酶工程酶的分離純化

第三章酶的分離純化酶分離純化的目的

酶分離純化的目的是使酶制劑產(chǎn)品達(dá)到應(yīng)用所需的純度。分離純化過程包括3個(gè)基本步驟：

1抽提

2純化

3制劑Crudeproductconcentrationversussellingprice(Dwyer,1984)某些生化物質(zhì)在原料液中的

濃度與價(jià)格的關(guān)系(1984年)

物質(zhì)名濃度(C)價(jià)格(P，＄)尿激酶510－53108熒光素酶810－32106胰島素410－19104頭孢菌素10102乙醇1102310－1在分離純化中必須注意：

1防止酶的變性失活；

2在分離純化過程中的每一步都

應(yīng)檢測(cè)酶的活性，以確定酶的

純化程度和回收率。第一節(jié)酶活力的測(cè)定幾個(gè)名詞

1酶活力或酶活性 2酶活力單位 3mol催化活性（分子活性）和轉(zhuǎn)換 數(shù)（催化中心活力) 4酶的比活力酶活力（又稱酶活性）

(enzymeactivity)（IU/g或IU/mL)

指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力；用在一定條件下，所催化的反應(yīng)初速度來表示；是研究酶的特性，酶制劑生產(chǎn)應(yīng)用以及分離純化時(shí)的一項(xiàng)必不可少的指標(biāo)。酶活力單位(enzymeactivityunit)

表示酶活力大小的尺度；

一個(gè)國際單位（IU）是指在特定條件下（25

0C），每分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物或催化形成1mol產(chǎn)物所需的酶量

一個(gè)Kat是指每秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物所需的酶量，1Kat=6107IU。mol催化活性（分子活性）和

轉(zhuǎn)換數(shù)（催化中心活力）

mol催化活性是指單位時(shí)間內(nèi)，每個(gè)酶分子所轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)目；轉(zhuǎn)換數(shù)（Kcat)是指酶分子中每個(gè)活性中心所轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)目。如果酶分子中只有一個(gè)活性中心，那么mol催化活性與轉(zhuǎn)換數(shù)相等，如果酶分子中含有n個(gè)活性中心，那么轉(zhuǎn)換數(shù)則為mol催化活性除以n。酶的比活力

（specificactivity)

酶的比活力是酶純度的量度，是指單位重量酶蛋白所具有的酶活力，單位為IU/mg。比活力越大，酶純度越高。酶活力的測(cè)定方法：１終止反應(yīng)法２和連續(xù)反應(yīng)法。終止反應(yīng)法

在恒溫反應(yīng)系統(tǒng)中，每隔一定時(shí)間，取出一定體積的反應(yīng)液，用強(qiáng)酸強(qiáng)堿或SDS以及加熱等使反應(yīng)立即停止，然后用化學(xué)法、放射性化學(xué)法或酶偶聯(lián)法分析產(chǎn)物的形成量或底物的消耗量。這是最經(jīng)典的酶活力測(cè)定方法，幾乎所有的酶都可以根據(jù)這一原理設(shè)計(jì)出具體的測(cè)定方法。連續(xù)反應(yīng)法

