淺論二-■-英對小鼠異位子宮內(nèi)膜影響的分子機(jī)制研究

淺論二■英對小鼠異位子宮內(nèi)膜影響的分子機(jī)制研究【摘要】【目的】探討四氯二苯并二■英(TCDD)對子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型的影響及其分子學(xué)機(jī)制?！痉椒ā坎捎眯∈笞泽w子宮內(nèi)膜移植法建立小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，分別給予TCDD0、l、3、10μg/kg劑量灌胃，每21d1次，于建模術(shù)后3、6、9周處死，鑒定異位病灶的形成，測量異位病灶體積。采用免疫組化法和RT-PCR法檢測各組小鼠異位子宮內(nèi)膜組織中芳香烴受體(AhR)和細(xì)胞色素P4501A1(CYP1A1)表達(dá)水平?！窘Y(jié)果】①染毒組小鼠異位病灶體積的增加與染毒劑量和時間具有明顯的正相關(guān)性(r=為、，均P);②染毒組小鼠異位子宮內(nèi)膜AhR蛋白較對照組增強(qiáng)(P);且隨染毒劑量增加和染毒時間延長，AhR蛋白表達(dá)相應(yīng)增加(r分別為、，均P);③隨染毒劑量增加，CYP1A1蛋白表達(dá)相應(yīng)增加(r=，P)，對照組未檢測到CYP1A1蛋白表達(dá);④染毒組小鼠異位子宮內(nèi)膜AhRmRNA較對照組增強(qiáng)(P)。隨染毒劑量增加和暴露時間延長，AhRmRNA表達(dá)相應(yīng)增加(r分別為、，P);⑤隨染毒劑量的增加，CYP1A1mRNA表達(dá)明顯增加(r=，P)，對照組小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中未檢測到CYP1A1mRNA?！窘Y(jié)論】TCDD可促進(jìn)小鼠模型異位子宮內(nèi)膜病灶的發(fā)展，其機(jī)制可能與AhR及其下游基因CYP1A1激活有關(guān)。AhR及CYP1A1的表達(dá)增強(qiáng)是二■英暴露的生化指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】四氯二苯并二■英;子宮內(nèi)膜異位癥;小鼠;AhR;CYP1A1

Abstract：【Objective】Toinvestigatetheeffectof2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD)ondevelopmentofendometriosisinamousemodelfromperspectiveofmolecularmechanism.【Methods】Theendometriosismousemodelwasestablishedwithautotransplantationofendometrium.Twenty-onedayspriortoinductionsurgerywhichproducesendometriosis，femalemicewerepretreatedwith2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD)at0，3，or10mgTCDD/kg.Animalsweretreatedagainatthetimeofsurgeryandat3，6，and9weeksfollowingsurgery.Evaluationofectopicfocusesdiameterweremadeat3，6，9weekspostsurgery.TheAhRandCYP1A1expressiononectopicendometriumwereidentifiedbyimmunohistochemistryandRT-PCRassays.【Results】①WithincreasedtimeanddoseofTCDDexposure，itproducedadose-dependentincreaseinendometrioticsitediameterwhenalltimepointswerepooledwithineachdoseinmice(r=andrespectively，bothP).②TheexpressionofAhRproteinonectopicfocusesinmicewerehigherintheTCDDexposuregroupthanthoseincontrolgroup，andpresentedtime-dosedependentincrease(r=and，bothP).③Thehigherdoseofexposureincreased，thehigherCYP1A1proteinexpressionsenhanced(r=，P).④Ascomparedwiththecontrolgroup，theexpressionofAhRmRNAinectopicfocusesofmicewerehigherintheTCDDexposuregroup，andshowtime-dosedependentincrease(r=and，bothP).⑤Thehigherdoseofexposureincreased，thehigherCYP1A1mRNAexpressionenhanced(r=，P).【Conclusion】TCDDcanpromoteprogressionofectopicfocusofendometriosisinthemouse子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)是育齡婦女的常見病，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年來流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)二■英(dioxin)污染越嚴(yán)重的國家或地區(qū)，其EMS的發(fā)病率越高[1]。所以，推測涉及外來物解毒的酶活性的改變可能是EMS的危險因素。毒理研究發(fā)現(xiàn)二■英通過與芳香烴受體(arylhydrocarbonreceptor，AhR)結(jié)合并激活A(yù)hR介導(dǎo)的信號途徑，發(fā)揮不同毒性效應(yīng)。細(xì)胞色素P4501A1(CytochromeP4501A1，CYP1A1)屬重要的I相解毒酶，是目前研究最多的AhR反應(yīng)基因，報道稱其基因多態(tài)性可能與子宮內(nèi)膜異位癥的形成密切相關(guān)。本文選擇二■英中最具代表性的2，3，7，8-四氯二苯并-對-二■英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)為研究對象，探討在EMS模型中不同劑量及時間TCDD作用模式下TCDD樣配體AhR及其下游活性物質(zhì)CYP1A1的基因表達(dá)狀態(tài)，探尋TCDD在EMS中可能涉及的分子水平作用機(jī)制。

