體外試驗與生物新技術(shù)在毒理學(xué)中的應(yīng)用

體外試驗與生物新技術(shù)在毒理學(xué)中的應(yīng)用1第一頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五2第二頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)容提要第一節(jié)

體外試驗第二節(jié)哺乳動物細胞制備和培養(yǎng)第三節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)在毒理學(xué)中的應(yīng)用

3第三頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五①全世界每年約有千種以上的新化合物作為商品進入人類的環(huán)境。而且在現(xiàn)有的化合物中，還有相當(dāng)數(shù)量沒有進行必要的毒理學(xué)評價。在此種情況下，利用經(jīng)典的整體動物試驗取得完整的毒理學(xué)資料極為困難。解決此種問題的重要方向是體外試驗。②現(xiàn)有的整體動物毒性試驗方法需消耗大量的時間和昂貴的經(jīng)費，而體外試驗則可節(jié)省時間和經(jīng)費。體外試驗的發(fā)展趨勢第一節(jié)

體外試驗4第四頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五③動物保護主義運動的興起，要求盡量減少動物的使用，而且應(yīng)當(dāng)盡量減少痛苦地處理動物。④更重要的是由于生物技術(shù)的巨大進步，不僅表現(xiàn)在細胞組織及器官培養(yǎng)領(lǐng)域，而且在生物分子技術(shù)方面，也為毒性試驗和研究提供了新的方法和工具。所以體外試驗在毒理學(xué)研究中所占的地位日趨重要，甚至有占主導(dǎo)地位的趨勢。

5第五頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五體外試驗的發(fā)展，并不排斥體內(nèi)試驗本身的重要性，兩者必須相互補充、相互驗證才能為毒理學(xué)研究提供堅實的科學(xué)基礎(chǔ)。6第六頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

可依據(jù)體外試驗在決策過程中所起的作用將其分為3類：①篩選試驗。它僅提供決策過程的最初的資料，還需要進行更權(quán)威的試驗，無論是整體還是體外試驗。②附加試驗。它可為協(xié)作部門或法律部門的最終決策過程提供有用的資料，如機理的研究，但僅有它是不夠充分的。③替代試驗。它是在大量實驗的基礎(chǔ)上，使體外毒性試驗?zāi)芴娲w動物試驗，以提供更多的信息。(一)分類7第七頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

體外試驗的基本原理是所觀察到的毒理學(xué)效應(yīng)均是毒物和／或反應(yīng)活性代謝產(chǎn)物在敏感性細胞上或敏感細胞內(nèi)某一分子靶部位作用的結(jié)果。如將敏感細胞或某分子靶部位例如酶，在體外條件下，維持其正常的生理功能，并觀察外源化學(xué)物對其的影響，即將毒理學(xué)中毒物中毒的啟動階段，在體外條件下，觀察其對外源化合物的反應(yīng)和外源化學(xué)物對它的作用。基于上述原理，體外試驗?zāi)Ｐ腿〔姆秶軐挘扇〔溉閯游锏碾x體臟器灌流、臟器切片溫育、細胞培養(yǎng)、亞細胞器組份以及提純的某些酶分子或DNA分子等等。

(二)基本原理8第八頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五能控制環(huán)境因素；可排除相互作用的系統(tǒng)如免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響；每一劑量水平可利用大量的生物樣品，如細胞，細胞器等；試驗間的誤差較少；可同時和／或反復(fù)多次取樣；(三)體外試驗的優(yōu)缺點1、

體外試驗的優(yōu)點9第九頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五可做成復(fù)雜的互相作用的試驗系統(tǒng)，如復(fù)合細胞培養(yǎng)等；較為快速和經(jīng)濟；需要較小量的受試化合物；產(chǎn)生較小量的有毒廢物；可以利用人體細胞；減少整體動物的使用。(三)體外試驗的優(yōu)缺點1、

體外試驗的優(yōu)點10第十頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五其中特別值得一提的優(yōu)點是體外試驗的簡便和易于利用人體細胞。體外毒性試驗結(jié)果可迅速得出，將減少了解新化學(xué)物毒理學(xué)資料所需的時間，最終可以縮短從新化學(xué)物的合成到產(chǎn)品進入市場的時間過程。此外，對鑒定毒理學(xué)資料有問題的新化學(xué)物，可及時終止開發(fā)，減少由資源到產(chǎn)品的投入。在毒理學(xué)整體試驗中禁止直接進行人體試驗。在體外試驗中，利用人體細胞組織進行試驗，可較好地解決物種差異的問題。1、

體外試驗的優(yōu)點11第十一頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

①體外到體內(nèi)外推的問題。體外試驗是依據(jù)毒性作用的始發(fā)階段及繼續(xù)發(fā)生的分子與細胞反應(yīng)，其與整體系統(tǒng)有差異，如何將產(chǎn)生體外毒性的體外濃度與相應(yīng)體內(nèi)劑量聯(lián)系的問題是最終未解決的難題。它需要更好的工具——預(yù)測性毒物代謝動力學(xué)來解決，其關(guān)鍵在于發(fā)展有生理學(xué)基礎(chǔ)的毒物代謝動力學(xué)模型。2、

體外試驗的缺點12第十二頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五②體外毒性試驗難以預(yù)測慢性毒性。因為，慢性毒性病理過程的機理所知甚少，缺乏發(fā)展體外試驗的理論依據(jù)，再者，某些體外系統(tǒng)仍難以達到長期維持生理狀態(tài)的要求。2、

