醫(yī)學實驗常用方法學簡介

研究技術（一）光學顯微鏡技術（二）電子顯微鏡技術（三）組織化學術（四）免疫組織化學術（五）原位雜交術（六）細胞和細胞化學定量術（七）組織培養(yǎng)術（八）放射自顯影術

問題解決方法

觀察對象太小放大顯微鏡光線不能透過觀察對象切片觀察對象缺乏反差染色觀察對象生化成分不同細胞化學免疫組織化學觀察對象為生活狀態(tài)培養(yǎng)（一）光學顯微鏡技術1、一般光學顯微鏡2、熒光顯微鏡3、相差顯微鏡4、激光掃描共聚焦顯微鏡（二）電子顯微鏡技術1、透射電子顯微鏡2、掃描電子顯微鏡（三）組織化學術1、多糖2、脂類3、酶4、核酸（四）免疫組織化學術（五）原位雜交術（六）細胞和細胞化學定量術1、顯微分光光度測量術2、形態(tài)計量術3、流式細胞術（七）組織培養(yǎng)術（八）放射自顯影術（一）光學顯微鏡術lightmicroscope（LM）1石蠟切片①取材Formalin40%,4%②固定BouinFormalin40%25ml苦味酸飽和水溶液75ml冰醋酸5ml③脫水--乙醇、包埋--石蠟④切片6um⑤脫蠟二甲苯→乙醇→水⑥染色HEHematoxylin：核酸RER、RibosomeEosin：蛋白、膜結構（mitochondria、SER、lysosome）⑦透明、封片3、涂調片血涂聽片沸精液夏痰爹液盈培養(yǎng)蹦細胞4、鋪片5、磨碰片骨和虎牙需緩制成剝磨片掌、經遭染色駐后觀炭察（二信）電側子顯曲微鏡撿技術電子件顯微撫鏡（睬簡稱描電鏡哭）的讓發(fā)明醬和使嗎用，選使組波織胚攪胎學鼠研究堪內容魄發(fā)生魔了深宣刻變內化。肌光鏡錄分辨摟率為0.案2u連m，放大匙倍數(shù)乘約為10雨00倍，線而電承鏡的妥分辨蹄率為0.習2n準m，比光遠鏡高10遵00倍，襖可放楊大幾矛萬倍隙至幾伴十萬頂倍，英因此瞇電鏡撓能觀爛察到六更微旦細的促結構班。在走電鏡絨下所獻見的鑰結構莊稱為揭超微商結構(ul質tr島as管tr如uc特tu閉re)。用于貞觀察苦細胞森內部榨結構暗，標書本制走備比版光鏡盞的要感求更要嚴格桿，組況織塊群要更傭新鮮咽，體孔積更繳小（1m勤m3），固定哪常用策戊二稈醛和盲鋨酸繪。切很片則肅用超慎薄切脊片機良，制繭成50燈~8權0n豪m(xù)的超靈薄切旋片，刃用醋煤酸鈾東和檸剖檬酸路鉛染麗色，育然后寒在電蘋鏡下斥觀察屬并攝訊片。1、透甩射電華鏡（tr較an費sm石is濕si村onel誓ec鑒tr皮onmi鄰cr劣os江co項pe）用于轟觀察姻組織桃或細伯胞表意面的育微細乳結構密，標檔本需其經噴奮鍍金丈屬膜蛇特殊倆處理烤，然奪后在鐵掃描櫻電鏡勿下觀柔察，灣在熒辛光屏疑上掃憂描成系像，休呈現(xiàn)會富于濃立體半感的借表面巴圖像虹，如涌細胞棕表面最的微腦絨毛填、纖盟毛和爪細胞牽伸出鮮的偽閥足等事。2、掃壟描電眉鏡（sc直an場ni增ng躬e券le心ct棚ro槐n貌mi蘭cr攪os已co礙pe棒)2、冰慢凍切角片組織傻置入壘液氮身（-1形96漂℃）快拖速凍追結，補恒冷顯切片機豆切片招、染抵色。更好菊保存惠細胞萌內酶朋的活皂性、殖蛋白狹質結淺構。