無須終止反應(yīng)，而是在酶反應(yīng)過程中用光化學(xué)儀器或電化學(xué)儀器等來監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行情況，對(duì)記錄結(jié)果進(jìn)行分析，然后計(jì)算出酶活力。酶不可逆失活的原因和機(jī)理蛋白介質(zhì)（清酶）憤的失胖活機(jī)轉(zhuǎn)理蛋白承質(zhì)不潮可逆驗(yàn)失活藥的原懸因蛋白型酶水饒解或自繭溶作舌用表面本活性烈劑和去脹垢劑聚合鐮作用氧化款作用機(jī)械避力變性系劑重金服屬離荷子和巰洞基試哭劑冷凍護(hù)和脫押水熱極端pH蛋白外質(zhì)不可陪逆失袋活脲和設(shè)胍高濃術(shù)度鹽螯合有機(jī)湊溶劑輻射郊作用蛋白速質(zhì)的鄰穩(wěn)定殊化蛋白供質(zhì)穩(wěn)辟定化蛋白伸質(zhì)穩(wěn)督定化肺途徑如何徑防止疊蛋白貪質(zhì)的址可逆限伸展如何末防止肉蛋白旨質(zhì)不押可逆暈失活夏反應(yīng)巖發(fā)生穩(wěn)定名蛋白秀質(zhì)（末酶）惰的方務(wù)法酶分疊離的治一般篇流程原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線二細(xì)胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液－胞外產(chǎn)物粗分離(鹽析、萃取、超過濾等)純化(層析、電泳)脫鹽(凝膠過濾、超過濾)濃縮(超過濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性第二位節(jié)壺酶晉溶液卵的制潔備酶溶漁液的告制備苗：把酶違從生首物原園料中督抽提喂出來紙，作抬成酶邁溶液駐酶溶修液的鍛制備揭包括昂：材迎料預(yù)郊處理震及細(xì)殺胞破來碎、巡壽抽提道、凈揉化脫廚色、范抽體輩液的保濃縮疑等幾鼓個(gè)步燃驟。一、釘材料希預(yù)處是理及宗細(xì)胞護(hù)破碎材料蝴預(yù)處河理：酶蛋項(xiàng)白在凝細(xì)胞稿內(nèi)外影的分酒布有時(shí)三種鋼情況最：胞迷外酶僵，胞頑內(nèi)酶扮（溶侵酶和日晶酶糕）。微生希物胞狠外酶可以喇用鹽交析或涉有機(jī)御溶劑丟沉淀神等從拐發(fā)酵歷液中錯(cuò)沉淀響成酶監(jiān)泥胞內(nèi)捧酶要先揭收集丈菌體暈，經(jīng)棒細(xì)胞漏破碎械后提己取動(dòng)物興材料應(yīng)先沿剔除牛結(jié)締灶組織蝕和脂嶼肪組鉛織等植物貨材料應(yīng)去帖皮等圈以免饅單寧怪等物粒質(zhì)著迷色污矛染細(xì)胞未破碎上：物理君和化母學(xué)兩年大類玻方法1、吳物理劉破碎警：—研磨承（手播磨，蜻球磨瀉和石乞磨）還，—機(jī)械鳥搗碎禾（勻籍漿器炎和高鋒速組絮織搗驗(yàn)碎器勞等）帳，—高壓西法，—爆破域性減舟壓法圾，—專用該波振敞蕩，—快速判冷凍押融化逝法等砌。2、錯(cuò)化學(xué)得破碎逝：—滲透衛(wèi)作用—自溶崗：—酶處尊理—表面?zhèn)蚧钚愿G劑（I）滲透雞作用將指爆數(shù)生旗長(zhǎng)期丙的菌波體用隊(duì)緩沖以液洗炭?jī)?，躬并懸襖浮于給含蔗斗糖和ED暑TA的稀Tr貨is緩沖獨(dú)液中若，離垮心，攝加入Mg于Cl2劇烈杠攪拌感，可協(xié)使一隙些水園解酶暑從細(xì)幼胞內(nèi)喉釋放識(shí)出來退。（II掀）自溶向菌腫體中超加入瞇醋酸斤乙酯株，甲咬苯，翻乙醚育以及葬氯仿刻，使麻細(xì)胞愈滲透螺性改子變保棟持一盯定時(shí)殲間后抹可以砍使細(xì)細(xì)胞自鳳溶；（II聞I）酶處將理用溶節(jié)菌酶笛專一釀性地蒙分解低原核曲微生莖物細(xì)稿胞壁腐，使檢胞內(nèi)追酶釋蛛放（IV登）表面堡活性災(zāi)劑膜結(jié)慌合的矮晶酶葬在細(xì)首胞破跟碎后療很難廈溶解怠，常緣瑞借助纖于表共面活錘性劑撇與脂輸?shù)鞍讘傩纬沙蔽⑴莸?，使頑之溶章解。二、隸抽啄提—大多華數(shù)酶昨蛋白母是屬教于球熊蛋白囑，因嶄此，押可用舟稀鹽綠、稀惹堿或散稀酸悶的水懷溶液卵進(jìn)行伸抽提岔；—抽提羅液的胡具體拖組成牽和抽紛提條稍件的釘選擇扒取決殺于酶堪的溶編解性巾、穩(wěn)能定性鬼以及棋有利米于切講斷酶掙與其戶它物余質(zhì)的掘連結(jié)再。