體外試驗的缺點13第十三頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

1.肝臟灌流

是毒理學(xué)中研究外源化合物對肝臟損傷及代謝的常見方法。在灌流液中加入外源化學(xué)物，此外要維持灌流液的pH值、氧含量，還要控制適宜的灌流液流速。一般是以下腔靜脈和門靜脈為插管灌流通路，為此應(yīng)結(jié)扎肝動脈、上腔靜脈，在恒溫條件下灌流。需指出肝灌流時間不能過久，以4h之內(nèi)為宜，否則肝細胞的功能與生存不能維持。(一)臟器灌流二、體外試驗系統(tǒng)14第十四頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

2.腸灌流

利用某一部分小腸體外灌流可以研究一些化合物的吸收及動力學(xué)過程。如用大鼠，則在麻醉下切腹分離一段小腸，在保持原有血液循環(huán)體系下，將腸兩端插管，清洗凈腸中內(nèi)容物，在恒溫環(huán)境中灌入灌流液。(一)臟器灌流二、體外試驗系統(tǒng)15第十五頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

3.膈肌-膈神經(jīng)標(biāo)本

取完整的大鼠膈肌-膈神經(jīng)置于恒溫灌流液中，在幾小時之內(nèi)可維持基本正常的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)。這種標(biāo)本可用在研究神經(jīng)毒物對神經(jīng)傳導(dǎo)功能的損傷及強度。

(一)臟器灌流二、體外試驗系統(tǒng)16第十六頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

肝臟、腎臟、腦部及心均可以制備切片。例如，腦片和心肌條等是將組織片置于恒溫的孵育液中進行有關(guān)試驗研究，但需注意切片中的細胞需保持完好的細胞基質(zhì)和細胞之間的交流。切片厚度一般在250μm。不同研究期間有別，如肝切片研究CytP-450不應(yīng)超過8h，腦切片一般在6h左右。此系統(tǒng)的優(yōu)點是保持了細胞之間的結(jié)構(gòu)，其操作也比臟器灌流容易。不足之處是切片內(nèi)的細胞易于缺氧，且受試物也不易均勻到達細胞內(nèi)。

(二)臟器切片二、體外試驗系統(tǒng)17第十七頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

1.肝細胞原代培養(yǎng)

肝細胞尚未建成傳代的細胞株系，多用原代培養(yǎng)。肝細胞原代培養(yǎng)期間細胞不分裂、不增殖，但發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄是存在的(培養(yǎng)初期24h在1％或以上)。細胞原代培養(yǎng)維持生存期1～2周，但是CytP-450卻在24～28h活性減少50％左右。據(jù)報道人肝細胞中CytP-450活性穩(wěn)定性比大鼠強。二、體外試驗系統(tǒng)(三)原代細胞培養(yǎng)18第十八頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

2.巨噬細胞

豚鼠或大鼠都可以肺灌洗方法獲取肺巨噬細胞，小鼠可用腹腔灌洗獲得腹腔巨噬細胞，甚至人也可通過肺灌洗得到。巨噬細胞可以用于多種體外試驗，例如利用巨噬細胞的免疫功能檢測外源化學(xué)物的免疫毒性，又如利用巨噬細胞檢測以肺臟為毒理學(xué)終點的外源化學(xué)物的中毒毒性和機理。(三)原代細胞培養(yǎng)二、體外試驗系統(tǒng)19第十九頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

3.淋巴細胞

多用小動脈脾臟分離淋巴細胞或進一步分離T、B淋巴細胞進行免疫毒理研究。例如研究鎘的免疫毒性，證明鎘可以抑制淋巴細胞轉(zhuǎn)化和抑制白細胞介素-2的產(chǎn)生，且在一定條件下使淋巴細胞內(nèi)游離鈣濃度增加及鈣調(diào)素活性降低，此為鎘的免疫毒性機理研究提供了線索。(三)原代細胞培養(yǎng)二、體外試驗系統(tǒng)20第二十頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

4.腦細胞

分離的新鮮腦細胞有助于研究外源化學(xué)物對神經(jīng)系統(tǒng)損傷的評價與探討其機理。如用小鼠大腦皮質(zhì)分離、溫育后，研究二價陽離子鈣、鎂、鋅、鎘等對皮層神經(jīng)細胞的損傷，發(fā)現(xiàn)這些離子隨著濃度的增加，腦神經(jīng)細胞的電泳遷移率逐漸減慢。

隨著腦細胞技術(shù)的發(fā)展，還可在溫育體系中存在外源化學(xué)物情況下，用微電極插入腦細胞，通過電信號的變化，更深入地研究外源化學(xué)物對神經(jīng)細胞的功能損傷。(三)原代細胞培養(yǎng)二、體外試驗系統(tǒng)21第二十一頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

5.心肌細胞

心肌細胞用于毒理學(xué)研究的報道目前還較少。用新生1～2日齡大鼠心室肌分離心肌細胞，原代培養(yǎng)4天后，將微電極(直徑<0.5um)插入細胞內(nèi)，研究鎘對心肌的影響。經(jīng)記錄、分析各心肌細胞動作電位參數(shù)，結(jié)果鎘在5～20μmol／L濃度下，可使心肌細胞動作電位及最大除極速率顯著降低，表明鎘對心肌有直接的毒性效應(yīng)。(三)原代細胞培養(yǎng)二、體外試驗系統(tǒng)22第二十二頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

有些臟器細胞建立了傳代培養(yǎng)技術(shù)，建成有穩(wěn)定遺傳特征的細胞株系。有的利用細胞培養(yǎng)技術(shù)建立了特殊的試驗方法。(四)細胞培養(yǎng)二、體外試驗系統(tǒng)23第二十三頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

