菌種選育理論與技術(shù)

關(guān)于菌種選育理論與技術(shù)第1頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月菌種選育是一門應(yīng)用科學(xué)技術(shù)理論基礎(chǔ)：微生物學(xué)、微生物遺傳學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程等。目的第2頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝條件，縮短生產(chǎn)周期菌種選育的目的研究抗生素生物合成調(diào)控的機(jī)制科研生產(chǎn)分析抗生素生物合成途徑獲得帶遺傳標(biāo)記的菌株了解菌種遺傳背景改變產(chǎn)品組分、改進(jìn)質(zhì)量條件抵抗不良培養(yǎng)條件適應(yīng)新的原材料提高產(chǎn)量提供分子遺傳學(xué)研究材料產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)第3頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月青霉素生產(chǎn)菌種的選育目前工業(yè)發(fā)酵水平經(jīng)誘變85000U／mlWisQ176，900U／ml產(chǎn)黃青霉，20U／ml點(diǎn)青霉，2U／ml1943年，發(fā)霉的甜瓜1928年，F(xiàn)leming第4頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月菌種選育的基本方法根據(jù)菌種自然變異而進(jìn)行的自然選育。用人工方法引起菌種變異或形成新的雜種，再按照工業(yè)要求進(jìn)行篩選來(lái)獲得新的變種或雜種。

包括誘變育種，雜交育種，原生質(zhì)體育種，基因工程育種等。第5頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

自然選育自然選育（naturalscreening）是指利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理，通過(guò)分離、篩選排除衰退型菌株，從中選出維持或高于原有生產(chǎn)菌株的過(guò)程，以達(dá)到穩(wěn)定或提高生產(chǎn)的目的。自然選育的目的淘汰衰退菌種，保存優(yōu)良菌株，純化菌種，防止菌種衰退，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高發(fā)酵產(chǎn)量。第6頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、菌種衰退的原因菌種遺傳特性的改變經(jīng)誘變劑處理后的退化變異

菌種生理狀況的改變

（培養(yǎng)條件）導(dǎo)致衰退可能的原因：沙土管長(zhǎng)期保藏、連續(xù)傳代、新陳代謝產(chǎn)生的誘變物質(zhì)、多因素低劑量誘變效應(yīng)、互變異構(gòu)現(xiàn)象等。第7頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、自然選育的一般過(guò)程第8頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、單孢子懸浮液的制備

定量稀釋后制成50～200個(gè)單細(xì)胞／ml的菌懸液。2、分離及單菌落培養(yǎng)

根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，按絲狀真菌、放線菌菌落大小不同，分離量以5～20個(gè)菌落／平皿為宜。3、篩選

將分離培養(yǎng)后的各型單菌落，接斜面培養(yǎng)，成熟后接入發(fā)酵瓶，測(cè)定發(fā)酵單位的過(guò)程稱為篩選。它分初篩、復(fù)篩兩個(gè)過(guò)程。

第9頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點(diǎn)

簡(jiǎn)單易行缺點(diǎn)

效率低，進(jìn)展慢，難以獲得高產(chǎn)突變株

以微生物的自然變異為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種幾率并不是很高，一個(gè)基因的自然突變頻率僅10－6～10－10目的

純化、復(fù)壯菌種第10頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

誘變育種誘變育種（mutationbreeding）是利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群體，促進(jìn)其突變率大幅提高，然后采用簡(jiǎn)便、高效的篩選方法，從中選出少數(shù)具有優(yōu)良性狀的突變菌株。優(yōu)點(diǎn)：速度快，收效大，方法簡(jiǎn)便。缺點(diǎn)：誘發(fā)突變?nèi)狈Χㄏ蛐裕ぷ髁看?。誘變育種工作主要包括出發(fā)菌株的選擇、誘變處理和篩選突變株三個(gè)部分。第11頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月出發(fā)菌株（沙土管或冷凍管）誘變育種的一般步驟第12頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、誘變劑的種類物理誘變劑：主要包括物理輻射中的各種射線

化學(xué)誘變劑：與DNA發(fā)生作用、改變其結(jié)構(gòu)，并引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)。生物誘變劑：一些能引起DNA結(jié)構(gòu)改變，從而造成突變效應(yīng)的生物體或生物分子。

第13頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月超凈工作臺(tái)小型X射線衍射儀Co60射線機(jī)第14頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、誘變育種的過(guò)程前突變：誘變劑所造成的DNA分子的某一位置的結(jié)構(gòu)改變。

