噬菌體展示技術(shù)的原理及其應(yīng)用

Phagedisplay

LiuYun

——基于將某個(gè)蛋白與其遺傳信息之間直接聯(lián)系的篩選方法1

噬菌體展示技術(shù)（PhageDisplaytechniques，PDT）起源于1985年，是一種用于篩選和改造功能性多肽、蛋白質(zhì)強(qiáng)有力的生物技術(shù)，廣泛應(yīng)用于蛋白組學(xué)、基因克隆等多個(gè)分子生物學(xué)領(lǐng)域。概述

目前噬菌體展示技術(shù)的研究進(jìn)展非常迅速，在抗原決定簇的定位、蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的確定、特異調(diào)節(jié)分子的分離和人工抗體和疫苗的制備、診斷技術(shù)、酶抑制劑的研究開(kāi)發(fā)、多肽藥物的研制等生物技術(shù)研究的不同領(lǐng)域得到了應(yīng)用，并對(duì)這些領(lǐng)域產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。2SmithGP.Filamentousfusionphage:novelexpressionvectorsthatdisplayclonedantigensonthevirionsurface.Science,1985,228:1315-1317.

1985年Smith首次通過(guò)基因工程的手段，將外源基因插入絲狀噬菌體基因組中，從而使表達(dá)的外源肽或蛋白與噬菌體外殼蛋白一起展示在噬菌體表面，由此建立了噬菌體展示技術(shù)。1990年Scott等首次將隨機(jī)序列肽與絲狀噬菌體表面蛋白g融合展示在噬菌體表面，建立了噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)。ScottJK,SmithGP.Searchingforpeptideligandswithanepitopelibrary.Science,1990,249:386.3

噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。到目前為止，人們已開(kāi)發(fā)出了單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)等數(shù)種噬菌體展示系統(tǒng)。

基本原理4特點(diǎn)

該技術(shù)的主要特點(diǎn)是將特定分子的基因型和表型統(tǒng)一在同一病毒顆粒內(nèi)，即在噬菌體表面展示特定蛋白質(zhì)，而在噬菌體核心DNA中則含有該蛋白的結(jié)構(gòu)基因。另外，這項(xiàng)技術(shù)把基因表達(dá)產(chǎn)物與親和篩選結(jié)合起來(lái)，可以利用適當(dāng)?shù)陌械鞍讓⒛康牡鞍谆蚨嚯奶暨x出來(lái)。5PhagesFilamentousphagesM13FdF1OthersT4λ6FilamentousphagesInfectmanygram-negativebacteriaCircularsinglestrandedDNAgenomeAbout6.4kb.p.Long,flexibletubestructureabout1μmlongand6.5nmindiameterReproducedandsecretedfrominfectedbacteriawithoutcellkillingorlysis(lysogenicphage)7(a)Adenovirus.(b)Rotavirus.(c)Influenzavirus(courtesyofGeorgeLeser).(d)Vesicularstomatitisvirus.(e)Tobaccomosaicvirus.(f)Alfalfamosaicvirus.(g)T4bacteriophage.(h)M13bacteriophage.M13噬菌體顆粒結(jié)構(gòu)8M13噬菌體的生活史其裂解周期為：1)吸附(adsorption)2)侵入(entory)3)復(fù)制（生物合成biosynthesis）4)成熟(maturation)5)裝配(assembly)6)釋放(release)9絲狀噬菌體的基因及蛋白結(jié)構(gòu)http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1415-47572005000100001&script=sci_arttext

pIII(406aa,5~8copies)pVIII(50aa,~2700copies)pVI(112aa,5~8copies)10載體的插入位點(diǎn)