1.腎細胞

由于腎小管，尤其是腎近曲管是腎臟重要的功能單位，目前已經(jīng)建立了幾種腎近曲管細胞株系用于毒理學(xué)研究。例如1926年Hull等人選育傳代培養(yǎng)的LLC-PK1細胞是來源于Hampshire豬。近年國內(nèi)利用300次傳代培養(yǎng)的LLC—PKl細胞系對鉛的腎毒進行了研究，包括鉛對細胞的損傷、對細胞膜脂流動性的影響、對細胞膜相變溫度的影響、脂質(zhì)過氧化效應(yīng)、胞內(nèi)鈣濃度變化及形態(tài)學(xué)改變等，這對鉛的腎臟毒性機理提供了依據(jù)。(四)細胞培養(yǎng)二、體外試驗系統(tǒng)24第二十四頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

2.胚胎細胞

利用胚胎細胞體外培養(yǎng)，篩檢和研究外源化學(xué)物的毒性效應(yīng)。例如我國用人胚肺纖維母細胞傳代培養(yǎng)人胚肺二倍體細胞，已建立了以2BS為代表的株系。此株系在用于篩檢致癌物方面做了一些工作。如人胚肺二倍體細胞在10-7～10-8mol／L苯并(a)芘長達28～38代傳代培養(yǎng)下，電鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞核外形不規(guī)則、核膜深陷、出現(xiàn)細橋(tinybridge)伴分葉核形成、核內(nèi)胞漿包涵體、核仁巨大或多核等細胞癌變特征。

此外，人胚主動脈平滑肌細胞也可作為標(biāo)本傳代培養(yǎng)研究金屬的毒理。(四)細胞培養(yǎng)二、體外試驗系統(tǒng)25第二十五頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

取臟器除血污制備組織勻漿，是用物理學(xué)方法使細胞壁破壞，細胞組成成分與細胞間質(zhì)混合形成混懸液。利用勻漿為標(biāo)本主要是研究外源化學(xué)物對細胞酶系統(tǒng)的毒理作用。

最常使用的是腦勻漿、肝勻漿，雖然肺、腎、腸等臟器也可制備勻漿，但是因纖維結(jié)締組織或肌細胞不易破碎影響勻漿的質(zhì)量。

(五)組織勻漿二、體外試驗系統(tǒng)26第二十六頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

將細胞中各亞細胞組分分離和純化，對于深入研究外源化學(xué)物的靶位點、探討化學(xué)物毒性效應(yīng)的機理均十分重要。它較組織勻漿優(yōu)越，排除了勻漿中其它因素的影響。現(xiàn)代毒理學(xué)中使用最多的亞細胞組分是細胞膜、微粒體及線粒體。(六)亞細胞組分二、體外試驗系統(tǒng)27第二十七頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

1.細胞膜

使用細胞膜可以進行很多的毒理試驗，尤其是在探討化學(xué)物中毒機理方面。

以紅細胞膜為例，用人工細胞為標(biāo)本與0.1mmol／L鉛作用僅5min，紅細胞膜遠紫外色譜就出現(xiàn)改變，表明膜蛋白的構(gòu)象發(fā)生了變化。

(六)亞細胞組分二、體外試驗系統(tǒng)28第二十八頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

2.微粒體(microsome)

尤其是肝細胞制備的微粒體常作為毒理學(xué)研究的標(biāo)本，這是由于肝臟代謝酶系主要存在于肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，即肝細胞的亞細胞組分分離后的微粒體中。

有報道TNT在無氧而加入NADPH環(huán)境下與微粒體溫育，用ESR波譜儀檢測出硝基陰離子自由基；而在有氧環(huán)境中能迅速與分子氧反應(yīng)生成硝基化合物與超氧陰離子。

(六)亞細胞組分二、體外試驗系統(tǒng)29第二十九頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

3.線粒體(mitochondria)

它是細胞中進行呼吸作用的主要場所。據(jù)報道溴氰菊酯在體外試驗中，對線粒體呼吸功能有明顯抑制作用。又據(jù)報道鎘對大鼠肝細胞線粒體Ca2+-ATPase有抑制作用，且使線粒體膜脂流動性下降。

(六)亞細胞組分二、體外試驗系統(tǒng)30第三十頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

外源化學(xué)物對機體的毒性效應(yīng)，往往表現(xiàn)某種或某些酶的活性變化上，即可以利用標(biāo)志酶活性的變化反映化學(xué)物所損傷的靶器官。

(七)酶二、體外試驗系統(tǒng)31第三十一頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

在體外毒理學(xué)中則主要是定量研究外源化學(xué)物對靶酶作用的特征、性質(zhì)和機理。此類研究的基礎(chǔ)工作是純化酶，如獲得純化酶，可在體外精確地控制各種因素，對純化酶作用的體征、性質(zhì)和機理進行研究，如細胞色素P-450重組系統(tǒng)。由于酶的提純技術(shù)復(fù)雜，故而在一般毒理學(xué)研究中多用臟器勻漿和亞細胞組分作為酶源。雖然這些酶源標(biāo)本含有多酶成分，但是只要測定酶活性的條件適宜，完全可以得到良好的結(jié)果。

(七)酶二、體外試驗系統(tǒng)32第三十二頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)哺乳動物細胞制備和培養(yǎng)

到目前為止，分離的細胞是毒理學(xué)中使用最廣泛和最深入的體外實驗系統(tǒng)。體外系統(tǒng)分離的細胞包括懸浮液中的新鮮游離細胞、原代培養(yǎng)細胞、細胞株、細胞系及復(fù)合培養(yǎng)的細胞。一、概述33第三十三頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

在毒理學(xué)中以哺乳動物細胞作為實驗動物的替代系統(tǒng)日漸廣泛，造成這種趨勢的原因有三：一是來自公眾要求減少實驗中使用動物數(shù)量的壓力；二是非整體動物實驗可顯著地減少常規(guī)整體動物實驗所需的高額費用；三是人們越來越不滿意實驗動物與人體結(jié)果之間相關(guān)性的缺乏。利用細胞，可更嚴格控制實驗條件，有效地研究毒性作用的生化機理。

