腫瘤靶向治療分子標(biāo)靶應(yīng)用進(jìn)展

腫瘤靶向治療分子標(biāo)靶應(yīng)用進(jìn)展第一頁，共79頁。背景資料20世紀(jì)70年代前:腫瘤生物學(xué)研究：細(xì)胞和亞細(xì)胞水平腫瘤細(xì)胞生長失控而處在不斷的周期性分裂中,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞分裂速度加快。傳統(tǒng)化療藥：針對(duì)阻斷有絲分裂中微管蛋白形成的細(xì)胞毒性藥物和破壞DNA合成的抗代謝藥物抗瘤譜較廣，選擇性不強(qiáng)，效果差別很大同時(shí)損害正常細(xì)胞，有嚴(yán)重不良反應(yīng)第二頁，共79頁。20世紀(jì)70年代后:腫瘤生物學(xué)研究：分子水平腫瘤中癌基因擴(kuò)增而激活，抑癌基因突變失活或丟失，基因轉(zhuǎn)錄和蛋白產(chǎn)物異常，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常活化，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不受控制地增殖，細(xì)胞凋亡抑制，腫瘤新生血管形成。腫瘤分子生物學(xué)研究闡明了腫瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，為腫瘤藥物治療提供了一種新的模式。第三頁，共79頁。腫瘤的靶向治療

targetedtherapy第四頁，共79頁。依據(jù)已知腫瘤發(fā)生發(fā)展中涉及的異常分子和基因，設(shè)計(jì)和研制針對(duì)這些已知的特定分子和基因靶點(diǎn)的藥物，選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的治療方法。靶向藥物只作用于特定靶點(diǎn)的腫瘤，特異性強(qiáng)，能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞。第五頁，共79頁。腫瘤靶向藥物

分類和特性第六頁，共79頁。單克隆抗體藥物非結(jié)合型單抗結(jié)合型單抗小分子化合物酪氨酸激酶抑制劑血管生成抑制劑蛋白酶體抑制劑環(huán)氧化酶抑制劑雌激素受體抑制劑其它小分子化合物

凋亡誘導(dǎo)劑周期蛋白酶抑制劑端粒酶抑制劑第七頁，共79頁。一、單克隆抗體藥物某些表面抗原主要存在于惡性細(xì)胞而不存在于周圍正常細(xì)胞上，這些腫瘤相關(guān)抗原可成為特異性抗體結(jié)合的靶點(diǎn)。能結(jié)合到腫瘤細(xì)胞上引發(fā)特異性免疫反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的單抗，稱為抗腫瘤單抗藥物。第八頁，共79頁。1.非結(jié)合型單抗這類藥物能直接結(jié)合到腫瘤細(xì)胞上，觸發(fā)宿主免疫反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；或通過抗原抗體結(jié)合后，阻斷或中和靶分子的生物學(xué)活性，干擾細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮抗腫瘤作用。第九頁，共79頁。CD20-利妥昔單抗(rituxmab)商品名:美羅華1997年真正意義上第一個(gè)腫瘤靶向藥物抗CD20的人鼠嵌合抗體主要治療復(fù)發(fā)性或難治性低度惡性B細(xì)胞淋巴瘤；現(xiàn)也用于中、高度惡性B細(xì)胞淋巴瘤。第十頁，共79頁。CD52-阿侖單抗(alemtuzumab)抗CD52的人源化單抗用于治療苯丙酸氮芥和氟達(dá)拉濱治療失敗的B淋巴細(xì)胞性白血病，某些T細(xì)胞淋巴瘤如蕈樣霉菌病和Sezary綜合征。第十一頁，共79頁。HER2-曲妥珠單抗(trastuzumab)商品名:赫賽汀(herceptin)抗EGFR2(Her2)的人源化單抗用于治療Her2高表達(dá)的乳腺癌和其它惡性腫瘤(胃癌、卵巢癌等)。第十二頁，共79頁。EGFR--西妥昔單抗(cetuximab)抗EGFR(Her1)的人鼠嵌合抗體用于治療標(biāo)準(zhǔn)化方案無效，且EGFR陽性的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。人源化的單克隆抗體－－帕尼單抗（Panitumumab）第十三頁，共79頁。VEGF-貝伐單抗(bevacizumab)抗VEGF的重組人源化單抗抗腫瘤內(nèi)新生血管形成的作用用于治療進(jìn)展期或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，與標(biāo)準(zhǔn)化方案聯(lián)合應(yīng)用，能顯著提高療效并延長生存。第十四頁，共79頁。2.