1、買提取慚的主極要方繳法：惑（1酸）鹽靜溶液敵提取歲（陷2）異酸溶由液提夏取恒（3尊）堿海溶液雪提取帝（電4）屈有機(jī)同溶劑追提取2、喊酶提版取過盛程的致注意葉事項(xiàng)——pH的選例擇——鹽的尺選擇——溫度惠的選絡(luò)擇——抽提兩液用靠量——其它pH的選謙擇——首先肉考慮小酶的某穩(wěn)定頭性；乓其次集應(yīng)演遠(yuǎn)離斧等電攀點(diǎn)；慨一般接選擇pH茄4-憂6為宜味。鹽的芬選擇——大多使數(shù)酶桿在低鐵濃度瓜的鹽蘿溶液材中有緩較大晌的溶兵解度舊，一劇般選斃擇等行滲鹽選溶液悟，如協(xié)0.霸02嫁-0誦.0授5mo淚l/梁L的磷顛酸緩具沖液碗或0遷.1鑄5mo蓬l/景L的Na脾Cl等。溫度問的選嚷?lián)瘛话惆部刂频乖?章-40C，如果蓬酶沖比潮較穩(wěn)拿定可任以例拉外。抽提賣液用依量——常采括用材越料量涼的1祖-5疾倍其它——加入勒蛋白繞酶抑電制劑繭、半講胱炊氨酸纖或細(xì)刪胞色液素C等，僵來痰穩(wěn)定逢抽提傘系統(tǒng)恰。三、班酶溶立液的翁絮凝谷、凈光化與透脫色絮凝——由于鼠發(fā)酵緩液黏這度較帥大，烘細(xì)胞柜表面愛電荷矩排姻斥以氣及多如糖蛋貢白質(zhì)窩等大返分子疫物質(zhì)辭形成水的盟水化振層等翼給酶敢溶液葛的離鄰心或哄過濾葵帶來悟困劑難；勇因此客要用鍋絮凝撫劑進(jìn)慕行處航理?！跄鲃哼^多種秧類型扯無引機(jī)：組如醋知酸鈣童和磷見酸鈣賞等談?dòng)袡C(jī)口：如釀聚丙嬌烯酰停胺等災(zāi)天朋然高答分子內(nèi)：如舌殼多信糖等過濾告或離驕心凈秧化——通過寇絮凝慕劑處妥理后冬的酶陳溶液鑼經(jīng)過逆離心巷或過受濾將編細(xì)胞狀碎片箱等固凈性物膠和雜坦蛋白罵，粘毒多糖茫，核乎酸以們及脂連類等易大分猜子物準(zhǔn)質(zhì)去休除。脫色——酶的忙工業(yè)我生產(chǎn)幣中，確常用停的脫引色劑卡為活魄性炭剝，活句性炭號(hào)通過己吸附緒色素夢(mèng)而脫卷色；謀活性算炭用極量一朗般為饒0.的1%騾-1頓.5故%。四、栗酶溶恭液的戲濃縮—冷凍悲干燥陶法—蒸發(fā)泥法：—超過罰濾法沈：—膠過銷濾法堤：—干燥冷凍忌干燥遲法——先將岡酶溶繁液凍呀成固擋體，加然后退在真拍空狀挎態(tài)下足使水逝分子逆從固萌體表錯(cuò)面直滿接升殘華。蒸發(fā)竭法——目前聰工業(yè)調(diào)上采格用較墨多的壺是薄橡膜蒸染發(fā)法權(quán)，在羨高度掛真空每狀態(tài)權(quán)下使源酶溶靜液轉(zhuǎn)款變?yōu)闇珮O薄勸的液烏膜，妻通過鋼加熱須而迅遙速汽脹化，啦經(jīng)旋脅風(fēng)式炊汽液渣分離月器達(dá)背到濃石縮的采目的旨。超過次濾法——將酶晨溶液愛通過富只允鏟許小漲分子毯物質(zhì)化通過宋的微匆孔濾勿膜，習(xí)大分津子的泊酶蛋拴白被牙截留熄而達(dá)屯到濃外縮的塊目的備。膠過笛濾法——利用Se教ph都ad斥exG-醫(yī)25祖0或G-臭50吸水漲膨脹序，而叼酶蛋添白被尚排阻穗在膠毫的外監(jiān)面。其它說方法——吸水角劑如致用聚盜乙二鴉醇(PE謹(jǐn)G)處理濕小量廳樣品鑄。干燥——將固吼體、畢半固遞體或近濃縮位液中本水分郵（或雄其他芝溶劑用）除驗(yàn)去一晚部分闖，以徐獲得哈含水以量較盒少的環(huán)固體刷過程雷。——方法咳：真批空干估燥、捏冷凍裝干燥汁、噴咳霧干醉燥、從氣流爽干燥張、吸馬附干晉燥第三槳節(jié)重酶迷分離騰純化巡壽的基筑本過沈程一、香酶分蛛離純考化方城法的饅選擇目前舉酶的繡分離迎純化勻方法脈都是如根據(jù)葬酶與暴雜蛋辨白的趴性質(zhì)讀差異中而建仔立的叫，在憑選擇昌分離愿純化行方法笛時(shí)，宴要考原慮以準(zhǔn)下幾寇個(gè)方青面：—首先趨對(duì)待挪純化智的酶埋的理緞化性傲質(zhì)有律比較積全面救的了逮解；—以酶關(guān)活力往和比撥活力陽為標(biāo)奸準(zhǔn)，宴判斷施所選貧擇的界方法猜是否月得當(dāng)葉；—嚴(yán)格帶控制四操作臨條件徑，防濟(jì)止酶攏的變宋性失蹲活。選擇虹生物椒分離使方法麻的依尾據(jù)1物理吹化學(xué)笛性質(zhì)2生物巴體系濁的特歌性3能用導(dǎo)作分悲離和驚純化胡依據(jù)固的蛋績(jī)白質(zhì)凳性質(zhì)1贏.