34第三十四頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五35第三十五頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五表12-3毒理學(xué)研究中常用細胞各種物種的成纖維細胞淋巴母細胞腹水瘤細胞淋巴細胞角質(zhì)細胞肝

細

胞肝癌細胞腎臟髓質(zhì)和皮質(zhì)細胞肺的各種類型細胞培養(yǎng)的背根膠質(zhì)細胞培養(yǎng)的睪丸細胞膀胱細胞心臟

細

胞脊髓微血管細胞脂肪細胞36第三十六頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五利用哺乳動物細胞進行毒理學(xué)體外實驗有兩種方法：一是建立正在迅速生長的細胞株，用以觀察受試物對整體細胞的一般毒作用和正在分裂組織的毒作用；二是利用已高度分化的細胞，無論是原代培養(yǎng)或是特定的細胞株，研究受試物對已分化成熟的細胞或其功能的特殊毒作用；

37第三十七頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

1.培養(yǎng)箱

一般來說，在5％CO2，95％空氣和99％的相對濕度的條件下，許多細胞可存活。故細胞培養(yǎng)的關(guān)鍵設(shè)備是CO2培養(yǎng)箱。其基本要求：①精確地溫度控制調(diào)節(jié)，一般在土0.5℃，箱內(nèi)溫度的均衡可依賴風(fēng)扇；②CO2濃度調(diào)節(jié)，利用CO2傳感器監(jiān)測箱內(nèi)CO2濃度；使箱內(nèi)大氣為5％CO2，95％空氣；③箱內(nèi)濕度，可用水盤來維持。二、基本技術(shù)（一）

儀器與設(shè)備38第三十八頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

2.冰箱和冷柜

冰箱(4℃)用于存放培養(yǎng)介質(zhì)，冷柜(—20℃)則存放酶，(如胰蛋白酶)和某些培養(yǎng)介質(zhì)如谷氨酸和血清。

39第三十九頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

3.顯微鏡

最基本的配置是一臺簡單的倒置顯微鏡，用作日常觀察培養(yǎng)中的細胞，以便依據(jù)細胞生長狀況，進行調(diào)整或?qū)ξ廴具M行補救或處理。進行進一步的研究，則需要更高級的顯微鏡，例如，相差顯微鏡或熒光顯微鏡，并附有照相裝置或攝影裝置。

40第四十頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

4.超凈工作臺

在沒有無菌操作室的條件下；可用超凈工作臺。它是一無菌操作裝置，主要是利用鼓風(fēng)機，驅(qū)動空氣通過高效濾膜凈化后，緩緩?fù)ㄟ^工作臺面，使工作部位構(gòu)成無菌環(huán)境。它具有占地面積小，操作方便等優(yōu)點，但它尚難絕對除去病毒類微生物，而且灰塵過多對凈化作用不利，故超凈工作臺最好安置在清潔無塵的房間。

41第四十一頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

5.清洗和消毒設(shè)置：培養(yǎng)中所用玻璃器皿可用電熱干燥箱消毒，要求溫度160℃以上，最好使用較大規(guī)格的干燥箱，如650×500×500mm。

器皿的清洗可用超聲波洗滌器。吸管的清洗采用虹吸原理制成的沖洗裝置。金屬器械如解剖刀、虹膜剪、鑷子、尖鑷、止血鉗等可用高壓蒸汽消毒。42第四十二頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

6.培養(yǎng)器皿

為了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃瓶皿。特制的塑料瓶皿具有透明、平滑、無毒性、有利于細胞生長的優(yōu)點。主要的塑料瓶皿有；①多孔培養(yǎng)板，其規(guī)格有4孔、6孔、24孔及96孔，它體積小，適于少量細胞或單個細胞克隆的生長；②培養(yǎng)皿，規(guī)格有直徑30mm、60mm及l(fā)00mm，與玻璃培養(yǎng)皿相同，尤其有利于集落形成和細胞轉(zhuǎn)化等試驗；③培養(yǎng)瓶，帶有螺旋蓋塞，規(guī)格有30ml、50ml、l00ml及500ml，適于在CO2培養(yǎng)箱中使用；④其它：凍存細胞的塑料安瓿及微量加樣器頭，后者的規(guī)格有200~1000μ1和1μl~100μl二種。

43第四十三頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

玻璃器皿在實驗室仍不能完全被塑料制品取代，除培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶外，主要還有：①吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用規(guī)格有l(wèi)0ml，5ml和lml；②玻璃瓶，用于配制各種培養(yǎng)液的儲貯存液和血清等，可用生理鹽水瓶或血漿瓶代替，規(guī)格有500ml、250ml和l00ml；

③離心管，規(guī)格有50ml、l0ml和5ml，用于細胞洗滌。44第四十四頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

7.液氮貯存器

貯存細胞多用液氮，液氮溫度在-196℃，具有經(jīng)濟、省力和能較好保持細胞生物學(xué)特性的優(yōu)點。液氮貯存器有25L和50L兩種規(guī)格，它與液氮運輸瓶，或稱杜瓦瓶不同，因液氮貯存器一般每兩周需補充一次液氮。如有需要可配置貯存器和運輸瓶。

45第四十五頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

8.水純化裝置

細胞培養(yǎng)對水的要求較高，通常要求使用三次蒸餾水配制各種培養(yǎng)液。對玻璃器皿也應(yīng)用純水清洗。但是，在細胞培養(yǎng)中，不宜使用去離子純水，因其不能有效地去除有機物。

實驗室應(yīng)配備自動加水石英玻璃管加熱的蒸餾器，具有蒸餾速度快，使用安全等優(yōu)點。外購蒸餾水或去離子，應(yīng)在本實驗室重蒸后使用。對水質(zhì)量應(yīng)經(jīng)常檢測，如pH和電導(dǎo)系數(shù)。同一實驗盡量使用同一水源，避免水質(zhì)量造成結(jié)果的差異。