結(jié)合型單抗由能特異性識(shí)別腫瘤抗原的單抗偶聯(lián)到放射性核素或細(xì)胞毒素上，以提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。第十五頁，共79頁。替伊莫單抗(britumomab)第一個(gè)得到美國FDA批準(zhǔn)的單抗—放射性核素偶聯(lián)物商品名：Zevalin由90Y(釔)通過連接螯合劑tiuxetan偶聯(lián)到鼠抗CD20抗體上的抗腫瘤單抗偶聯(lián)物。用于利妥昔單抗治療無效或復(fù)發(fā)的低度惡性B細(xì)胞淋巴瘤。第十六頁，共79頁。托西莫單抗(tositumomab)另一種單抗—放射性核素偶聯(lián)物由131I(碘)偶聯(lián)(bexxan)到鼠抗CD20抗體用于標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療無效的低度惡性B細(xì)胞淋巴瘤。第十七頁，共79頁。吉姆單抗(gemtuzumab)商品名:Mylotarg第一個(gè)得到美國FDA批準(zhǔn)的單抗—細(xì)胞毒素偶聯(lián)物由抗CD33重組人源化單抗與細(xì)胞毒類抗腫瘤抗生素刺孢霉素(calicheamicin)偶聯(lián)而成。用于治療標(biāo)準(zhǔn)化方案初治失敗，CD33陽性急性髓性白血病(AML)的60歲以上的中老年患者，現(xiàn)也可與標(biāo)準(zhǔn)化療方案聯(lián)合治療AML。第十八頁，共79頁。二、小分子化合物某些非細(xì)胞毒性小分子化合物具有明確的作用靶點(diǎn)，通過阻斷治療中異?；罨募っ?、生長因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等途徑來抑制腫瘤的生長，從而達(dá)到治療的目的。這些小分子化合物稱為小分子腫瘤靶向治療藥物。第十九頁，共79頁。1.酪氨酸激酶抑制劑（TKI）第二十頁，共79頁。吉非替尼(gefitinib)商品名：易瑞沙(iressa)是一種針對(duì)表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶的口服小分子抑制劑用于治療不能手術(shù)或復(fù)發(fā)的NSCLC。第二十一頁，共79頁。埃羅替尼(erlotinib)一種新的、選擇性EGFR受體酪氨酸激酶抑制劑可用于治療對(duì)化療耐藥的NSCLC、卵巢癌和頭頸部癌等。拉帕替尼（Lapatinib）是一種能同時(shí)抑制EGFR和HER-2，用于Herceptin耐藥的乳腺癌。第二十二頁，共79頁。第二十三頁，共79頁。KIT陽性和可能陽性腫瘤GIST精原細(xì)胞瘤肥大細(xì)胞瘤黑色素瘤/透明細(xì)胞肉瘤ES/PNETKaposi肉瘤/血管肉瘤孤立性纖維瘤隆突性皮膚纖維肉瘤肌纖維母細(xì)胞瘤/纖維瘤病分化良好脂肪肉瘤轉(zhuǎn)移性小細(xì)胞癌第二十四頁，共79頁。甲磺酸伊馬替尼(imatinibmesylate)商品名:格列衛(wèi)(gleevec)能抑制BCR-ABL酪氨酸激酶及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，2001年FDA批準(zhǔn)用于治療慢粒（CML）；能抑制C-Kit和PEGFR酪氨酸激酶活性，2002年被批準(zhǔn)用于治療C-kit(CD117)或PDGFRa陽性的、不能手術(shù)或轉(zhuǎn)移性胃腸間質(zhì)瘤（GIST）。第二十五頁，共79頁。VEGFR酪氨酸激酶抑制劑第二十六頁，共79頁。VEGFR酪氨酸激酶抑制劑SU668、SU11248、ZD6474、PTK787/ZK222584等小分子化合物口服或腹腔注射抑制VEGFR酪氨酸激酶的活性，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長。第二十七頁，共79頁。其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑法尼基轉(zhuǎn)移酶(farnesyltransferase)，是RAS蛋白活化必不可少的關(guān)鍵酶，抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶活性，可阻斷RAS蛋白在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。臨床試驗(yàn)階段。第二十八頁，共79頁。第二十九頁，共79頁。多靶點(diǎn)酶抑制劑索拉菲尼(sorafenib，商品名Nexavar)：FDA10年來第一次批準(zhǔn)治療腎癌的藥物，還可用于HCC,Melanoma,NSCLC。范得他尼(vandetanib，ZD6474，商品名Zactima):口服，NSCLCSunitinib：口服，治療GIST和晚期腎癌第三十頁，共79頁。2.血管生成抑制劑主要針對(duì)腫瘤血管形成的某些因子及關(guān)鍵步驟進(jìn)行干預(yù)。第三十一頁，共79頁。血管抑素(angiostatin)

