計數后取一定數量105細胞于100μLPBS內吹打均勻，再加入100μL的臺盼藍，計錄未著染的細胞百分比。（7）分別配制與淚腺上皮細胞等密度的細胞液。第十三頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型實驗方法：3、建立自體細胞混合培養(yǎng)體系淚腺上皮細胞培養(yǎng)于平底24孔板內（1.5x105個/孔），單獨培養(yǎng)2d的淚腺上皮細胞，進行γ線照射（劑量為25Gy），使其失去反應能力，成為刺激細胞。載有淚腺上皮細胞的24孔板照完射線后，每孔加入當天分離等數量的外周血淋巴細胞1.5×105個，此時淚腺上皮細胞已貼壁，淋巴細胞為懸浮細胞，加入淋巴細胞時候小心緩慢加入，以防吹起已貼壁的淚腺上皮細胞，建立混合培養(yǎng)體系，培養(yǎng)5天。第十四頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型實驗方法：4、自身免疫干眼模型的制備（1）實驗分組：24只術前檢查合格的雌性新西蘭大白兔，按照隨機數表法給兔子編號，分為2組即正常對照組，干眼模型組。干眼模型組為靜脈回輸自體激活的外周血淋巴細胞誘導的兔自身免疫性干眼。正常對照組為靜脈回輸與干眼模型組等體積的PBS緩沖液。（2）干眼模型的制備：將標注好的雌性新西蘭白兔固定，預先準備好輸液器、5ml、10ml針管、酒精、碘伏，以及預先準備好的淋巴細胞（混合體系混合培養(yǎng)5天，觀察發(fā)現(xiàn)淋巴細胞較之前體積變大，呈圓形，聚集性分布，周圍可見圍繞的淚腺上皮細胞，用1ml槍頭緩慢吹起落在底部的淋巴細胞，收集到50ml離心管中，在這個過程中在顯微鏡下觀察進來避免吹起貼壁的淚腺上皮細胞，用PBS緩沖液將24孔板洗兩遍，2000rpm離心10min，棄掉上清，再用PBS緩沖液洗一遍，之后加1ml的PBS緩沖液計數，吹散細胞，盡可能不要有細胞團塊避免栓塞發(fā)生的可能，最后按照淋巴細胞2×105每只兔子的數量，每只兔子1ml轉移到50ml離心管中放在冰上保持細胞活性，以備使用）。第十五頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型實驗方法：4、自身免疫干眼模型的制備釆用靜脈輸液器，預先將PBS充滿整個靜脈回輸裝置排空空氣預防空氣栓塞。通過耳緣靜脈回輸激活的自體激活的外周血淋巴細胞（2x106/ml，1ml）為干眼模型組，耳緣靜脈碘伏消毒后用2ml的注射器推注1mLPBS確保液體進入靜脈血管中，然后在接頭處換成有細胞液的注射器，注射前保證無細胞沉淀以防栓塞，勻速推注，最后換成裝有PBS的注射器，再輸入1ml左右的PBS保證細胞完全進入到血管中，以防細胞丟失。靜脈回輸等量PBS的新西蘭白兔為對照組。第十六頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型臨床指標的檢測：移植前和移植后2周、4周、6周分別進行以下臨床指標的觀察：淚液分泌量實驗（Schirmer’sⅠ實驗）將兔子固定好，在非表麻條件下，將Schirmer’s試紙條頂端放置于下穹窿結膜中外側1/3處，檢查者輔助閉合兔眼，此時盡量避免兔子第三眼瞼遮住角膜以及試紙條，計時1分鐘后取出試紙條，記錄濕潤長度，試驗過程中盡量避免試紙條接觸角膜，以免造成角膜上皮損傷。淚膜穩(wěn)定性實驗（淚膜破裂時間tearbreak-uptime，BUT）將兔子固定好，眼表滴10μL熒光素液，檢查者輔助兔眨眼3次，計時1分鐘，檢查者輔助打開上下眼瞼，檢查者用手持裂隙燈，在鈷藍光下觀察角膜表面淚膜破裂時間以及淚河高度，重復三次取平均值。角膜、結膜熒光素鈉染色實驗將兔子固定好，復方托比卡按散瞳，等待大約十分鐘，等其瞳孔完全散開后，眼表滴10μL熒光素液，計時1分鐘，使熒光素液均勻平鋪于眼表，檢查者輔助打開上下眼瞼，將裂隙燈下調至鈷藍光，觀察角膜、結膜的著染情況并拍照記錄。第十七頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型組織病理學觀察：分別于移植后6周從各組中新西蘭大白兔注射戊巴比妥鈉（56mg/kg）處死兔子，分離上下淚腺、結膜、角膜置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色后觀察浸潤細胞的情況。