46第四十六頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

9.濾過消毒裝置

培養(yǎng)介質(zhì)不能經(jīng)高壓蒸汽消毒，而需通過孔徑為0.22μl的濾膜過濾消毒。濾過消毒裝置由抽氣泵(水流玻璃抽氣泵或真空泵)、安全瓶、抽濾瓶和濾器組成。47第四十七頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五10.一般設(shè)備

離心機，用于對細胞懸液離心處理，以達到細胞洗滌、調(diào)節(jié)細胞濃度等。

天平，包括普通臺秤、扭力天平和分析天平，用于配制各種培養(yǎng)液、酶消化液及生理鹽水等。

酸度計，用于準(zhǔn)確調(diào)整各種介質(zhì)及生理鹽水的pH。

電磁攪拌器，微量加樣器等。48第四十八頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五(二)培養(yǎng)用液

指細胞培養(yǎng)中所使用的溶液，如培養(yǎng)液、消化液、pH調(diào)整液、染液及細胞洗滌液等。培養(yǎng)液的選擇取決于細胞生長的要求，故它是維持細胞生存和生長所需的基本溶液，它的主要成分為平衡鹽溶液和適應(yīng)細胞體外培養(yǎng)的各種溶液。

培養(yǎng)液在制備過程中應(yīng)嚴格操作，避免混入雜質(zhì)。應(yīng)特別注意下列問題：①容器，應(yīng)仔細認真清洗，必要時須消毒；②水，三次重蒸蒸餾水；③嚴格選擇品質(zhì)優(yōu)良的藥品；④制備好的培養(yǎng)介質(zhì)要標(biāo)明名稱、配制日期及配制者；⑤貯存與消毒。

49第四十九頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

1.平衡鹽溶液

常用的有Hanks液、Eagle液及磷酸鹽緩沖液

(PBS)等。它具有維持滲透壓、控制酸堿度平衡的作用及供給細胞生存所需的能量和無機鹽的成分。它是配制各種培養(yǎng)介質(zhì)的基礎(chǔ)溶液，也是洗滌細胞的溶液。

50第五十頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

2.小牛血清

是細胞培養(yǎng)中最常見的天然培養(yǎng)基，它具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，對細胞附著和保護也有明顯的作用。但它有成分較為復(fù)雜、個體差異較大、來源也有一定的限制等不足。彌補個體差異的辦法是對血清進行無菌檢測和支持生長能力測定后，混合使用。天然培養(yǎng)基除小牛血清外，還有雞血漿、雞胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾膠原等。51第五十一頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五3.合成培養(yǎng)基

系依據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成的。如最簡單的MEMEagle培養(yǎng)液，包括12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素。根據(jù)需要可添加某些成分，如碳水化合物(葡萄糖、核糖、脫氧核糖及丙酮酸鈉等)、核酸的前體物(嘌呤和嘧啶類化合物)及氧化還原劑，抗壞血酸、谷胱甘肽等。

如進行無血清培養(yǎng)，除上述營養(yǎng)成分外，還應(yīng)加入纖維連結(jié)素、多聚賴氨酸和膠原等成分以促進細胞貼壁。有時，還需要加入酶的抑制劑，如大豆胰酶抑制劑。

為了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。常用抗生素有青霉素、鏈霉素及慶大霉素等。52第五十二頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

4.消化液

進行傳代細胞培養(yǎng)時，為了使細胞脫離生長表面和細胞離散成單個細胞，通常使用消化液。常用的消化液有胰蛋白溶液(0.25％或0.125％)和乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA)溶液(0.02％)。

53第五十三頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五5.其它

pH調(diào)整液，為了營養(yǎng)成分穩(wěn)定和延長貯存時間，配制生理鹽溶液和培養(yǎng)液時，均在臨用前加入NaHCO3溶液。常用濃度有3.7％、5.6％和7.4%。此外，還有HEPES溶液，是一種氫離子緩沖劑，能較長時間保持恒定的pH值范圍。使用終濃度為10～15mmol／L。

54第五十四頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

染色液：常用的有①蘇木精-伊紅染色液或稱H.E染色；②Giemsa染色液。

固定液：常用的有①中性緩沖福爾馬林，相當(dāng)于10％的福爾馬林；②Bouin氏固定液；③醋酸甲醇，臨用前配制，結(jié)合Giemsa染色效果較好；④FAA固定液，由福爾馬林、冰醋酸及80％酒精組成，用于蓋片單層培養(yǎng)的固定。55第五十五頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

(三)消毒技術(shù)

在細胞培養(yǎng)中，消毒是最基本的一項工作，它直接影響實驗的結(jié)果。消毒措施應(yīng)在細胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)嚴格執(zhí)行。細胞培養(yǎng)的微生物污染，包括細菌、真菌及病毒，它們主要來源于：操作者的粗心；操作表面或周圍的環(huán)境；培養(yǎng)液及培養(yǎng)器皿的滅菌不徹底或存放時間過久等。

56第五十六頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

對不同的細胞培養(yǎng)所用物品，可采用不同的消毒滅菌的方法。一般有兩類：一是物理滅菌法，即利用紫外線、干熱及微孔過濾等；二是化學(xué)滅菌法，即利用化學(xué)消毒劑。57第五十七頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

1.紫外線

適于消毒空氣、操作表面及一些不宜用其它方法消毒的物品和培養(yǎng)板等，使用方便，效果較好。應(yīng)注意其可產(chǎn)生臭氧，影響健康。

2.高壓蒸氣消毒

它適于金屬器械、膠塞、布類及某些培養(yǎng)液。一般要求15磅壓力下20min。或者更簡單的，煮沸消毒，其不足是濕度大，不易久存。

3.干熱消毒

適于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并便于使用貯存。加溫應(yīng)到160℃，保持90-120min。58第五十八頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