內(nèi)皮抑素(endostatin)抑制由堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)誘發(fā)的血管生長，特異性抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，但不直接影響腫瘤細(xì)胞的增生。YH—16（Endostar，恩度)為我國生產(chǎn)的重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液，用于不能手術(shù)的NSCLC。第三十二頁，共79頁。VEGFR酪氨酸激酶抑制劑抑制VEGFR酪氨酸激酶的活性，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長。第三十三頁，共79頁。O-(氯乙酰-氨甲?；?煙曲霉醇(TNP-470)一種煙曲霉菌分泌的煙曲霉素的人工合成類似物，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用強(qiáng)，無明顯毒副作用。第三十四頁，共79頁。金屬蛋白酶抑制劑能與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）活性部位的鋅結(jié)合，抑制血管生成。第三十五頁，共79頁。沙利度胺(thalisdomide)反應(yīng)停抑制bFGF和VEGF介導(dǎo)的血管生成；也可抑制TNF-a合成，阻斷NF-kB激活，下調(diào)細(xì)胞表面粘附分子和減少自由基生成。第三十六頁，共79頁。3.蛋白酶體抑制劑多酶復(fù)合體——蛋白酶體(proteasome)在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期上起作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖。硼替佐米(bortezomib)，2003年FDA批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)性和難治性多發(fā)性骨髓瘤。第三十七頁，共79頁。4.環(huán)氧化酶抑制劑環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)是前列腺素合成過程中的催化酶，包括COX1和COX2。結(jié)腸腺瘤和結(jié)腸癌高表達(dá)COX2，肺癌、乳腺癌、前列腺癌及腦腫瘤也常過表達(dá)COX2。選擇性COX2抑制劑西樂葆(celeoxib)用于治療家族性多發(fā)性腺瘤性息肉(FAP)，可降低結(jié)腸癌的發(fā)生。第三十八頁，共79頁。5.雌激素受體抑制劑他莫西芬(tamoxifen)，能與雌二醇競爭雌激素受體，與胞質(zhì)雌激素受體結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞后不能刺激RNA和蛋白質(zhì)合成，從而抑制依賴雌激素才能生長的腫瘤。用于治療絕經(jīng)后乳腺癌患者的姑息治療和手術(shù)后的輔助治療，也可治療子宮內(nèi)膜樣腺癌。阿那曲唑(anastrozole)，來曲唑(letrozole)和依西美坦(exemestane)等芳香化酶抑制劑，能與內(nèi)源性底物競爭芳香化酶的活性部位，抑制酶的活性，明顯降低雌激素水平，可用于治療絕經(jīng)婦女的晚期乳腺癌。第三十九頁，共79頁。6.其它小分子化合物

(正在臨床試驗(yàn)階段)凋亡誘導(dǎo)劑周期蛋白酶抑制劑端粒酶抑制劑反義核苷酸第四十頁，共79頁。腫瘤靶向治療中

分子靶點(diǎn)的檢測及結(jié)果判讀第四十一頁，共79頁。分子靶點(diǎn)檢測的常用技術(shù)免疫組織化學(xué)(IHC)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)熒光原位雜交(FISH)顯色原位雜交(CISH)DNA測序(DNASequence)第四十二頁，共79頁。1.免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC)檢測腫瘤分子靶點(diǎn)的蛋白產(chǎn)物表達(dá)情況。最常用和最簡便。第四十三頁，共79頁。CD20正常B淋巴細(xì)胞從前體B細(xì)胞到前漿細(xì)胞，絕大多數(shù)B細(xì)胞淋巴瘤均表達(dá)；陽性反應(yīng)定位于細(xì)胞膜上。第四十四頁，共79頁。C-KIT蛋白(CD117)非受體酪氨酸激酶絕大多數(shù)GIST存在C-KIT基因功能獲得性突變，導(dǎo)致該基因不需與配體結(jié)合，即可發(fā)生自磷酸化而激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路CD117的陽性反應(yīng)定位于細(xì)胞膜或和胞漿。第四十五頁，共79頁。