突變：由于染色體或基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。表型延遲：表型改變落后于基因型改變的現(xiàn)象。

第15頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）誘變劑接觸DNA分子前1、細(xì)胞對(duì)誘變劑的透性將影響誘變效果。2、細(xì)胞質(zhì)的某些組分和某些酶可和誘變劑相互作用而影響誘變效果。3、與基因所處的狀態(tài)有關(guān)，而基因的狀態(tài)又和培養(yǎng)條件有關(guān)。

第16頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）DNA損傷修復(fù)光修復(fù)作用（光復(fù)活作用）切補(bǔ)修復(fù)

四種酶的作用：核酸內(nèi)切酶

、核酸外

切酶

、DNA多聚酶

、DNA連接酶重組修復(fù)SOS修復(fù)系統(tǒng)DNA聚合酶的矯正作用第17頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第18頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）前突變到突變的過(guò)程校正差錯(cuò)：光復(fù)活作用、切補(bǔ)修復(fù)和DNA多聚酶校正作用

引起差錯(cuò)：重組修復(fù)和SOS修復(fù)系統(tǒng)

一切影響這些修復(fù)系統(tǒng)中的酶活性的因素都能影響由前突變向突變轉(zhuǎn)變這一過(guò)程

。誘變前后的處理可影響誘變的效果

：1、通過(guò)影響與DNA修復(fù)作用有關(guān)的酶的活性而影響誘變的效果；2、通過(guò)使誘變的目的基因處于活化狀態(tài)(復(fù)制或轉(zhuǎn)錄狀態(tài))，使之更容易被誘變劑所作用，從而影響目的基因的突變率。

第19頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(四)從突變到突變型1、分離性遲延

是經(jīng)誘變處理后，細(xì)胞中的基因處于不純的狀態(tài)(野生型基因和突變型基因并存于同一細(xì)胞中)，突變型基因由于屬于隱性基因而暫時(shí)得不到表達(dá)，需經(jīng)過(guò)復(fù)制、分離，在細(xì)胞中處于純的狀態(tài)(一細(xì)胞中只有突變型基因，沒(méi)有野生型基因)時(shí)，其性狀才得以表達(dá)。2、生理性遲延

突變基因由雜合狀態(tài)變?yōu)榧兒蠣顟B(tài)時(shí)，還不一定出現(xiàn)突變表型，新的表型必須等到原有基因的產(chǎn)物稀釋到某一程度后才能表現(xiàn)出來(lái)。

第20頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、誘變育種的步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)突變株的分離和篩選第21頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第22頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、突變株的篩選(一)隨機(jī)篩選(二)理性化篩選（定向篩選）

運(yùn)用遺傳學(xué)、生物化學(xué)的原理，根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能的生物合成途徑、代謝調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)和采用一些篩選方法，以打破微生物原有的代謝調(diào)控機(jī)制，獲得能大量形成產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株。第23頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第24頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、初級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選普遍存在著反饋抑制和反饋?zhàn)瓒簦蚱品答佌{(diào)節(jié)系統(tǒng)，可從兩個(gè)方面著手：

(1)

篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株例如，谷氨酸發(fā)酵選育的高產(chǎn)菌株為谷氨酸棒桿菌的生物素營(yíng)養(yǎng)缺陷型。第25頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株

營(yíng)養(yǎng)缺陷型:誘變產(chǎn)生的缺乏合成某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，須在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分才能正常生長(zhǎng)的變異株。

野生型:與營(yíng)養(yǎng)缺陷型對(duì)應(yīng)的是野生型。

滲漏缺陷型:是遺傳性障礙不完全的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，突變使某一種酶的活性下降而不是完全喪失，能少量地合成某一代謝產(chǎn)物。第26頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(2)篩選結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株結(jié)構(gòu)類似物：在化學(xué)和空間結(jié)構(gòu)上和代謝的中間物（終產(chǎn)物）相似，因而在代謝調(diào)節(jié)方面可以代替代謝中間物（終產(chǎn)物）的功能，但細(xì)胞不能以其作為自身的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)第27頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、次級(jí)代謝產(chǎn)物(主要是抗生素)高產(chǎn)菌株的篩選利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選