4.濾過消毒

適于大多數(shù)培養(yǎng)用液。選擇孔徑為0.22μm的微孔濾膜，過濾除菌效果較佳。

5.消毒劑

適于操作者的皮膚、操作表面和臺面、桌椅及墻壁等，常用的消毒劑有來蘇兒、新潔爾滅、過氧乙酸及70％酒精。59第五十九頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

三、培養(yǎng)細胞的鑒定

對培養(yǎng)細胞的鑒定有兩個目的：一是觀察培養(yǎng)有無變化，以決定是否終止培養(yǎng)，并從冷凍貯存的樣品重新建立新的培養(yǎng)細胞；二是培養(yǎng)條件(如培養(yǎng)液)變化，對培養(yǎng)細胞的影響。因為培養(yǎng)條件的一致性，對于實驗結(jié)果的可信性有極為重要的影響。對于培養(yǎng)細胞的鑒定包括污染鑒定、生存指標(biāo)及細胞性質(zhì)(如細胞形態(tài)、生長特性、染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)等)。60第六十頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五(一)污染鑒定

細胞培養(yǎng)中常見的污染有真菌、細菌和支原體等，此外有化學(xué)物和非同一種細胞的污染。受到污染的細胞培養(yǎng)可明顯地改變生長特性，引起pH變化和生長遲緩。污染常常表現(xiàn)為pH變化，培養(yǎng)液表面起泡或起膜，培養(yǎng)液中的絮狀物及細胞生長表面的斑點，搖動培養(yǎng)器皿可消失。肉眼見不到的污染可影響細胞的代謝。61第六十一頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

1.鑒定方法

真菌或細菌的污染可用肉眼或低倍光學(xué)顯微鏡觀察，支原體僅能用特別的熒光染料如Hoechst33258染色后在光學(xué)顯微鏡下，或用掃描電子顯微鏡觀察。由于用肉眼無法發(fā)現(xiàn)支原體的污染，在細胞培養(yǎng)過程中應(yīng)經(jīng)常定期檢查，例如每三個月。最簡便和最可靠的檢測支原體的方法是用熒光染料染色在顯微鏡下觀察。(一)污染鑒定62第六十二頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

2.處理

基本的良好消毒技術(shù)并不一定能防止污染，還應(yīng)注意下列方面：消毒步驟(如高壓鍋和干熱消毒柜)的效果；多層流防護罩的消毒效果；經(jīng)常檢查培養(yǎng)器皿；每個工作者有自己配制的培養(yǎng)用液，處理受污染的培養(yǎng)用具和環(huán)境。對于已污染或懷疑污染的培養(yǎng)用具均可用2.5％高氯酸處理。用抗生素對預(yù)防或去除細菌污染較為有效。對支原體污染，消除方法較多，如抗生素、加溫及動物體內(nèi)接種等，但都較為繁瑣，且效果不甚滿意，最好的辦法是棄去，再重新培養(yǎng)。63第六十三頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

(二)生存指標(biāo)

1.臺盼藍排斥試驗

是判定細胞損傷的快速試驗，它還可很方便進行細胞計數(shù)。具體方法如下：

①取少量細胞混懸液，加人等量的0.5％臺盼藍溶液。

②放置1-5min后，將混合液滴入血細胞計數(shù)池內(nèi)。

③顯微鏡下，細胞顯藍色的為死亡細胞，尤其是核深染，而未染的細胞為存活細胞。統(tǒng)計出細胞總數(shù)后，可計算出細胞存活率。64第六十四頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

(三)細胞特性鑒定

在連續(xù)培養(yǎng)期間，細胞可能發(fā)生某些變化，如細胞與原始細胞的差異逐漸加大。但每一細胞株具有一系列細胞特性“正常”的參數(shù)，可供鑒定評價。例如，形態(tài)學(xué)參數(shù)、生長特性及染色體分析等皆為細胞特性鑒定的指標(biāo)，其中形態(tài)學(xué)與生長特性的測定相對容易進行。

65第六十五頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

1.形態(tài)學(xué)檢查

評價細胞正常與否的最簡單方法是形態(tài)學(xué)檢查；應(yīng)在每次傳代時用倒置顯微鏡倒置顯微鏡進行觀察，最好拍照記錄細胞的形態(tài)。要詳細地描述每一細胞系的形態(tài)。

成纖維樣細胞系指在單層細胞培養(yǎng)時，細胞的長度要大于其寬度的兩倍的細胞，而上皮樣細胞系指呈多角形的細胞。(三)細胞特性鑒定66第六十六頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

2.生長特性的檢查

在培養(yǎng)細胞時，其生長特性的檢查較易進行，主要通過測定更換培養(yǎng)液的時間和傳代的時間來完成。

(三)細胞特性鑒定67第六十七頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

每個細胞系均有其自己的生長循環(huán)周期，這取決于接種進行培養(yǎng)的細胞數(shù)目。在實際工作中，是測定克隆效率或者接種效率。克隆效率是測定由單個細胞生長的克隆。接種效率是測定植入小量細胞(2~50個／cm2)后，等生長至可分辨的小克隆時，經(jīng)用生理鹽水洗滌，甲醇固定，吉姆沙染色(2ml／25cm2)和清水沖洗后，計算克隆數(shù)。2.生長特性的檢查(三)細胞特性鑒定68第六十八頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

一般認為，傳代效率小于30表示生長不正常。此項指標(biāo)可用于正常細胞生長的監(jiān)測，貯存細胞的復(fù)蘇及鑒定每一批血清等。

在細胞培養(yǎng)試驗中，一般監(jiān)測指標(biāo)可采用形態(tài)學(xué)、生長模式及接種效率即可。69第六十九頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