物理?xiàng)澔瘜W(xué)煮性質(zhì)分子賭大小任、分龍子量彩、分央子體從積、喪極性澤、偶櫻極矩倡、熔總點(diǎn)、死沸點(diǎn)筆、汽伴化熱暴、離攪子電施荷、捉溶解鞠度參唐數(shù)、蠻折射踩率、榨表面夜張力腦、介職電常概數(shù)、膝密度訓(xùn)、粘插度、頓酸堿番強(qiáng)度桌、pK值、胡等電替點(diǎn)(pI索)等等垃。物機(jī)質(zhì)之榨間得旁以分山離的殘主要?jiǎng)σ罁?jù)聞就是潛組分寺間的違物化朗性質(zhì)造的差飽異。在涉賭及具鋸有生圖物活就性物級(jí)質(zhì)的肆體系嘗中，奸有關(guān)填這方老面的枯數(shù)據(jù)出與化英工產(chǎn)喊品相硬比要串少得稅多，耐嚴(yán)重德影響菠了生候物分健離過播程的淹有效熟進(jìn)行濫。因貫此，首生物黨體系閃的物各化性伴質(zhì)的慌研究方應(yīng)成遍為一候個(gè)重擦點(diǎn)。2.生物傍體系家的特掀性對(duì)一漿些有鳥生物嶼活性鍵的物啦質(zhì)，走不是圈能夠象用一鍛般的尖物化拉性質(zhì)菌來表停達(dá)的坑，這嶺就需券要了婆解這印些物征質(zhì)的欄生物初特性峽，特滿別要財(cái)知道刃影響侍生物患特性夫變化手的條王件和泄這些爸物質(zhì)眠失活慕的因仗素，邪包括紅溶劑攏、pH值、啊溫度公等等艱。這漆種保漫持生驅(qū)物質(zhì)繭特性計(jì)不至劉于改宜變的旱措施攝就是骨所謂史的穩(wěn)沒定性繪維持誰。3.能用些作分指離和縣純化醒依據(jù)紀(jì)的蛋遵白質(zhì)年性質(zhì)能從畏混合途物中算分離童和純拿化出絕一種徹蛋白于質(zhì)是眉因?yàn)樘O不同閣蛋白跨質(zhì)有簡(jiǎn)著不叔同的焰物理牽和化件學(xué)性伍質(zhì)。筋這些防性質(zhì)可是由繼于蛋碰白質(zhì)吼的氨屠基酸蜻數(shù)目豪和序拌列不險(xiǎn)同造嗎成的己。連鄭接在議多肽伯主鏈塔上的頃氨基況酸殘邁基可送以是帶正按電荷框的或耀帶負(fù)哄電荷未的、團(tuán)極性劈燕的或栗非極晌性的扔、親艇水性苗的或競(jìng)疏水塘性的。此外根，多醋肽可短折疊送成非餐常確辟定的休二級(jí)勺結(jié)構(gòu)(螺旋象、折疊羨和各斷種轉(zhuǎn)躲角)和三得級(jí)結(jié)鳳構(gòu)，誕形成勇獨(dú)特喇的大踩小、吃形狀露和殘獻(xiàn)基在階蛋白指質(zhì)表切面的塌分布妄狀況果。利糊用待閱分離悔蛋白逝質(zhì)與砍混合勉物中臺(tái)其它乳蛋白震質(zhì)之清間在甩性質(zhì)賠上的爪差異勢(shì)，即訊能設(shè)帽計(jì)出介一組醒合理該的分館級(jí)分忽離步須驟。酶分鹽離純背化方竭法—根據(jù)漏分子倒大小鎮(zhèn)建立挎的分乖離純沉化方沾法—根據(jù)偉溶解壁度建迫立的沾分離抱純化芽方法—根據(jù)孤電荷敵性質(zhì)飾建立坡的分圣離純朽化方概法—根據(jù)雁親和體作用泉建立系的分層離純儀化方蛛法—根據(jù)由穩(wěn)定悉性差貸異建肉立的欠分離腦純化雕方法．．敲．．碌．．一、只根據(jù)崖分子磨大小茂建立榴的分?jǐn)_離純企化方棚法——透析——超過成濾——離心——凝膠鉗過濾仁等。1、透柄析(D號(hào)ia量ly漏si怒s)法：過程：將院酶溶丙液裝畢入透窗析袋禁中，胃放入總蒸餾訴水或葵稀緩軟沖液仰中，來小分皇子物仇質(zhì)通軌過透染析袋帥進(jìn)入箱水或引緩沖飲液中尸，而寶蛋白福質(zhì)被好截留薦在透糾析袋蕩中；透析淘袋類扎型：有析兩種歇，再繭生纖乘維素裹膜透蕩析袋貿(mào)和纖甘維素傳酯透粗析袋惠。有侄多種勇型號(hào)擔(dān)和規(guī)千格，蟻主要綠參數(shù)漆是分繳子量艇截留飾值（11勁02D）；產(chǎn)商品烈名為sp搞ec譜tr垃ap嬌or等。透析蕉袋的守預(yù)處胳理：干規(guī)燥的鋼透析怒袋在躁制備倆過程氏中曾科用10化%甘油按處理撲過，斜只要喇浸泡孕濕潤壇和蒸肆餾水辱洗滌黎即可愉使用錦；必端要時(shí)把可用10澤mm紛ol盛/L碳酸燙氫鈉餡，50駁%乙醇汽和10是mm航ol差/L呆E徐DT塑A處理豈后，拜再用企蒸餾配水洗挖滌。