1材料和方法

動物建模

參考1996年Cummings的嚙齒類動物TCDD實驗?zāi)Ｊ浇4-5]，60只成熟未孕SPF級ICR雌性小鼠(體質(zhì)量為28～32g，購自南通大學(xué)實驗動物中心)隨機(jī)分為3個時間組(3周組、6周組、9周組)，每組20只，每組再隨機(jī)分成4個TCDD(標(biāo)準(zhǔn)品純度99%，購自Cerilliant公司)劑量組(每組5只)，其分別為對照組(0μg/kg)、低劑量組(1μg/kg)，中劑量組(3μg/kg)和高劑量組(10μg/kg)。通過灌胃法染毒，每21d給藥1次，首次給藥時間記為0d，在給藥的第21天，再次給藥同時行小鼠自體子宮內(nèi)膜移植術(shù)，自一側(cè)子宮角取約2mm×1mm組織2塊，分別縫合在小鼠腹膜、卵巢。分別在術(shù)后3、6、9周采用脫臼法依次處死各組小鼠，3周組小鼠共暴露TCDD2次;6周組小鼠共暴露TCDD3次;9周組小鼠共暴露TCDD4次。

免疫組織化學(xué)檢測

AhR(PRT9)單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)和CYP1A1(B-4)單克隆抗體(SantaCruzBiotechnology)分別作為一抗。石蠟切片，采用SP法，染色步驟按試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)內(nèi)說明進(jìn)行，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色。用已知陽性的小鼠胎盤組織作陽性對照，以磷酸鹽緩沖液替代一抗作陰性對照。顯微鏡下，細(xì)胞胞漿中具有棕褐黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。結(jié)果采用計算機(jī)圖像分析軟件Image-Proplus對AhR及CYP1A1陽性部位進(jìn)行原位半定量檢測，每張切片隨機(jī)選用5個視野，選取陽性部位，測定累積光密度(integralopticaldensity，IOD)、面積(area)、計算相對光密度(相對IOD=IOD/area)值，而5個視野的相對IOD平均值作為該切片的代表值。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測

AhR、CYP1A1和內(nèi)參照物β-actin引物應(yīng)用軟件設(shè)計，由南京金思特科技有限公司合成，與從GeneBank下載的mRNA序列核對無誤。AhR上游引物：5′-TACTCCACTTCAGCCACC-3′，下游引物：5′-TGTCATGCCACTTTCTCC-3′，241bp;CYP1A1上游引物：5′-AGTATTTGGTCGTGTCAGTAG-3′，下游引物：5′-TCCAGGGAAGAGTTAGGC-3′，494bp;β-actin上游引物：5′-ATGGATGACGATATCGCT-3′，下游引物：5′-ATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3′，184bp。參照TrizolReagent(美國Invitrogen公司)說明書，采用一步法提取子宮內(nèi)膜異位灶組織的總RNA。RT-PCR參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRaRNAPCRkit(AMV)(大連寶生物工程有限公司)說明書進(jìn)行。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2min;94℃變性30s，47℃退火30s，72℃延伸30s，擴(kuò)增30個循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)攝影，掃描PCR產(chǎn)物溴乙錠染色后強(qiáng)度，分別行定性及半定量檢測。

統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用單因素方差分析(one-wayANOVA)和LSD(Least-significantdifference)法進(jìn)行組間比較，多個變量之間相關(guān)性用皮爾遜相關(guān)分析(Pearsoncorrelationtest)，P為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

TCDD對EMS小鼠的影響

建模術(shù)后3周開腹鑒定異位病灶的形成，對照組(n=5)和染毒組(n=15)小鼠的卵巢和腹壁種植處均建模成功，形成典型的異位病灶。Pearson相關(guān)分析顯示，染毒時間和劑量與異位病灶面積的增長呈明顯的正相關(guān)(r分別為、，均P)。對照組成模小鼠的異位種植灶在不同時間點(術(shù)后3、6、9周)，其外觀大體一致。

AhR在小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中的表達(dá)

免疫組化顯示對照組和染毒組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶中均有AhR陽性反應(yīng)表達(dá)。AhR蛋白于對照組小鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞漿上，AhR蛋白在染毒組小鼠子宮內(nèi)膜腺上皮和基質(zhì)細(xì)胞的胞漿均有表達(dá)，主要位于基質(zhì)細(xì)胞胞漿(圖1)。AhR蛋白在染毒組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶中表達(dá)增強(qiáng)，和對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P)。6周和9周時，不同染毒劑量組AhR蛋白表達(dá)差異明顯(P);隨著染毒劑量的增加和染毒時間延長，AhR蛋白表達(dá)也相應(yīng)增加(r分別為、，均P;表1)。

CYP1A1在小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中的表達(dá)

CYP1A1蛋白位于染毒組小鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞漿，高劑量染毒組CYP1A1蛋白表達(dá)明顯增加，和低劑量染毒組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P)。隨染毒劑量增加，CYP1A1蛋白表達(dá)相應(yīng)增加(r=，P)，染毒時間延長和CYP1A1蛋白表達(dá)無明顯相關(guān)性(r=，P)，對照組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶上未檢測到CYP1A1蛋白表達(dá)(圖2，表2)。