3.其它檢查

除上述指標(biāo)外，在細胞培養(yǎng)時，可進行染色體分析，包括染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)的含量測定，來判斷培養(yǎng)細胞的特性。

(三)細胞特性鑒定70第七十頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

四、細胞培養(yǎng)在食品毒理學(xué)中應(yīng)用

利用培養(yǎng)的細胞，可進行多方面的毒理學(xué)研究，如表12-4中所列。71第七十一頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五72第七十二頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)在毒理學(xué)中的應(yīng)用

近十幾年來，分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，給毒理學(xué)研究提供了新的思維和研究工具，改變了毒理學(xué)研究的基本格局，使毒理學(xué)研究從經(jīng)典的整體器官水平向細胞和分子水平飛躍。美國科學(xué)家Marshall于1993年在Science雜志上發(fā)表的題為“毒理學(xué)進入分子水平”的專題文章，標(biāo)志著分子毒理學(xué)時代的到來。73第七十三頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

縱觀近年來毒理學(xué)的發(fā)展歷程，一些常用的分子生物學(xué)技術(shù)，如PCR技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、DNA測序技術(shù)以及一系列突變檢測技術(shù)已廣泛應(yīng)用于外源化合物和環(huán)境致癌物引起的DNA損傷、基因突變、加合物形成及癌基因和抑癌基因研究等方面。特別是近年來基因差異分析技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因芯片技術(shù)等分子生物學(xué)新技術(shù)的建立和引入，大大提高了毒理學(xué)研究的整體水平。74第七十四頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五一、PCR技術(shù)二、毒理學(xué)中的mRNA定性與定量的測定方法三、轉(zhuǎn)基因動物四、基因芯片技術(shù)75第七十五頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五一、PCR技術(shù)

PCR(polymerasechainreaction)技術(shù)稱聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，又稱無細胞克隆技術(shù)(“freeBacteria”cloningtechnique)，是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的新方法。76第七十六頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五1234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍77第七十七頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃78第七十八頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物79第七十九頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶80第八十頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始81第八十一頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq82第八十二頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束83第八十三頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增84第八十四頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

其主要過程由變性、退火和延伸三個步驟反復(fù)的循環(huán)組成。首先，在高溫下(95℃，5min)，待擴增的DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃?，成為兩條單鏈DNA模板；而后在較低溫度條件下(37～55℃，30s)，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；再在高溫條件下(72℃，2～5min)，通過DNA聚合酶(Taq酶)作用，以引物3′端為合成起點，單核苷酸為原料，沿模板以5′-3′方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過一次解鏈、退火和延伸三個步驟的熱循環(huán)后就形成兩條雙鏈DNA分子。

85第八十五頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

PCR技術(shù)的特點是可以合成特定的DNA片段和特定的DNA序列并以2n倍數(shù)大量擴增。PCR技術(shù)的基本反應(yīng)條件：①DNA模板，為特定的DNA片段；②耐熱的DNA聚合酶，常用Taq酶；③引物，系指兩段與待擴增靶DNA序列互補的寡核酸片段，它是決定PCR擴增片段長度、位置和結(jié)果的關(guān)鍵；④4種核酸原料，即dNTP；⑤輔助因子，包括Mg2+、BSA、DMSO及緩沖液等，供酶促反應(yīng)達最佳條件的各種因子。86第八十六頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

PCR技術(shù)的應(yīng)用特點：①操作簡便，已有市售的PCR擴增儀可供選用，其操作較為簡便。②省時，PCR每一次解鏈、退火和延伸循環(huán)，需數(shù)分鐘。一般20-30個循環(huán)，可使靶DNA達數(shù)百萬倍擴增，只需數(shù)小時。較常規(guī)方法快速。③靈敏度高。通?？蓮膒S量級的DNA片段快速擴增到uS水平，以達到DNA序列分析、DNA克隆等方法的要求。④特異性強，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物的寡核苷酸與模板結(jié)合的正確性。⑤對原始材料的要求較低。由于PCR技術(shù)具有較高的特異性和靈敏度，因而有可能從很微量的靶DNA，獲得滿意的PCR產(chǎn)物。

87第八十七頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五二、毒理學(xué)中的mRNA定性與定量的測定方法

許多外源化學(xué)物和內(nèi)源性活性物質(zhì)皆可引起基因表達的改變，主要是基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。對mRNA的測定在此類研究中尤為重要。常見的mRNA測定方法有四類：多聚腺苷酸的分析；分子量測定；mRNA化學(xué)分析(如指紋圖譜和核苷酸組成分析等)及分子雜交分析。現(xiàn)就分子雜交分析中常用的方法重點加以介紹。88第八十八頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

(一)Northern印跡分析

Northern印跡分析(Northernblotanalysis)是廣泛使用的mRNA測定方法之一，其基本原理是將RNA固定于帶電荷的膜上，用特定的RNA探針與其雜交。探針是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測的合適標(biāo)記物，并僅與特異靶分子反應(yīng)。根據(jù)標(biāo)記方法不同，探針可分為放射性探針和非放射性探針。根據(jù)核酸的性質(zhì)可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針及寡核苷酸探針等。雜交系指特定的探針與特定的DNA或RNA單鏈的堿基有一定程度的互補順序，形成雜交雙鏈，使所需的DNA或RNA由眾多的DNA或RNA分子中分離出來，再依據(jù)探針上標(biāo)記物，對所需的DNA或RNA進行定性或定量的分析。

89第八十九頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五(二)液相雜交法

液相雜交法(solutionhybriditationmethod)的基本原理是在溶液中，mRNA與單鏈RNA或DNA探針雜交，然后將過量的探針消化，在尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳上按分子的大小分離RNA-DNA或RNA-RNA雜交體，對雜交分子進行定性或定量分析。

