熒光檢測(cè)原理

關(guān)于熒光檢測(cè)原理第1頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光PCR？

熒光標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)變化第2頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光染料光能熱能轉(zhuǎn)移給臨近的分子第3頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

熒光標(biāo)記信號(hào)的產(chǎn)生

熒光標(biāo)記基團(tuán)在某波長(zhǎng)的激發(fā)光刺激下，產(chǎn)生一個(gè)更長(zhǎng)波長(zhǎng)的發(fā)射光第4頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光信號(hào)熒光染料直接結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物SYBRgreenI——特異性結(jié)合雙鏈，釋放熒光信號(hào)熒光標(biāo)記引物特異性熒光探針Taqman雙熒光標(biāo)記探針molecularBeacon熒光標(biāo)記探針熒光標(biāo)記雜交雙探針第5頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGREENI第6頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月FRET？

當(dāng)某個(gè)熒光基團(tuán)的發(fā)射譜與另一熒光基團(tuán)的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個(gè)基團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從短波長(zhǎng)（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長(zhǎng)波長(zhǎng)（低能量）的熒光基團(tuán)，這個(gè)過程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET),實(shí)際相當(dāng)于將短波長(zhǎng)熒光基團(tuán)釋放的熒光屏蔽。第7頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Taqman？特異性熒光雙標(biāo)記探針Taq酶5’→3’外切酶活性第8頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Molecularbeacon？第9頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光標(biāo)記雜交雙探針變性退火延伸第10頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月CT值—樣本擴(kuò)增曲線與閾值線交叉點(diǎn)的循環(huán)數(shù)第11頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月對(duì)數(shù)期分析與終點(diǎn)分析的比較第12頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光PCR重現(xiàn)性第13頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)曲線→定量第14頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光PCR特點(diǎn)靈敏度高特異性強(qiáng)全封閉PCR過程，無需后處理采用dUTP—UNG酶的防污染系統(tǒng)，有效降低污染機(jī)會(huì)即時(shí)反映擴(kuò)增過程，摒棄終點(diǎn)數(shù)據(jù)，更適用于定量定量范圍寬，可達(dá)到10個(gè)數(shù)量級(jí)，無須稀釋樣品可實(shí)現(xiàn)一管多檢儀器自動(dòng)分析，更快獲得結(jié)果第15頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR熒光雙檢多檢試劑第16頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光雙檢多檢檢測(cè)試劑原理針對(duì)同種樣本，不同的引物分別擴(kuò)增不同的靶DNA，并分別被不同的特異性探針?biāo)R(shí)別，通過探針的不同熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)區(qū)分。特點(diǎn)一次性處理樣品一次性反應(yīng)一次性給出2種或2種以上病原體檢測(cè)結(jié)果兩套或兩套以上擴(kuò)增體系相互無信號(hào)干擾第17頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月競(jìng)爭(zhēng)性熒光內(nèi)標(biāo)(IC)定量PCR技術(shù)第18頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月競(jìng)爭(zhēng)性熒光內(nèi)標(biāo)(IC)什么是IC?

Internalcontrol簡(jiǎn)稱IC，通常是指與靶序列十分相似的一段DNA序列，兩者在相同的條件下可被同一對(duì)引物擴(kuò)增，具有相同的擴(kuò)增效率；區(qū)別在于兩者的探針結(jié)合區(qū)，可分別被不同序列的探針識(shí)別，通過探針的不同熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)區(qū)分。IC的作用

監(jiān)控PCR反應(yīng)，避免樣本抑制物、DNA（RNA）提取過程的丟失、誤操作等造成的假陰性結(jié)果；并對(duì)以上原因造成的定量誤差進(jìn)行修正。第19頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)標(biāo)工作原理圖第20頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光定量PCR的臨床應(yīng)用早期診斷病情評(píng)估和預(yù)后判斷抗病毒藥物療效的觀察、指導(dǎo)新藥驗(yàn)證輸血源的篩選母嬰傳播的控制與觀察遺傳疾病的診斷腫瘤的診斷第21頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月疾病的早期診斷免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)用于臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后，而許多病原體的免疫學(xué)檢測(cè)存在較長(zhǎng)的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均長(zhǎng)達(dá)70天，不利于對(duì)疾病的早期診斷；PCR方法直接檢測(cè)病原體的DNA/RNA，能大大縮短“窗口期”，其高靈敏度的檢測(cè)顯然也有利于疾病的早期診斷。第22頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月病毒感染窗口期的NAT檢測(cè)第23頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月病情評(píng)估和預(yù)后判斷通過定量檢測(cè)病毒滴度可以間接評(píng)估受侵器官或組織的炎癥發(fā)生程度以及是否發(fā)生病變；長(zhǎng)時(shí)間機(jī)體病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往預(yù)后不好。因此對(duì)病原體的定量PCR檢測(cè)對(duì)病情和預(yù)后評(píng)估均有參考意義。第24頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月對(duì)病毒感染的藥物治療中，免疫學(xué)指標(biāo)的變化通常比較滯后出現(xiàn)，且受個(gè)體差異影響較大，從而對(duì)臨床判斷難以及時(shí)提供直接證據(jù)；而熒光定量PCR檢測(cè)可直接反映病原體滴度是否受藥物治療發(fā)生變化，從而為藥物療效觀察提供直接依據(jù)，以供治療方案參考。同時(shí)對(duì)不同治療時(shí)間的用藥劑量和用藥時(shí)間提供依據(jù)?？共《舅幬锆熜У挠^察、指導(dǎo)第25頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月ALTAnti-HBsMonthsafterStartofTherapy0NormalAltBeforetherapy1234561224DNAHBeAgHBsAgSustainedResponsetoIFNTherapy