HER2蛋白具有受體酪氨酸激酶活性的表皮生長因子受體蛋白，在控制上皮細(xì)胞生長、分化、粘附和活動(dòng)等細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化上起重要作用。曲妥珠單抗能下調(diào)過度表達(dá)HER2蛋白的乳癌癌細(xì)胞表面HER2受體的數(shù)目。1998年FDA批準(zhǔn)了單抗治療前的標(biāo)準(zhǔn)檢測程序檢測對(duì)象為浸潤性乳腺癌陽性反應(yīng)定位于細(xì)胞膜第四十六頁，共79頁。第四十七頁，共79頁。ST.GALLEN2007HER2：乳腺癌危險(xiǎn)因素的新定義RISKG1T≤2ER/PR+淋巴結(jié)-HER2-LVI無淋巴結(jié)1-3和HER2+,ER/PR-或淋巴結(jié)≥4年齡<35歲G2-3T>2淋巴結(jié)-,HER2+,ER/PR-或LVI侵潤淋巴結(jié)1-3且HER2-,ER/PR+低中高RISK第四十八頁，共79頁。2007ASCO/CAPGuidelinesScore0Nostainingisobservedorcellmembranestainingisobservedinlessthan10%ofthetumorcells.Score1+Afaintperceptiblemembranestainingcanbedetectedinmorethan10%ofthetumorcells.Thecellsareonlystainedinpartoftheirmembrane.Score2+Aweaktomoderatecompletemembranestainingisobservedinmorethan10%ofthetumorcells.Score3+Astrongcompletemembranestainingisobservedinmorethan30%ofthetumorcells.JCO,25(1):2007第四十九頁，共79頁。2009版中國乳腺癌HER2指南0：無著色，或<10%浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)弱而不完整著色；1+：>10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)弱或中度強(qiáng)度，且不完整的膜著色；2+：>10%浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)弱或中度強(qiáng)度，且完整的膜著色；或<30%浸潤細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)且完整膜著色；3+：>30%癌細(xì)胞胞膜強(qiáng)染色，連續(xù)，環(huán)繞整個(gè)胞膜。第五十頁，共79頁。0,1+Negative2+equivocal3+Positive(曲妥珠治療指征)第五十一頁，共79頁。第五十二頁，共79頁。EGFR/HER1蛋白位于7p的EGFR基因的蛋白產(chǎn)物，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的上皮細(xì)胞中西妥昔單抗直接作用于EGFR的細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)，阻斷EGF和TGFα等配體與EGFR結(jié)合，從而抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶的活性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長抑制和凋亡2004年FDA批準(zhǔn)西妥昔單抗用于治療EGFR陽性的轉(zhuǎn)移性大腸癌第五十三頁，共79頁。EGFR/HER1蛋白陽性反應(yīng)定位于細(xì)胞膜。反應(yīng)強(qiáng)度分為1+、2+、3+。>1%癌細(xì)胞的胞膜染色超過背景細(xì)胞即為陽性，無論染色是否完整環(huán)繞胞膜。第五十四頁，共79頁。ER、PR蛋白陽性反應(yīng)定位于細(xì)胞核。染色強(qiáng)度及百分比。2010ASCO/CAPguideline>1%Positive,<=1%Negative臨床上，>10%確切的用藥標(biāo)準(zhǔn)，1-10%，需綜合考慮第五十五頁，共79頁。2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測腫瘤分子靶點(diǎn)的mRNA表達(dá)情況。操作簡單，靈敏度高，快速，高通量。儀器昂貴，最好需要標(biāo)準(zhǔn)PCR室。有替代測序應(yīng)用于基因突變檢測，如EGFR,K-ras檢測。第五十六頁，共79頁。2-ΔΔct第五十七頁，共79頁。3.熒光原位雜交技術(shù)(FISH)是一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交。