缺點序：組設織片宰厚，投經冷頑凍后菌易破林壞組請織結窗構2、熒負光顯疤微鏡避（fl片uo蛋re晴sc親en洞ce吊m痛ic寫ro飲sc累op護e）由光買源、蘿濾光貪系統(tǒng)傭和顯槽微鏡極三個朽部分襖組成倍。光貼源為危高壓顏汞燈返，可婚產生虛紫外曬光，放標本粗中的膽自發(fā)餡熒光竟物質鞋或經侍熒光貿素染腹色或匆標記饑的結充構在橡紫外誤光激籃發(fā)下喚可產賤生各艦種顏線色的味熒光丑，以包此來半研究朝該熒陵光物槐質在體細胞吹和組礎織中編的分藍布。3、相公差顯誼微鏡（ph繞as丟e武co味nt栽ra飾st帥m直ic哨ro脈sc舍op慈e）用于甘進行勾細胞焦培養(yǎng)文中活流細胞晃的觀簽察，伏可使燭無色閥透明蒸的細葛胞鏡堤下結歲構反濃差明蟻顯，動圖像舟清晰綢。4、激忙光掃開描共委聚焦致顯微遭鏡（la話se鹿r栗sc獎an翼ni這ngco淘nf拳oc肯almi期cr態(tài)os雀co幫pe）是近慎年研允制和坡應用奴的一員種新釀型顯聰微鏡客。它損將激島光束舊落在真樣品址上，泰并作因移動惑掃描正，對隔樣品噴內某刊種熒洲光標京記的尖物質口進行豎二維劉和三優(yōu)維的府動態(tài)丸微量適分析國測定劉?？捎掠脕眍}研究撓活細剖胞內Ca2、Na+和K+等pH值的紙動態(tài)粘變化稱；細宋胞內蔽各種廢細胞朝器、塑細胞謙骨架館、核怕酸、階蛋白首質和輸受體缺等的撞定位日和定澆量分笑析；境細胞團膜電兇位、趨膜通神道及唇信息殼傳遞松的檢銀測；坑利用草激光棟對細踏胞結繼構或狐染色悅體作曉切割瀉、分轉離和咬克隆患等逐甩漸成損為生礦物醫(yī)料學研繁究中振重要薦的研麥究手刺段。（三伶）組乓織化是學術駱（hi朗st篩oc硬he牌mi采st防ry）應用莖化學柜反應帶與物催理反碰應原醫(yī)理檢養(yǎng)測組慶織或撤細胞牧內某饞種化味學成大分并圖進行最定位鋪、定市量及貼相關略功能咸研究噴的技涉術。1、多株糖顯示蹄多糖美或蛋溉白多結糖的痛常用佛方法罵是過罷碘酸—雪夫揮反應(p已er沙io矮di只c托ac復id悠S匯ch壓if錘f董re極ac怖ti蹄on凳,P燃AS反應)。組壇織或追細胞跟中的赤多糖嶼被結忙合形叔成紫界紅色訊沉淀舊物。授此反廣應稱PA筍S陽性剪反應披，PA閥S陽性餐部位廊為多誕糖存曠在部兄位。2、脂正類標本深用甲屈醛固壁定，梁冷凍努切片攔，用沿油紅O、尼羅些藍或能蘇丹惑類染卻料染昂色，蹦使組慌織和參細胞幅中的波脂類恥物質燙顯示角相應丘顏色淋。亦傾可用繳鋨酸逮固定此兼染啞色，母脂類何呈黑棋色。3、酶酶細決胞化督學反吸應的疲基本壯原理晃是利看用酶卵對其惠相應漆底物秋的水屑解、吧氧化谷等作鴿用，棗使底漫物的貴反應豎產物儲被某將種捕許獲劑布捕獲額并在活原位柴沉淀叼，形械成有互色的金終產耀物，牛借此樂測定回該酶庫在細楊胞內顛的分故布及敏活性煩強弱盤。4、核領酸顯示DN纖A的傳襲統(tǒng)方引法是Fe湖ul怕ge汽n反應領（Fe盒ul兇ge紹nre瘡ac酷t(yī)i感on），組織累切片訪或細漂胞涂種片先擱經稀把鹽酸損處理拾，使DN缺A水解盾，醛臘基暴嗽露，嗽再用虎雪夫舉試劑蝕處理常，形稱成紫見紅色偶反應初產物妻。（四鞋）免凍疫組它織化蓬學術差（im決mu勒no屯hi搶st腰oc累he測mi險st咬ry）利用衫免疫船學抗臭原和冷抗體哭特異犬性結紹合的很原理捎，檢鍋測組足織或稻細胞伐中的鑒多肽庸和蛋羨白質歪等大遭分子從物質叫的分貓布?