AhRmRNA在小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中表達(dá)

染毒組小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中AhRmRNA表達(dá)明顯增加，和對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P)，6周和9周時，各染毒劑量之間比較，AhRmRNA表達(dá)水平差異明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義(P)。隨染毒劑量增加和暴露時間延長，AhRmRNA表達(dá)相應(yīng)增加(r分別為、，P;表3，圖3)。

CYP1A1mRNA在小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中的表達(dá)

染毒組小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中檢測到CYP1A1mRNA表達(dá)，同一時間組內(nèi)(3，6，9周)不同染毒劑量比較其表達(dá)差異明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義(P)。隨染毒劑量的增加，CYP1A1mRNA表達(dá)明顯增加(r=，P)，暴露時間的延長并沒有增加其mRNA表達(dá)(r=，P)，對照組小鼠異位子宮內(nèi)膜病灶中未檢測到CYP1A1mRNA。見表4，圖4。

3討論

TCDD在EMS發(fā)生中的作用

近年來，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)EMS發(fā)病率的增高可能與現(xiàn)代環(huán)境污染釋放的環(huán)境毒素有關(guān)，其中毒性最強(qiáng)的環(huán)境毒素二■英與EMS之間關(guān)系引起世界廣泛關(guān)注[1]。比利時也是世界二■英污染較嚴(yán)重的國家之一，研究發(fā)現(xiàn)比利時女性血液中二■英的毒性當(dāng)量(toxicequivalents，TEQ)明顯高于意大利女性，就比利時國家EMS和二■英相關(guān)性的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，隨著血液中二■英TEQ的升高，腹腔EMS和子宮腺肌癥的發(fā)病危險性也會相應(yīng)增加，進(jìn)一步證實了二■英可能是EMS發(fā)病的致病因素之一。本實驗EMS小鼠模型研究也證實了TCDD可促進(jìn)小鼠EMS異位病灶的生長，且有時間和劑量的依賴性。盡管如此，兩者的關(guān)聯(lián)性從動物模型至人群流行病學(xué)調(diào)查仍存在爭議[9-10]。研究結(jié)果的不一致性考慮可能是因為病例組和對照組的篩選標(biāo)準(zhǔn)、研究設(shè)計及分析方法等不同所導(dǎo)致。因此，二■英和EMS的相關(guān)性有待

PorporaMG，MeddaE，AbballeA，etal.Endometriosisandorganochlorinatedenvironmentalpollutants：acase-controlstudyonitalianwomenofreproductiveage[J].EnvironHealthPerspect，2009，117(7)：1070-1075.

GuoSW.Theassociationofendometriosisriskandgeneticpolymorphismsinvolvingdioxindetoxificationenzymes：Asystematicreview[J].EuroJObstGynecolReprodBiol，2006，124(2)：134-143.

KimEY，IwataH，SudaT，etal.Arylhydrocar-bonreceptor(AHR)andAHRnucleartranslocator(ARNT)expressioninBaikalseal(Pusasibirica)andassociationwith2，3，7，8-TCDDtoxicequivalentsandCYP1expressionlevels[J].CompBiochemPhysiolCToxicolPharmacol，2005，141(3)：281-291.

CummingsAM，MetcalfJL，BirnbaumL.Promotionofendometriosisby2，3，7，8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxininratsandmice：time-dosedependenceandspeciescomparison[J].ToxicolApplPharmacol，1996，138(1)：131-139.

劉娟，任慕蘭.二■英對小鼠模型子宮內(nèi)膜異位癥的影響[J].中國婦幼健康研究，2009，20(2)：161-163.

BeckerCM，WrightRD，SatchiFR.Anovelnoninvasivemodelofendometriosisformonitoringtheefficacyofantiangiogenictherapy[J].AmJPathol，2006，168(6)：2074-2084.

DeFelipE，PorporaMG，diDomenicoA，etal.Dioxin-likecompoundsandendometriosis：AstudyonItalianandBelgianwomenofreproductiveage[J].ToxicolLett，2004，150(2)：203-209.

HeilierJF，NackersF，VerougstraeteV，etal.Increaseddioxin-likecompoundsintheserumofwomenwithperitonealendometriosisanddeependometriotic(adenomyotic)nodules[J].FertilSteril，2005，84(2)：305-312.

YangJZ，AgarwalSK，F(xiàn)osterWG，etal.Subchronicexposureto2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinmodulatesthepathophysiologyofendometriosisinthecynomolgusmonkey[J].ToxicolSci，2000，56(2)，374-381.

TsukinoH，HanaokaT，SasakiH.AssociationsbetweenserumlevelsofselectedorganochlorinecompoundsandendometriosisininfertileJapanesewomen[J].EnvironRes，2005，99(1)：118-125.

Bruner-TranKL，YeamanGR，CrispensMA，etal.Dioxinmay