透析圈袋酶溶置液蒸餾詞水透析亭裝置肆和過白程2、超少過濾利用羞壓力競(jìng)或離繩心力啞強(qiáng)行返使溶炒質(zhì)按冶大小栽形狀煎的差墓異分葛開，劫將所辛需的禁酶分僚子被愁濾膜慮截留雹，而畏其它女較小趟的分薦子隨梁溶劑掌被壓浮到膜藏的另壟一側(cè)班。超濾卷膜——制備煙超濾扮膜的客材料躁多是堤高分威子聚腦合物描（如直聚砜指類，內(nèi)聚四準(zhǔn)氟乙煩烯等驕；目排前有漫圓形罩和卷元式等俊多種頑超濾次膜類弓型；冰主要像參數(shù)第是截怠留分膠子量返，耐揮受壓痕力和渾濾速企和有艱效過鼓濾面曠積等驚；主飲要商悶品型溝號(hào)有Am誤ic福onDi弓af遷lo系列杜等。超濾橡器類階型——有管轎式，寬中空舒纖維拆式，慕螺旋訊卷繞傘式和爸平板涂式四敵種類扛型。加壓酶溶涉液超濾病膜支持心柵板超濾顛液超濾架裝置3、離碌心法——離心設(shè)是借勁助于座離心如機(jī)旋落轉(zhuǎn)所溜產(chǎn)生腔的離即心力銷，使臭不同阿大小講和不決同密鍵度的爸物質(zhì)建分開旺的技巷術(shù)。（1）離資心機(jī)撞的種嫩類和餡用途物（2）沉乳降系原數(shù)S（3）離宅心方裳法的晚選擇差速勿離心渡密馳度梯方度離拼心姓等密孔度離預(yù)心（4）離孕心條勵(lì)件的怠確定離心額力況離心伴時(shí)間霉離距心溫登度和pH值梯度策離心密度哨梯度在離泛心管或內(nèi)的黎分布干是管新底的麥密度駐最大,向上帆逐漸獻(xiàn)減小蔗糖便宜滑，純恭度高盯，濃狠溶液核（60％，w/推w）密齡度可疑達(dá)1.炮28纏g/頓cm3。聚蔗括糖的商覺品名鍋是Fi悄co銜ll，它密是由壁蔗糖憑和1-氯-2豈,3闊-環(huán)氧守丙烷熄合成避的高禿聚物壤，Mr約40云00燒00。需要殊高密效度和忍低滲棗透壓叉的梯嗚度時(shí)治，可魚用Fi濕co謙ll代替慨蔗糖介。4、凝廟膠過逮濾法原理：又恥稱分親子篩庭層析干，在壇層析逝柱中歸填充哪凝膠析介質(zhì)宜，加慶入待遵分離針的酶蛋溶液矛，然寇后用享適當(dāng)拾的緩畜沖液茶洗脫棉，樣爽品自蓬上而蛙下擴(kuò)恐展，秧大于住凝膠才孔徑芬的分蔽子不矛能進(jìn)善入膠符粒內(nèi)毀部而桐從膠謀粒間愿空隙夜擴(kuò)展祝，下梯移速紋度較斯快，輕而小轎于凝桂膠孔猾徑的分分子賓進(jìn)入狠膠粒妖內(nèi)部蘆，下淘移速關(guān)度較略慢，田經(jīng)過蛾一定寬時(shí)間第后不弦同大柴小分玩子按卡先大每后小詳?shù)捻樳t序從頃層析別柱中釣流出色。凝膠層過濾凝膠鋸過濾Tu吐be黨s呆ma簡(jiǎn)rc系h泳in完f帽ro饞m澤le蠶ftA28泡0Fr盟ac葵ti澤on飲#部分程使用憂的擔(dān)族體目前堆使用棍最廣添泛的瞞擔(dān)體凱材料跳：※交聯(lián)枝后的障葡聚川糖凝兼膠※聚丙堅(jiān)烯酰吉胺※瓊脂※其它測(cè)物料二、切根據(jù)眼溶解靜度建漏立的臨分離叔方法1、鹽析(S嫩al澆ti專ng恩O愛ut優(yōu))法2、降低陜介電驢常數(shù)騾法（博有機(jī)澤溶劑酒沉淀銳法優(yōu)）3、等電句點(diǎn)沉去淀法4、共界沉淀氧法5、選擇贊性沉心淀法胃：1、鹽析元法最常干用的也是硫貿(mào)酸銨事。鹽數(shù)濃度塊以飽獨(dú)和度跌表示落，飽濫和鹽丑溶液槳的飽萍和度劫為10跡0%。調(diào)流整鹽襪濃度殼有兩石種方德法：朝加入榴飽和卷硫酸稻銨溶怠液（欠蛋白熊質(zhì)溶祝液體椅積不權(quán)大時(shí)首）和凈直接巴加入賊固體叔硫酸挽銨（弟蛋白巷質(zhì)溶平液體膀積較魄大時(shí)能）。加入怎飽和東硫酸辮銨：10英0m叉l溶液危中，含由飽廳和度S1變?yōu)镾2，應(yīng)勿向其奪中加憑入的褲飽和種硫酸雜銨溶拼液的ml數(shù)V=活V0（S1-S2）/（1-括S2）。直接貴加入位固體電硫酸清銨可壞以直肥接查“調(diào)整伏硫酸妨銨溶希液飽譜和度復(fù)計(jì)算叉表”。2、降界低介含電常觸數(shù)法的（草有機(jī)另溶劑陷沉淀嬸法）降低竭介電寺常數(shù)舍方法顯在巖酶溶籠液中修加入博與水扭互溶嚴(yán)的有賊機(jī)溶逆劑，典可以叉降低族介電久常數(shù)獲，使罰酶分研子間告的靜撫電引厭力增吼加而著發(fā)生噴沉淀絕。影響?yīng){介電郊常數(shù)榴的主簡(jiǎn)要因越素：——溫度——有機(jī)番溶劑——離子齒強(qiáng)度——煙p篇H值：溫度覆：——在0℃下進(jìn)級(jí)行操音作；駐有機(jī)奸溶劑手必須策冷至-1露5~犯-恢20總℃，邊誼攪拌招邊緩烘慢加嗽入，麥沉淀它析出窄后迅聽速離棒心分許離，坑并用狠預(yù)冷漲緩沖觸液溶正解沉犯淀。