；覟轱@晌示抗安原抗語體復察合物耽的存挑在，池需進尾行抗洽體標盒記；白用熒崗光素鏡如異聰硫氰脖酸熒聰光素勉標記曲，可偵以在昨熒光猴顯微當鏡下倉觀察北，用奧膠體箱金標著記，證可以駱在電伐鏡下厭觀察監(jiān)，用俘辣根忘過氧圾化酶駝標記廊，則寬可在甚光鏡贏下或擔在電猶鏡下島觀察音。常霧用的殿方法意有直棚接法匯、間狠接法泳和親源和素-生物騾素復斧合物寄法（AB苦C法）揭等。熒光笑的觀衛(wèi)察（按柜標本公分類嶺）在熒法光顯熔微鏡掘下觀爸察的惹標本賤，當歪然必悔須發(fā)載出熒蜂光，慮可是雖大多育數(shù)標撇本本尊身不杠能發(fā)銜出熒判光，衡因而嶄必須虹用熒炎光色鄰素處彈理過怕才能明發(fā)出壘熒光摘。（A）自銹發(fā)熒歷光（B）二繪次熒據(jù)光（C）抗券體熒山光技搏術（A）自發(fā)竿熒光（不升加染虎色）有些蠢物質恢不加京染色涂，也橫能發(fā)艱出熒濤光（尾自發(fā)名熒光紛或原待發(fā)熒從光）怖，但玻在醫(yī)拆學和艇生物舊學（喊細胞炒學、憤生物肺組織輕、培鐵養(yǎng)體裙等）落領域睬中，留只有錫很少參物質參具有骨自發(fā)惡熒光晌，常勵采用逝后兩影種方貍法。測定耳物質鉆的熒找光光躍譜或孩者激卷發(fā)光仍譜，不可以由判定虧物質何性質精（熒潔光光搬度法吉）。應用攪：生焦物學枕方面——判定么維生辮素，鬧研究很生物仆學上聲的生遼物源案的胺篇。（B）二次團熒光（用液化學家染色譽）非熒尊光性園的物秒質（昏蛋白的質、湖炭水飾化合振物等凱）用容熒光將色素期染色鵲，由捉熒光評色素造產生避熒光掏（二蕉次熒役光）疫，以候便進邪行觀截察，造對特彩定物壺體選詳擇合預適的環(huán)熒光晨色素分，該專物體羅就能義和周術圍的和組織再或細表胞區(qū)襪別（昆分離他）出室來而屬可以蕉觀察銀到。應用酒：吖撓啶橙+核酸金胺+結核精菌介子則奎二名噁因+染色臉體（C）抗體請熒光昏技術（用鵲免疫朗染色暢）利用老特定毀的抗刑原必致然和慎特定巷的抗行體相贊結合瀉這一窯個事熊實，偉有意昨識地虧使帶編熒光映標記叼的抗越體和技標本的中的干抗原霧進行混抗原/抗體塵反應脊，這戀樣兩濃者的壇結合悅體就環(huán)能通柿過抗看體的弟熒光豬觀察軟到。繁熒光閱顯微酸鏡最劫常用毛于抗紡體滎掉光技玩術進嗽行觀沉察，揭并成覆為醫(yī)主學、買生物羨學很著多領窩域中蘭極為概有用滋的工者具。Gl奏ia頂lfi駝br拒il丹la桂ryac御id荒ic風p錦ro辛te幕in熒光賞色素+物質宋激發(fā)茄方法轉吸索收波北長梅輻聞射熒難光（自殃發(fā)熒諷光）維生惡素A紫外屈（UV）32巡壽5-洽34紗5n怎m販47餓0-故49藥0n寧m維生拒素B6紫外銀（UV）35爺6瓜43左2兒茶蛋酚胺簡紫（V）41辭0（40烘5-虎41逼5）48致0（47送5-林48隸5）血清撐素（5-羥色餡胺）肯紫（V）39蓄0（38慌5-丈40戒0）53毀0（52否0-捉54握0）葉綠嶼素抗蘭占（B）52鋼0局65小0-媽66隨0熒光控色素+物質魯激發(fā)女方法寺吸宵收波酷長術輻刮射熒焰光（二次還熒光李）芥子洲奎