篩選負(fù)變株或零變株的回復(fù)突變株篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株

篩選二價(jià)金屬離子抗性突變株篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株篩選自身所產(chǎn)的抗生素抗性突變株第28頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、抗性篩選抗性突變株的篩選相對(duì)比較容易，只要有10–6頻率的突變體存在，就容易篩選出來(lái)抗性突變株的篩選常用的有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種手段（三）理性化篩選的方法第29頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）一次性篩選法一次性篩選法就是指在對(duì)出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中，一次性篩選出少量抗性變異株抗噬菌體菌株篩選耐高溫菌株篩選耐高酒精度、高滲透壓的菌株也可分別在高濃度酒精或加蔗糖等造成的高滲環(huán)境下一次性篩選獲得第30頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）階梯性篩選法無(wú)法知道微生物究竟能耐受多少高濃度的藥物藥物的抗性變異也是逐步發(fā)展的，時(shí)間上是漸進(jìn)的梯度平板法紙片擴(kuò)散法第31頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月吡哆醇與代謝拮抗物異煙肼的分子結(jié)構(gòu)梯度平板法也常用于抗代謝拮抗物突變株的篩選，以提高相應(yīng)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。如：吡哆醇高產(chǎn)菌株篩選第32頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

梯度平板法(Gradientplate)第33頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

紙片擴(kuò)散法與梯度平板法的原理類似，用打孔器將較厚的濾紙打成小圓片，并使紙片吸收一定濃度的藥物，經(jīng)干燥或不經(jīng)干燥，放入涂布了菌懸液的平板上，一般9厘米的培養(yǎng)皿中等距放置三片為宜。經(jīng)培養(yǎng)后觀察圍繞紙片的抑菌圈，抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)的可能就是抗性菌。紙片擴(kuò)散法第34頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月階梯性篩選法的缺點(diǎn)

階梯性篩選法只有在抑制區(qū)域才能挑選抗性菌，而低濃度區(qū)域面積較大，優(yōu)良的抗性突變株若被分散在低濃度區(qū)域或遠(yuǎn)離紙片的區(qū)域，則可能沒(méi)有被檢出，因此，漏檢的幾率較大。

第35頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株篩選與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型有關(guān)的三類培養(yǎng)基①基本培養(yǎng)基（MM，minimalmedium）：能滿足某一菌種的野生型或原養(yǎng)型菌株?duì)I養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基②補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM，supplementalmedium）：在基本培養(yǎng)基中有針對(duì)性地補(bǔ)加某一種或幾種營(yíng)養(yǎng)成分，以滿足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)需要（其他營(yíng)養(yǎng)缺陷型仍不能生長(zhǎng)）的培養(yǎng)基③完全培養(yǎng)基（CM，completemedium）：可滿足該菌各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基第36頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法1)淘汰野生型抗生素法：將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時(shí)讓野生型處于活化階段，而缺陷型處于休眠狀態(tài)且在培養(yǎng)基中加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型菌絲過(guò)濾法：對(duì)于霉菌，因孢子生長(zhǎng)后會(huì)長(zhǎng)出菌絲體，就可用濾紙過(guò)濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而保留在處理液中第37頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2)檢出缺陷型原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)情況完全不同，缺陷型在CM上生長(zhǎng)良好，而在MM上則不生長(zhǎng)，野生型都能生長(zhǎng)具體方法：影印法、點(diǎn)種法、夾層法第38頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第39頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月也稱任意法用接種針或牙簽將CM上長(zhǎng)出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點(diǎn)種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)情況此法結(jié)果明確，但工作量大點(diǎn)種法第40頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時(shí)第二批長(zhǎng)出的菌落就可能是缺陷型此法缺點(diǎn)是，結(jié)果有時(shí)不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易夾層法第41頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3)營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)譜的確定方法二以不同組合的營(yíng)養(yǎng)混合物與融化涼至50℃的MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個(gè)缺陷型菌株于各相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長(zhǎng)出可推知其營(yíng)養(yǎng)因子在5～6個(gè)平皿上可測(cè)20株菌以上。第42頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)

雜交育種雜交育種是指將兩個(gè)基因型不同的菌株經(jīng)吻合(或接合)使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選具有新性狀的菌株。雜交育種的目的在于：（1）通過(guò)雜交使不同菌株的遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換和重新組合，從而改變?cè)芯甑倪z傳物質(zhì)基礎(chǔ)，獲得雜種菌株(重組體)；（2）可以通過(guò)雜交把不同菌株的優(yōu)良生產(chǎn)性能集中于重組體中，克服長(zhǎng)期用誘變劑處理造成的菌株生活力下降等缺陷；（3）通過(guò)雜交，可以擴(kuò)大變異范圍，改變產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，甚至出現(xiàn)新的品種；