有機(jī)子溶劑記：——常用趁的有稠機(jī)溶慎劑有士丙酮耀，乙存醇，碼甲醇爭(zhēng)，異犧丙醇掏等離子填強(qiáng)度——大多富數(shù)中侮性鹽偏在低寧濃度者時(shí)能賠增加井酶蛋發(fā)白的鈔溶解悟并減錫少變劉性，亞在有搞機(jī)溶項(xiàng)劑沉右淀中謊加入5~選10殖%（<0茶.0拾5m置ol）的昏硫酸擔(dān)銨有羨助于信提高多分辨鉗率。pH值——盡可酷能接鉆近酶拳的等妄電點(diǎn)pI3、等電嫌點(diǎn)沉屈淀法——酶在揭等電蹲點(diǎn)處中容易葬發(fā)生碰沉淀4、共帝沉淀曠法——一些記大分綁子非搞離子嘩型聚虹合物繼如聚躺乙二渴醇（PE徒G）,聚乙蠶烯亞侍胺（PE志I）單梯寧酸賤，硫韻酸鏈持霉素葛以及缺表面砍活性于劑（SD起S）等聲在一碗定條衫件下涂可以排直接有或間腥接與凱蛋白沉質(zhì)形遭成絡(luò)些合物踏而沉障淀析妨出,再用秘適當(dāng)硬的方父法使剛酶溶難解出幅來。5、選擇緞性沉輪淀法刷：有些崇多聚叮電解兔質(zhì)可正以在郵極低帆濃度肢下選致?lián)裥晕鄣嘏c其某些勝酶結(jié)游合而責(zé)形成紙沉淀遙。如這聚丙烈烯酸恒（PA扔A）可征以與良某些艘蛋白絡(luò)酶，盜溶菌盯酶和黑磷酸咬酯酶枯等形律成沉弱淀。斑分離垂過程藏如下嘗：PA督A+酶護(hù)酶PA暫A-酶+C日a2+PA敏A-指C煤a2++酶PA噸A-那C跑a2++各SO42-Ca患SO4+芬PA涂A三、您按蛋跳白質(zhì)虎電荷繩性質(zhì)臭設(shè)計(jì)愛的分從離方丟法1、吸崗附法（1）物論理吸伶附法社（2）羥傘基磷依灰石某法香（3）離涌子交精換吸界附法-離子番交換蓮色譜鉛法2、電泳舉法（1）區(qū)米帶電打泳些（2）等尺點(diǎn)聚悶焦電寧泳（3）高卸效毛女細(xì)管析電泳阿（4）聚飼焦層許析（1）物鋒理吸久附法(不介與紹)（2）羥脖基磷刮灰石盤法——羥基妄磷灰厭石是奧一種冊(cè)微晶貫型磷販酸鈣響；一游般認(rèn)趴為其澆表面咬的鈣贏離子陡和磷鎮(zhèn)酸根祖離子縫與蛋壤白質(zhì)屯帶相掀反電剩荷的產(chǎn)基團(tuán)假發(fā)生桑相互奶作用億；在明低鹽索和弱闊酸或站中性虛條件描下進(jìn)傍行吸良附；云洗脫扇時(shí)提致高離誦子強(qiáng)爹度；寄多采讓用柱忙層析描方式源進(jìn)行切。（3）離妖子交刷換吸這附法——離子梅交換砍色譜嘴法——利用心帶電創(chuàng)荷的扎離子加交換弄?jiǎng)橄漭d體吼，將貸帶相元反電黨荷的麻蛋白遍質(zhì)吸褲附，醬然后錫在一節(jié)定條捕件下旅洗脫慢下來歐。離子穗交換傍層析削過程籃：—離子原交換灣劑的戒預(yù)處百理—平衡—裝柱—加樣擱吸附—洗脫—洗脫爛液收誓集與手相應(yīng)望檢測(cè)—離子澇交換涼劑的旺再生離子褲交換勞劑——一般島由高氣分子斑支持臥介質(zhì)徒（母盆體）中和功熱能基選團(tuán)（秘離子讀交換亂基）困兩部羅分組領(lǐng)成。離子謎交換團(tuán)劑應(yīng)谷滿足竟下列薯要求魄：（1）有高昨度的耽不溶閘性，即擺在各線種溶仆劑中懲進(jìn)行爐交換蜓時(shí)，情交換狐劑不榨發(fā)生擱溶解（2）有疏沃松的叫多孔鵲結(jié)構(gòu)賺或巨帽大的婦表面夕積，使權(quán)交換稍離子鎮(zhèn)能在驚交換訓(xùn)劑中蝦進(jìn)行嬌自由喘擴(kuò)散系和交歐換（3）有較壘多的矩交換紀(jì)基團(tuán)（4）有穩(wěn)攻定的承物理仍化學(xué)域性質(zhì)，在童使用子過程鳳中，心交換耳劑不適能因騾物理倍或化味學(xué)因曠子的辜變化來而發(fā)淘生分翻解和寒變形黃等現(xiàn)袋象。離子產(chǎn)交換傭劑的3種類清型——根據(jù)種高分耐子支總持介剝質(zhì)的移性質(zhì)——離子疼交換棟樹脂——離子緒交換爛纖維某素——離子咬交換麥球型路多糖(如葡坐聚糖痰凝膠梅和倘瓊脂期糖凝梨膠等)。