（1）取淚腺、結膜等組織塊，用10%甲醛溶液固定，固定后常規(guī)石蠟包埋，切片。（2）石蠟包埋切片后用二甲苯脫蠟，二甲苯I、二甲苯Ⅱ各5min，100％乙醇、2min，95％的乙醇、1min，80％乙醇、75％的乙醇各1min，蒸餾水洗2min。（3）蘇木素染色5min后沖洗。（4）1%鹽酸乙醇浸泡30s（數下）。（5）自來水浸泡15min。（6）伊紅液染色2min。（7）常規(guī)脫水，95％乙醇I、1min，95％乙醇Ⅱ、1min，100％乙醇I、1min，100％乙醇Ⅱ、1min，二甲苯石碳酸（3：1）1min，二甲苯透明，二甲苯I、1min，二甲苯Ⅱ、1min。（8）中性樹脂封片固定。第十八頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型淚腺組織RNA的提?。海?）分別于移植后6周將各組中新西蘭大白兔注射戊巴比妥鈉（56mg/kg）處死兔子，收集上、下淚腺、結膜、角膜組織，將淚腺組織剪至1cm的組織塊裝于1.5mlEP管中，迅速放于液氮后轉移到-80℃的冰箱中。（2）將所提RNA組織找到放到液氮瓶中，現(xiàn)將研缽和研棒提前一天84液浸泡，提前2小時18.2純水浸泡，用衛(wèi)生紙擦干后先用液氮降溫，待研缽中的液氮穩(wěn)定后，將組織塊在液氮中研磨，保證充足的液氮，將組織塊研磨成粉末后，加入1ml的Trizol后轉移到1.5ml的EP管中，充分吹打。（3）再按每1mlTrizol加入0.2ml比例的氯仿，蓋緊蓋子，用力上下劇烈搖晃15秒，呈粉色混合物。（4）常溫靜置15min，4℃離心機12000rpm離心15min，離心后可見EP管內分為三層，最上層為上清液，中間一層為白色膜狀物，最底層為紅色沉淀物。（5）將上清轉移至另一新的標記好的1.5mL進口EP管中，再加入等體積的異丙醇，室溫靜置10min，4℃離心機12000rpm離心10min。第十九頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型淚腺組織RNA的提取：（6）棄掉上清，加入1ml的75%乙醇（提前配置：750uL無水乙醇+250uLDEPC水），倒置上下?lián)u晃幾次，4℃離心機10000rpm離心5min。（7）觀察管底，避免槍頭碰到管底，棄掉上清，打開管蓋干燥10min。（8）隨后將RNA溶于20uL的DEPC水中，置于冰上，混勻后取1μL在NanoDropND-100上測RNA濃度，測三次，取其均值，記錄標注好并將RNA-保存在80℃冰箱中。第二十頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型淚腺組織RNA逆轉錄：（1）將保存于-80℃的所需的RNA置于冰上待其溶解，根據標注好所測的濃度按照1μgRNA，20μl體系逆轉錄，計算出不同RNA所加的體積。（2）先將RNA所在EP管渦旋離心，將標記好的EP管分別加入計算好體積的RNA，Oligo(dT)1μl,DEPC水補到12μl，渦旋離心后置于冰上待用。（3）用ThermoPCR儀，提前設置好溫度時間，待PCR儀機器蓋子溫度升高后放入樣本，65℃5min。（4）取出樣本置于冰上，每個樣本按順序加入5×Reactionbuffer4μlInhibitor1μlTranscriptase1μl10MmdNTPMix2μl（5）渦旋離心混勻后，待PCR儀機器蓋子溫度升高到40℃后放入各樣本，42℃60分鐘，70℃5分鐘，待反應結束后即EP管中的為逆轉錄生成的cDNA，將其逆轉錄產物cDNA置于冰上，然后用DEPC水稀釋10倍，渦旋離心混勻后置于-80℃冰箱保存。第二十一頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型實時定量PCR（quantitativereal-timePCR）RT-PCR：反應原理:使用美國AppliedBiosystems公司的實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀分析應用AppliedBiosystems7900HTFastReal-timePCRSystem，SYBRGreen法，使用FastSYBR@GreenMasterMix。