90第九十頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

(三)原位雜交法(insituhybridization)

前述各種方法均可用于細胞或組織中mRNA定性和定量的測定。然而，它們不能提供直觀的基因表達是發(fā)生在整個組織中那些細胞或器官的那些區(qū)域。原位雜交法可鑒定在組織中少數(shù)細胞內(nèi)基因表達發(fā)生的變化，它不僅可提供關(guān)于特定mRNA的相對表達情況，而且可提供涉及基因表達調(diào)控的細胞定位。原位雜交可用于觀察在某一特別細胞類型中基因表達的調(diào)控狀況。91第九十一頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

原位雜交的主要步驟為：在切片上將組織固定；溶解細胞；消化蛋白質(zhì)和DNA；與特定DNA或RNA探針的雜交；雜交分子的測定。92第九十二頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五四、轉(zhuǎn)基因動物

(一)轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)生

轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimal)是指體內(nèi)基因組中穩(wěn)定地整合有外源基因的動物，其外源基因可遺傳給后代。用此種方法可建立轉(zhuǎn)基因動物模型，以研究外源基因在整體動物中的表達調(diào)控規(guī)律；可改變動物基因型，使其表現(xiàn)型更符合人類需要；也可用轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)生人類所需的生物活性物質(zhì)。93第九十三頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

早在1974年Jaenisch等將病毒SV40的DNA注入小鼠的胚泡，發(fā)現(xiàn)40％子代鼠的器官中整合有外源基因，首次成功地培育了轉(zhuǎn)基因動物。

1982年，Palmiter等用顯微注射法，將小鼠金屬硫蛋白啟動子和大鼠生長激素基因拼接轉(zhuǎn)入小鼠受精卵的原核中，得到7只轉(zhuǎn)基因小鼠，其中6只生長加快，體型明顯增大，被稱為“超級小鼠”，顯示出了通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良生物性狀的可能性。

1980年代轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)發(fā)展迅速，主要應(yīng)用于基因表達調(diào)控的研究。轉(zhuǎn)基因兔、豬、羊及牛的制備相繼獲得成功?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)基因動物模型廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)各個領(lǐng)域，其中應(yīng)用最多的是轉(zhuǎn)基因小鼠。94第九十四頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

(三)轉(zhuǎn)基因動物模型在毒理學(xué)中的作用

1.致突變檢測模型

Lohman于1987年首次提出，轉(zhuǎn)基因嚙齒類動物突變測試系統(tǒng)在致突變機制研究中有潛在應(yīng)用價值。1989年Gossen等報道了LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠突變測試系統(tǒng)。LacZ是一種細菌的酶，其活性可以用體外比色的方法測定。近年來，國外已陸續(xù)發(fā)展了多種用于突變檢測的轉(zhuǎn)基因動物，其中三種已投入商品化生產(chǎn)，MutarM小鼠、BigBlueTM小鼠和Xenomouse小鼠，它們分別采用大腸桿菌乳糖操縱子的LacZ和／或LacI作為誘變的靶基因。95第九十五頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

現(xiàn)在國內(nèi)外已建立了十多種轉(zhuǎn)基因突變檢測模型。與經(jīng)典的Ames試驗比較，轉(zhuǎn)基因動物突變測試體系有許多優(yōu)點，它是在活體內(nèi)測試，可動態(tài)觀察突變率，且在小劑量范圍內(nèi)進行，結(jié)果可靠；可測定包括生殖細胞在內(nèi)的器官或組織的突變率和突變類型。但由于用轉(zhuǎn)基因動物進行突變測試研究的時間不長，積累的實驗資料少，要成為常規(guī)的突變篩選方法尚需許多工作要做。需建立一套標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)程，還需建立可測試大片段DNA損傷的測試體系，并盡可能降低費用以利于推廣。為了降低靶基因的自發(fā)突變率，亟待設(shè)計更好的靶基因，從而提高轉(zhuǎn)基因動物突變測試體系的敏感性。96第九十六頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

2.致癌檢測的模型

利用該類模型可了解基因的改變與腫瘤的關(guān)系，進而了解外來物質(zhì)的致癌作用機理。利用轉(zhuǎn)基因動物將是此種研究的一個有力工具，且業(yè)已應(yīng)用于實際的環(huán)境化學(xué)物的致癌物評價。

研究發(fā)現(xiàn)，藥物和化學(xué)物質(zhì)對LacI轉(zhuǎn)基因小鼠模型的致突變力和致癌力之間存在良好的相關(guān)性。通過定量分析一些已知致癌物的微核試驗和染色體畸變試驗與嚙齒類動物長期致癌試驗的資料，發(fā)現(xiàn)給予50倍TD50的總劑量可使LacI的突變率加倍，LacI轉(zhuǎn)基因小鼠暴露于致癌物250天，其檢測的靈敏度與長期致癌試驗近似。97第九十七頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

利用基因打靶技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因小鼠，已成為研究抑癌基因(如p53基因、Rb基因)在腫瘤形成過程中所起作用的重要手段。

DNA損傷修復(fù)能力是腫瘤易感性的重要因素。為了闡明在自發(fā)性和化學(xué)致癌過程中DNA損傷修復(fù)的保護作用，國外已培育出了表達DNA損傷修復(fù)基因(如烷基轉(zhuǎn)移酶)的轉(zhuǎn)基因小鼠。

98第九十八頁，共一百零七頁，編輯于2023年，星期五

3.轉(zhuǎn)基因動物應(yīng)用于毒理學(xué)研究的特點

(1)可根據(jù)需要導(dǎo)入目的基因：毒理學(xué)研究的目的之一就是要揭示毒物危害的本質(zhì)，我們可以篩選對毒物敏感的目的基因，在分子水平上研究毒物的危害。

(2)敏感性高：因為導(dǎo)