*HoofnagelpaperCHRONICHEPATITISB

第26頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月CHRONICHEPATITISB

ALTMonthsafterStartofTherapy0NormalAlt治療前1234561224HBVDNAHBeAgHBsAgPoorResponsetoIFNTherapy第27頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

不同劑量IFN-a單次給藥后HCV-1型病人

病毒滴度變化的定量監(jiān)測(cè)（N=32）Lametal-Hepatol26:226,1997Baseline24hours48hoursgenomes/mlx1million0246810121410MIU5MIU3MIU第28頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月新藥驗(yàn)證

任何一種抗病毒藥物，以免疫標(biāo)志物來評(píng)價(jià)其療效均不夠敏感和及時(shí)，若以病毒復(fù)制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和動(dòng)態(tài)變化來評(píng)價(jià)療效，則較為直接和理想。第29頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月拉米夫定抑制血清HBVDHA0-20-40-60-80-100治療周數(shù)拉米夫定安慰劑血清HBVDNA;中位%變化0481216202428323640444852n=192n=404n=171n=359III期臨床研究的綜合數(shù)據(jù)第30頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月遺傳疾病的早期診斷熒光PCR可實(shí)現(xiàn)對(duì)點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變、多基因突變等的檢測(cè)。對(duì)產(chǎn)前診斷具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)，有利于優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質(zhì)。第31頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月突變檢測(cè)原理

錨探針突變探針突變探針Tm值較錨探針低5℃不完全配對(duì)完全配對(duì)第32頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月突變檢測(cè)原理不完全配對(duì)完全配對(duì)溫度低 中 高第33頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月FactorV點(diǎn)突變檢測(cè)第34頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月ForwardPrimerReversePrimerDNACGCCGCLCRed640

LCRed705

擴(kuò)增子HybprobePair1HybprobePair2雙點(diǎn)突變的檢測(cè)原理第35頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月雙位點(diǎn)雙色檢測(cè)WithoutcccWithcccMut1+Mut2WT1+WT2Het1+Het2H20F2F3第36頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月母嬰傳播的監(jiān)控

熒光PCR可對(duì)病原體的母嬰傳播進(jìn)行有效的監(jiān)控，為確定宮內(nèi)感染、圍產(chǎn)期感染或哺乳期感染等提供依據(jù)，為母嬰傳播的阻斷等提供參考。第37頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月腫瘤的診斷熒光PCR的作用：可對(duì)原癌基因的突變和易位等作出檢測(cè)。可對(duì)原癌基因的mRNA進(jìn)行定量分析。有利于腫瘤的早期診斷，甚至癌前診斷。探索癌變發(fā)生機(jī)理的研究提供參考。區(qū)別腫瘤的良性和惡性以及炎癥反應(yīng)。第38頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光PCR在血液篩查中的應(yīng)用第39頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月NAT(NucleicAcidAmplificationTesting)NAT應(yīng)用于血液篩查的意義血液篩查現(xiàn)狀篩查方法：免疫學(xué)輸血危險(xiǎn)性來源：窗口期獻(xiàn)血，病毒變異，非典型免疫應(yīng)答和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的失誤NAT可顯著縮短窗口期，提高輸血安全性HBV：縮短6-15天HCV：縮短41-60天HIV：縮短10-15天第40頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月急性感染時(shí)期HIV的標(biāo)志物第41頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月急性感染時(shí)期HCV的標(biāo)志物第42頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月急性感染時(shí)期HBV的標(biāo)志物第43頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月病毒顆粒DNARNAFQ-PCRRT-FQPCR裂解熒光信號(hào)檢測(cè)核酸純化系統(tǒng)多通道熒光PCR自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)熒光PCR檢測(cè)流程自動(dòng)加樣第44頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月多樣本混合（Minipool）規(guī)格：16-96donations“Pool”是為了加快篩查的進(jìn)度和降低成本，將多袋血漿進(jìn)行混合后進(jìn)行檢測(cè)?！癙ool”的規(guī)格取決于臨界陽性和所用NAT試劑的檢測(cè)限度。(據(jù)文獻(xiàn)，PEI要求歐盟所有原料血漿必須進(jìn)行HCV-RNA的NAT檢測(cè)，單份血源的檢測(cè)限度應(yīng)達(dá)到5000IU/ml，約1.35~2.4×104geq/ml;目前FDA要求單份血源的RNA（HIV/HCV）檢測(cè)限度應(yīng)達(dá)到5000copies/ml)篩查方法：遞減法矩陣法第45頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月