11pIII和pVIII噬菌體展示系統(tǒng)pIII系統(tǒng)pVIII系統(tǒng)拷貝數(shù)少多多肽片段大小大<10個(gè)氨基酸親和力高低適用范圍常用于展示由cDNA和基因組序列編碼的多肽，范圍較廣展示小肽，范圍較窄12UsedforcloningforeigngenesamongotherapplicationsProteinsandpeptidesarefusedtotheCapsid(surface)ofthephageThecombinationofthephageandpeptideisknownasaFusionProtein實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路13選擇方法：淘選（Panning)而不是篩選（Screening)14非展示系統(tǒng)展示系統(tǒng)15固相淘選麥系統(tǒng)完整松細(xì)胞組織更，器晶官常規(guī)律法淘選侮方法正負(fù)覺(jué)法競(jìng)爭(zhēng)院法16T7雹噬菌簡(jiǎn)體展春示篩危選系妥統(tǒng)測(cè)序分析插入序列將噬菌體文庫(kù)鋪在固定的靶蛋白上洗脫未結(jié)合的噬菌體加入大腸桿菌，擴(kuò)增和富集洗脫的噬菌體鋪富集文庫(kù)鋪盤(pán)分離單個(gè)克隆3~4輪篩選驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：結(jié)合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)呀流程17So剃li視d微ph零as危e躍se肝le狐c(diǎn)t據(jù)io救n陳wi疑th畜i住mm津un尋ot取ub搬esvIm肯mu極no毯tu農(nóng)beco雜at仿ed意w唱it懶han茫ti為ge艘nco覆at滴ed疏w載it牧hst避ep與ta弄vi太di澆n旦an怨dbi疼ot遵in亞yl援a(chǎn)t址ed候a作nt辰ig忌enBBBBBBBv18Bi刷nd腸t礦o坡St糊re愛(ài)pt印av禍id魂inco怒at文ed習(xí)m宿ic疤ro畝ti想tr說(shuō)e召we顫ll吐s19Wa塵sh利t第o沈re瓶mo稈ve演u廟nb繞ou頌nd懂p疤ha年ge獨(dú)p域ar四ti貪cl什es20El彼ut晨e個(gè)bo蘇un定d融ph鏡ag獎(jiǎng)e21Am足pl嬌if步y(tǒng)施el德ut呢ed謠p糟ha敵geRe西pe魂at婦s清e(cuò)l頭ec閱ti禾onAn告al疑yz惹ea)眠E夸LI妖SAb)撕S剩pe幸ci基fi崖ci煎tyc)撞S浩eq午ue脆nc釘in降gd)借A隊(duì)ff達(dá)in吐it堵ye)評(píng)A伍ct蝴iv銅it賺yE.捆co鎮(zhèn)li感染和擴(kuò)撓增22舉哀例呼吸勒道合周胞病甜毒感疫染呼豎吸道候上皮簽細(xì)胞瞇靶向他肽的敘篩選挪及驗(yàn)喉證23242526272829噬菌穩(wěn)體展固示系辣統(tǒng)的鐵應(yīng)用嫩及優(yōu)那缺點(diǎn)應(yīng)用顯范圍30受體—配體南信壯息傳雖遞蛋白支質(zhì)—蛋白臥質(zhì)拮抗鋸劑蛋白編質(zhì)—D傅NA抑制休劑蛋白綿質(zhì)—其他多肽診斷基因總表達(dá)拼控制中和距活力藥物傳及藥駁物導(dǎo)耐航酶及啞底物31優(yōu)點(diǎn)跨：A.產(chǎn)高晝通量律的淘蹦選：將靶罰標(biāo)分川子（暖抗體掉）固踩定在錘固相旺載體俯上，漿加入油噬菌革體展捷示肽腔庫(kù)（蓮噬菌旨體的憶數(shù)量捐可達(dá)待1011PF院U）泰，利孟用抗域原-嗚抗體先的特批異性欺親和提力將牛與抗洋體結(jié)侵合的雪噬菌忠體吸圍附在諷固相蛛載體蟻上，貨反復(fù)執(zhí)數(shù)輪訴擴(kuò)增涉、淘辯選，嶼即可撈將有帆用的痕基因翻從多泥達(dá)百室萬(wàn)以滾上的茂噬菌揀體克展隆中兇分離布出來(lái)章。B.念高涌效率團(tuán)：在極駕低的悶存在蛙水平營(yíng)下，處挑選設(shè)到高收親和纖力噬倆菌體狂成為舞可能擇。C.平可糠用于迫模擬葵表位貓的篩芹選：利用再噬菌垂體展妖示技餓術(shù)得倦到模協(xié)擬表效位，于同樣拘可誘膜發(fā)與狹天然買(mǎi)表位素相似貓的特醫(yī)異性筑免疫鋸反應(yīng)恥。D.辜展示泡的多訴肽或算蛋白典質(zhì)與謹(jǐn)其包缺含在訂噬菌旁體內(nèi)挖部的蔽基因吃密碼罷的連漸接:使得蘿結(jié)合亦肽或叔蛋白譯質(zhì)的戚序列頓分析蛋既快走速又襖簡(jiǎn)便刻。E.易于勝純化重組濁噬菌甚體的脹純化菠步驟渴簡(jiǎn)單智、不幻玉要求塊昂貴潛的試乳劑與拾設(shè)備倍，在賠一般里的實(shí)豬驗(yàn)室苗條件除下就感可以樹(shù)完成行。32缺