2、電申泳法——在直糟流電莊場(chǎng)中琴，由欄于各灘種蛋館白質(zhì)抬分子手所帶咱電荷薯不同可，移粒動(dòng)速送度不耗同，胃形成叔各自副的區(qū)漁帶，蛾用顯渾色劑漁如Co考o(jì)m窩as害si封eBl幟ue染色縱后，致可以趕在支弦持物阻上看簽到蛋虛白質(zhì)艇的顏豎色譜揮帶，饒每條這帶代遠(yuǎn)表一含種蛋聽白質(zhì)萬?；九吭淼鞍滓踪|(zhì)是陪兩性疾電解抵質(zhì)，眨在一孝定pH下，駕可解妹離成杠帶電脖荷的紡離子哀，在鍬電場(chǎng)棗作用盛下可隆以向紅與其過電荷磨相反吼的方楊向的犧電極六泳動(dòng)訂，泳醬動(dòng)速腫度主畏要取斜決于舅蛋白淡質(zhì)分拴子所楚帶電技荷的補(bǔ)性質(zhì)殖、數(shù)昏量及剪顆粒饅的大害小和渴形狀足。由于倒各種諸蛋白禮質(zhì)的設(shè)等電巧點(diǎn)（pI）不同燭，分殺子量罵不同客，在襪同一森個(gè)pH緩沖宴溶液足中所炎帶電位荷不犧同，乞故在遼電場(chǎng)藍(lán)中的旺泳動(dòng)洽速度畢也不格同，邁利用佩此性訪質(zhì)，正可將賞混合陷物中拆不同慣蛋白幣質(zhì)分冶離開墓，也搭可用嚴(yán)其對(duì)爽樣品高的純毫度進(jìn)訴行鑒亭定。雙向蝴電泳-1雙向御電泳-2雙向蒜電泳-3電泳奴法（1）區(qū)奇帶電艙泳其（2）等剛點(diǎn)聚橫焦電屯泳（3）高視效毛蓮細(xì)管損電泳（1）區(qū)啦帶電屬泳——在惰匹性支逐持物亭上進(jìn)嗓行電帥泳時(shí)資樣品督中各殃組分底遷移燙速度主不同果而分炎布成絞區(qū)帶腦的一旅類電鞏泳分冠離方宗法——按支鬧持物攝的物犧理性蠻狀可幣分為3種類歲型：—膜電先泳—粉末打電泳—凝膠祖電泳膜電考泳——以濾倘紙、內(nèi)聚酰您胺薄雀膜，膀醋酸些纖維霧薄膜剖等為理支持村物的航一類屈電泳帥分離囑方法稿。粉末責(zé)電泳——以淀宿粉、蹦纖維消素粉得或硅秋膠粉證等為橋支持棒物的議分離恐方法黃。凝膠證電泳——以聚竟丙烯決酰胺亭為支燙持物護(hù)，兼膜有分替子篩膀效應(yīng)厭。區(qū)帶級(jí)電泳飲的優(yōu)約點(diǎn)分辨冰率較伶好設(shè)備背簡(jiǎn)單操作鏈方便（2）等元點(diǎn)聚漸焦電齊泳——利用訂兩性腔電解膚質(zhì)在頑直流剝電場(chǎng)剝中形哄成一憑個(gè)連粉續(xù)的pH梯度裙，樣督品中議各種幣蛋白鍛質(zhì)在竹各自駐的等抓電點(diǎn)折在相冊(cè)應(yīng)的pH區(qū)段廳聚集規(guī)而達(dá)跑到分旦離的爛目的揉。等電抬聚焦憶電泳高效丙毛細(xì)奶管電除泳毛細(xì)羨管電禽泳是在繪內(nèi)徑鐵為25濤~1自00m的石醫(yī)英毛著細(xì)管中緩進(jìn)行昂電泳皺，毛袖細(xì)管蒸中填糠充了絞緩沖慕液或夢(mèng)凝膠煤。使用塘毛細(xì)傭管的第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是:它減振少了早由于奶熱效兆應(yīng)產(chǎn)伸生的魄許多堂問題罪，因滋為管病的孔牛徑小錘，面淘積與雀體積姓之比勇大，恐這樣栗可以炭提高戶熱散權(quán)失，爆有助厭于消勵(lì)除由費(fèi)于熱粱引起灶的擴(kuò)蓬散增摟加而醋造成籌的對(duì)宏流和桶區(qū)帶睡變寬蘿，因彼此管馳中不睡需要吳加入會(huì)穩(wěn)定互介質(zhì)挖即可某進(jìn)行指自由吵流動(dòng)正電泳飄。聚丙閥烯酰虜胺凝躬膠電項(xiàng)泳聚丙捷烯酰夫胺凝薦膠電歪泳（po堪l(fā)y袋ac才ry宵la假mi誼dege匯l碑e快le眾ct割ro茂ph多or衡es羨is，PA辯GE）是商以聚惡丙烯雕酰胺鍛作為脅支持就物的堆一種腥電泳下方法找。PA點(diǎn)GE方法紛成了蓄研究魄蛋白姓質(zhì)和驅(qū)核酸椒等大臥分子晌物質(zhì)惕的重疑要工炮具之減一.實(shí)踐粗中可競(jìng)根據(jù)燈不同暗目的筍選擇妥所需報(bào)的類發(fā)型。一般未單向PA耀GE多用柿于分沸離具碎有活偏性的絕生物房誠物質(zhì)筑，而雙污向或賺梯度PA倘GE則宜服用于局較難遼分離盜鑒別將的生輔物大腿分子座物質(zhì)脈。如果首在PA鞭GE時(shí)加吊入適串量十赴二烷新基磺傭酸鈉斗（SD決S）可束用于猾測(cè)定胖蛋白悟質(zhì)的口分子才質(zhì)量搞；如果PA漂GE與等奏電聚祖焦相步結(jié)合團(tuán)時(shí)，估可用車于分族析蛋票白質(zhì)或的等什電點(diǎn)攏。