在熒光顯微鏡下，于細(xì)胞和(或)組織原位觀察并分析細(xì)胞核內(nèi)雜交于DNA靶序列的多種彩色探針信號(hào)，以獲得細(xì)胞內(nèi)多條染色體(或染色體片段)或多種基因狀態(tài)的信息。FISH檢測基因擴(kuò)增，準(zhǔn)確性比其它檢測技術(shù)高，可避免由于染色體的多體而呈現(xiàn)的假陽性，金標(biāo)準(zhǔn)。缺點(diǎn)：技術(shù)操作復(fù)雜，試劑及設(shè)備昂貴。第五十八頁，共79頁。樣本預(yù)處理探針、樣本變性探針＋樣本雜交雜交后洗滌結(jié)果觀察原理及實(shí)驗(yàn)操作第五十九頁，共79頁。HER2基因：FISHHER2試劑盒為雙色熒光標(biāo)記探針：HER-2基因，為橘紅色熒光，該基因所在的17號(hào)染色體著絲點(diǎn)為綠色熒光作為內(nèi)對(duì)照，用于判斷HER-2基因的拷貝數(shù)增多是真正擴(kuò)增，還是由于17號(hào)染色體的多體而導(dǎo)致HER2基因拷貝數(shù)相對(duì)增多。O/G>2.2，PostiveO/G<1.8，NegativeO/G1.8-2.2,Equivocal赫賽汀只對(duì)FISH檢測HER2基因陽性者有效第六十頁，共79頁。HER2基因(FISH)第六十一頁，共79頁。EGFR基因：FISH轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的EGFR基因狀態(tài)：EGFR基因拷貝數(shù)增加(擴(kuò)增)的患者對(duì)西妥昔單抗治療有顯著療效，而EGFR基因拷貝數(shù)無增加的患者對(duì)該藥無效。O/G>2.0orO>6PostiveO/G<=2.0，Negative基因擴(kuò)增的有效率約40-50％第六十二頁，共79頁。4.顯色原位雜交技術(shù)(CISH)用堿性磷酸酶標(biāo)記的探針，在甲醛固定、石蠟包埋組織切片上進(jìn)行雜交，再用鼠抗地高辛抗體和辣根過氧化物酶抗鼠抗體進(jìn)行免疫組合，DAB顯色，普通光鏡觀察有無基因擴(kuò)增的異常信號(hào)的技術(shù)。缺乏內(nèi)對(duì)照，無多種顏色信號(hào)，不能完全取代FISH。第六十三頁，共79頁。HER2基因：CISH無擴(kuò)增：大于50%腫瘤細(xì)胞每個(gè)核內(nèi)有1-5個(gè)信號(hào)點(diǎn)；低拷貝擴(kuò)增：大于50%的腫瘤細(xì)胞核內(nèi)有6-10個(gè)信號(hào)點(diǎn)；高拷貝擴(kuò)增：大于50%的腫瘤細(xì)胞核內(nèi)有多于10個(gè)信號(hào)點(diǎn)或者凝結(jié)成團(tuán)塊狀、簇狀信號(hào)顆粒。（若雜交信號(hào)在5-6個(gè)，難以判斷的，應(yīng)經(jīng)FISH重新檢測）第六十四頁，共79頁。CISH檢測無HER2基因擴(kuò)增樣本Adiploid-triploidHER2copynumberisusuallyclear第六十五頁，共79頁。CISH檢測低擴(kuò)增樣本第六十六頁，共79頁。CISH檢測高拷貝擴(kuò)增樣本Genecopyclusters:100%evidenceofgeneamplification第六十七頁，共79頁。c-erbB2IHCvs.FISHc-erbB2scoreGeneamplificationbyFISH04%17%210-35%3>90%第六十八頁，共79頁。ConcordancebetweenFISHandIHCHER-2statusdeterminationusingthe30%criterionFISH-positiveFISH-negativeTotalIHC-positive(3+)1699178IHC-negative(0,1+,2+)12104116Total181113294ConcordanceEstimate95%CIкcoefficient0.8500.787to0.913Sensitivity93.4%89.9%to96.9%Specificity92.0%87.1%to96.9%Overall*92.9%90.0%to95.8%第六十九頁，共79頁。IHC,CISH,FISH符合率IHCCISH（％）FISH（％）GroupI0/1+,n=69無擴(kuò)增，67/69（97）無擴(kuò)增，69/69（100）GroupII3+,n=50擴(kuò)增，47/50（94）擴(kuò)增，46/50（92）GroupIII2+，n=135無擴(kuò)增，89/135；（66）擴(kuò)增，37/135；（27）第七十頁，共79頁。5.DNA測序技術(shù)將組織中DNA提取后行PCR擴(kuò)增，然后用測序分析儀分析有無基因突變、突變位點(diǎn)和突變形式的方法。目前主要用于C-KIT、PDGFRα、K-ras、EGFR、BRAF等突變，為臨床靶向藥物治療和療效判斷提供客觀依據(jù)。第七十一頁，共79頁?；蛐蛄蟹治鯬DGFRA