二遍噁因絲式蘭竭紫（BV）45乘0議5遞00四環(huán)山素+骨，罰牙倍紫（V）或蘭栗（B）39藝0槐5堅60吖啶估橙+D幟NA蘭（B）46避0碼5執(zhí)30吖啶敬橙+R妄NA蘭（B）46轎0京6際50金胺+結核柴菌竄蘭落（G）47核0墳5擁57福爾良根反狹應+D乘NA綠（G）55醉0巷6舒50溴化差乙啶蘿（EB）+D皆NA綠（G）54輕5揀6鄙05Pr棋op貝id葉iu曲mIo雜di霜de（PI）+D舍NA綠（G）53葬0態(tài)6毅15DA豪PI嶄+A薦-T紫外器（U）37避2扁4膝56Mi宅th坐ra識my圖ci壤n+見G-C蘭紫剖（BV）39漠5慮5棒70Ol擁iv薦om徐yc賣in著+G-C蘭紫匙（BV）43塞0拳5削45熒光捏色素+物質井激發(fā)聰方法劈燕吸島收波凍長喉輻背射熒禍光（抗縣體熒理光技宅術）FI存TC蘭（B）49貫5掀52牽5TR繩IT果C綠（G）55嫩5肺58物0羅達足明（Rh味od政am自in成e）綠（G）56線8屯59算7尼羅魂紅+溶酶還體程蘭肺，綠糕（B、G）48績5-競53伴0迎52六5-泡60杰5派若感寧丫+線粒堵體潛綠殺（G）54銜0劑47匆0（五黑）原熔位雜騰交術循（in重s鼻it南u愉hy沙br枝id踩iz捉at丙io駝n）通過凝檢測忌細胞孩內mR陵NA和DN肅A分子法序列越片段蹈，原林位顯違示細喂胞合寸成某辣種多塊肽或瀉蛋白走質的缸基因敘表達所。應賊用某話種已槳知的格并被漲標記畫的RN便A或DN初A片段求即核息酸探齊針（cR緊NA或cD兆NA），奪與細胞裝內的貧待測雷核酸慮（RN脈A或DN掃A片段黑）進甚行雜吸交，技通過揮標記熄物的坡顯示據(jù)在光縣鏡和借（或歪）電蛛鏡下到觀察洞目的mR在NA或DN晨A的存在疫與定范位。標記峽胰島拼素cR爭NA探針，示胰惹島素mR竹NA陽性（六奇）細攪胞和宗細胞僑化學最定量愉術1、顯缸微分扯光光吧度測省量術2、形陳態(tài)計言量術3、流醫(yī)式細轎胞術1、顯窩微分絡光光竊度測唇量術生（mi遵cr幅os賴pe躲ct越ro刪ph唉ot濟om往et稻ry）應用似顯微胸光光席度計與，以終物質刪分子益對光碌波的冰選擇眨性吸埋收為法基礎辱，在務顯微伏鏡下典對生牙物樣吼品中谷的化胖學物鈔質進轎行定大量分恰析。2、形陷態(tài)計示量術用（mo派rp辦ho努me蹈tr瘋y）運用扁幾何忽學和蛾統(tǒng)計皆學原股理，菊對組蠅織或航細胞戰(zhàn)進行盒二維濫和三談維的更形態(tài)檔測量訓研究煌，如莊對細墊胞的冶數(shù)量晃、體原積、表面做積和估周長摘的相橫對和椅絕對用值的慢測量鄙等。3、流覽式細慌胞術每（fl盲owcy玻to主me沸tr阻y）是近暫年發(fā)握展起異來的資細胞原分類貌和定候量研暈究技州術，蛾能對層細胞行的生冠物化放學和弟生物俯物理抖特性議進行在快速爐定量師測定溜，還待可分啊選收講集各覽種細耽胞。直該技勤術的墻建立險為細績胞動調力學演、免扒疫學栗、血于液學田和腫江瘤學練等的拍研究咬提供灰了重己要的承研究恢手段潔。如掀細胞鉗周期魄各時阻相細城胞的跡比例材，同址步分像析細狂胞內DN走A、RN謹A和蛋俯白質挺的含轎量，T淋巴原細胞壁亞群丹的分階離和測定量