除這便些用租途外諒，PA散GE還可劫用于能制備感少量愚的純單度高朽、有盒活性穿的生裙物大掛分子智物質(zhì)聚丙挖烯酰辰胺凝驗(yàn)?zāi)z具狹有三隸維網(wǎng)旨狀結(jié)健構(gòu)，壞電泳穿顆粒死通過犯網(wǎng)狀戚結(jié)構(gòu)悲的空彈隙時(shí)板受到鴿摩擦氣力的洋作用耍，摩共擦力辯的大臺(tái)小與謠樣品郊顆粒潔的大慕小呈懸正相乎關(guān)。基本仔原理聚丙擱烯酰囑胺凝僅膠丙烯吧酰胺昨（ac萄ry旋la川mi喊de痛Ac纏r）單需體（mo齒no賽me永r）N，N-甲叉簡(jiǎn)雙丙蛙烯酰序胺（N,碰N-me草th籌yl賤en膀e-bi貫s松a渾cr鑄yl君am登id陡e，Bi坊s）交臟聯(lián)劑陰（cr所os燭sl連in漸ke唯r）聚合遼交聯(lián)原理石：當(dāng)向綁蛋白慣質(zhì)溶凡液中直加入論足夠兩量SD橋S和巰梨基乙加醇，SD瘦S能破洲壞蛋軟白質(zhì)稻分子脆中的男氫鍵懸和疏征水作士用，包使蛋懲白質(zhì)荒變性沖而改棍變?cè)涤械哪繕?gòu)象絮，特露別是慮強(qiáng)還仰原劑吧硫基家乙醇用的存月在，泳使蛋糟白質(zhì)可分子鼓內(nèi)的燭二硫頑鍵還凍原，到從而巴保證滑蛋白紀(jì)質(zhì)與SD影S結(jié)合欺形成菠帶負(fù)輝電荷踐的蛋白糕質(zhì)-熔SD鏟S復(fù)合冬物。SD說S聚丙改烯酰補(bǔ)胺凝裁膠電示泳蛋白階質(zhì)在蒙聚丙抬烯酰什胺凝姨膠中劃電泳譜時(shí)，衡它的習(xí)遷移著率取遇決于如果撈加入妙一種跟試劑淺消除世電荷慰、形臂狀等液因素乒的影羨響，另使電飄泳遷絞移率浪只取撕決于鎖分子截的大渠小，趣就可并以用仁電泳爬技術(shù)噸測(cè)定曠蛋白丸質(zhì)的交分子團(tuán)量。凈電蠢荷分子性的大盒小形狀等因剃素（SD偽S-霞PA禿GE）的挑主要?jiǎng)t用途個(gè)是蛋白來質(zhì)分絕子疤量的雷測(cè)定蛋白織質(zhì)混染合組恥分的大分離蛋白的質(zhì)亞肝基組掏分的召分析擇等四、頂根據(jù)渣親和啄作用磚建立鑄的純故化方城法根據(jù)幣親和縮慧作用皮建立宇的純室化方東法——由于上酶對(duì)療底物陰，競(jìng)勿爭(zhēng)性閑抑制抽劑,輔酶潮等配束體具欲有較折高的擴(kuò)親和監(jiān)力，聰而其遍它雜想蛋白洪對(duì)這獎(jiǎng)些配螞體則本沒有估或有阻很弱深的親皇和作竿用，糧因此億，可寸以根宏據(jù)酶忙與雜店蛋白辮對(duì)配孫體親請(qǐng)和力投的差眼異，悲很容往易地日將酶舞分離灰出來綱?！壳靶呀?jīng)鑼建立傅的方墨法有親和岔層析拜法和親和鄰電泳再法等。1、親和獲層析唇法——親和獎(jiǎng)層析脊的核傻心是親和踢吸附枕劑，它嘆是由腳固相炮載體芝和能宗與目族的酶祝專一些可逆辮結(jié)合宣的配矩體共遲價(jià)結(jié)索合而蹲成的洗。將扛親和情吸附愈劑填跳充層率析柱何，讓昏酶液圓流過像層析躁柱，聲則目醋的酶珍就能撫迅速摩而選外擇性遲地吸璃附在比親和綁吸附硬劑上訊，用騎適當(dāng)奔的溶競(jìng)液進(jìn)商行洗勸滌，買除去指一些獎(jiǎng)非專億一性委的雜奇蛋白臨后，氣再用雄濃度逆高的到或親姓和力腔更強(qiáng)梯的配老體溶效液進(jìn)協(xié)行親農(nóng)和洗棍脫目出的酶師便可無被洗拾脫出安來。親和滋層析引中的挨配體虎構(gòu)成晚示意觀圖Ma跌tr投ix:fo棗rli中g(shù)a靠ndat饑ta小ch芬me粥nt障,壁sh第ou蝕ld戒b獲e芒ch墓em窩ic接al樓ly菌a出nd言p早hy橋si丈ca僅ll件y藝in曾er斑t.Sp稿ac納er驕a腫rm:im寒pr緞ov霜e烤bi批nd悶in園g耀be廁tw巖ee者nli鬼ga籍ndan懷d武ta冊(cè)rg況et尖m五ol喉ec偵ul香e網(wǎng)by微o悟ve眾rc稍om桃in度g賽an鳥y壘ef頭fe抬ct螞s蔑ofst離er梨ichi太nd慌ra口nc粗e.Li構(gòu)ga尾nd:mo倦le君cu壟le第t樂ha光t島bi垃nd底s占re局ve圾rs夸ib制ly片t泛o源a娘sp淋ec歐if允ic貼t旱ar燥ge壩t祥mo矛le借cu干le計(jì)o裕r焦gr耳ou壓p看of快t千ar犯ge滅t午mo許le亡cu灘l