在PCR反應過程中SYBRGreen熒光染料摻入DNA雙鏈后發(fā)射熒光信號，而不摻入DNA雙鏈的SYBR熒光染料不會有熒光信號，所以SYBRGreen熒光信號與DNA擴增產物的增加一致。雙鏈DNA在變性過程中解開呈單鏈，沒有熒光,在形成雙鏈DNA的復性和延伸過程中,SYBRGreen發(fā)出熒光，此階段PCR儀器釆集熒光信號。利用此信號的變化對PCR擴增反應中擴增產物擴增量的變化進行檢測，用循環(huán)數對基因定量分析。GAPDH將作為反應內在參照,用內參對所檢測樣品所含的DNA進行定量分析的方法。相對定量結果分析采用比較熒光強度達閾值時的循環(huán)數(Ct)值法（2-ΔΔCt法），擴增的倍數=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內參）實驗組-（Ct目的基因-Ct內參）對照組。各指標均重復檢測3次，取平均值。本實驗通過實時定量PCR檢測淚腺組織中Th1、Th17、Treg細胞分化相關細胞因子及轉錄因子mRNA相對表達量。第二十二頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型實時定量PCR（quantitativereal-timePCR）RT-PCR：所測基因上下游引物序列如下：GAPDHForwardprimerGGGTGGTGGACCTCATGGTReverseprimerCGGTGGTTTGAGGGCTCTTAIFN-γForwardprimerCTCTGCCTCATCTTGGGTTCTTReverseprimerGGTGTTCTGTTTCTCTGGTTAGTGTGTIL-10ForwardprimerGGCTGAGGCTGCGACAATReverseprimerTGCCTTGCTCTTGTTTTCACATGF-βForwardprimerCAAGGACCTGGGCTGGAAReverseprimerAGGCAGAAGTTGGCGTGGTAIL-6ForwardprimerGCAGAAAAACCAGTGGCTGAAReverseprimerGGCCGCGCAGGATGAIL-17ForwardprimerGGAATGAGGACCACCACATGAReverseprimerCTGCGTAGGACCAGGATCTCTTTNF-αForwardprimerAGCTTCTCGGGCCCTGAGTReverseprimerCCACTTGCGGGTTTGCTACTT-betForwardprimerGATGCGCCAGGAAGTTTCAReverseprimerTGTTGGAGGCCCCTTTATTGRORrtForwardprimerGGCCTACCACGCCGAReverseprimerTCCATGCCACCGTATTTGC第二十三頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型實時定量PCR（quantitativereal-timePCR）RT-PCR：（1）從-20℃冰箱中取出引物，置于冰上待其完全溶解，先配置100uM濃度的，混合均勻，隨后分裝稀釋到4uM濃度的引物。（2）從-20℃冰箱中取出FastSYBRGreenMasterMix，置于冰上避光待其完全溶解待用。（3）從-80℃冰箱中取出cDNA置于冰上待其完全溶解，溶解后混均勻。（4）8ul反應體系包括:SYBRGreen4ul上游引物（4uM）lul下游引物（4uM）lulcDNA2ul提前配置好SYBRGreen和上下游引物的混合液，計算好所需的cDNA的量，384孔板中每孔先加入SYBRGreen和上下游引物的混合液，再根據樣本所檢測加入cDNA。第二十四頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期五兔自身免疫性干眼模型實時定量PCR（quantitativereal-timePCR）RT-PCR：（5）配制混合液和384孔板的上樣操作過程均需避光進行，加樣結束后，384孔板封膜。（6）先將384孔板置于禍旋器渦旋lO秒，使其反應體系充分混合均勻。（7）提前預冷離心機，再將384孔板置于離心機4000rpm，4min離心。（8）再將384孔板放入AppliedBiosystems7900HTFastRea1-TimePCR儀,做好標