分子遺傳學(xué)考研復(fù)習(xí)資料

分子遺傳學(xué)考研復(fù)習(xí)資料

武漢大學(xué)分子遺傳學(xué)筆記

第一章緒論

1.1分子遺傳學(xué)的含義

1.不能把分子遺傳學(xué)單純地理解成中心法則的演繹

*分子遺傳學(xué)W中心法則

傳統(tǒng)：分子遺傳學(xué)=中心法則

實際：分子遺傳學(xué)w中心法則，他首先是遺傳學(xué)，其堅實的理論基礎(chǔ)仍然是摩爾

根的《基因論》中心法則只是對基因，性狀及突變在核酸分子水平上的解釋。從

中心法則到性狀的形成仍然是一個復(fù)雜的甚至未知的遺傳，變異與發(fā)育的生物學(xué)

過程。分子遺傳學(xué)不僅盯住DNA/RNA,蛋白質(zhì)，更要研究活細(xì)胞內(nèi)與遺傳便宜有

關(guān)的一切分子事件。

分子遺傳學(xué)W核酸+蛋白質(zhì)

分子遺傳學(xué)研究的對象是分子水平上的生物學(xué)過程-遺傳與變異的過程。它研究

的是動態(tài)的生物學(xué)過程，而不是脫離生物體，在試管里孤立地研究生物大分子的

結(jié)構(gòu)與功能。

1992年，Nature的主編J.Maddox曾著文Ismolecularbiologyyeta

science?指出：”現(xiàn)在有那么一些叫分子生物學(xué)家的人，他們的文章無視全部

的動物，植物，也很少言及他們的生理學(xué)。實驗的大部分資料來自所謂的''凝膠

\，__〃〃分子生物學(xué)在很大程度上變成定性的科學(xué)。如果事情只是簡單的說明

某個基因版本與某種遺傳病相關(guān)，那么，分離這種片段（如電泳），然后測序足

以?！暗?以往的巨大成就表明，生命過程是由嚴(yán)格控制下進行的一些有序事件

組成''他說：”在人們長期為細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象尋找定性的解釋中，他們將會相信細(xì)

胞只不過是一個充滿了分子開關(guān)的袋子，他們作為分子傳動器或開或關(guān)而出現(xiàn)在

預(yù)定的事件序列中。要真正在分子水平上了解遺傳變異的本質(zhì)，僅僅研究核酸或

蛋白質(zhì)的生物化學(xué)是不夠的。分子遺傳學(xué)所研究的應(yīng)該是細(xì)胞中動態(tài)的遺傳變異

過程，以及與其相關(guān)的分子事件。所以不止是中心法則，核酸，蛋白質(zhì)。

2.分子遺傳學(xué)不是核酸及其產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）的生物化學(xué)

分子遺傳學(xué)是分子生物學(xué)的一個分支，或理解為狹義的分子生物學(xué)。他依照物

理，化學(xué)的原理來解釋遺傳現(xiàn)象，并在分子水平上研究遺傳機制及遺傳物質(zhì)對代

謝過程的調(diào)控。因此，分子遺傳學(xué)是在生命信息大分子的結(jié)構(gòu)，功能及相互關(guān)系

的基礎(chǔ)上研究遺傳與變異的科學(xué)。

3.傳統(tǒng)的遺傳學(xué)”主要研究遺傳單元在各世代的分布情況“，分子遺傳學(xué)則著重研

究遺傳信息大分子在生命系統(tǒng)中的儲存，復(fù)制，表達及調(diào)捽過程。研究范疇如下:

DNARNAProtein現(xiàn)象

信息源信息模板工作分子生長、分化、發(fā)育、代謝

1.2分子遺傳學(xué)的產(chǎn)生

1.物理學(xué)的滲透

1945年奧地利物理學(xué)家量子力學(xué)的創(chuàng)始人之一薛定丹（ERWINSCHRMODINGER）

的《生命是什么》一書出版。倡導(dǎo)用物理學(xué)的思想和方法探討生命的秘密。引入

熱力學(xué)第二定律，嫡概念等。他認(rèn)為有機體在不斷地增加他的嫡并趨向最大值的

嫡的危險狀態(tài)，那就是死亡。要擺脫死亡而正常生長發(fā)育，就要從環(huán)境中吸取負(fù)

嫡，負(fù)嫡是一個積極的東西。有機體就是依賴負(fù)嫡為生的。他認(rèn)為生命系統(tǒng)中可

能還包含迄今未知的〃其他的物理學(xué)定律”極大地鼓勵著很多物理學(xué)家轉(zhuǎn)入生物

學(xué)來研究基因的本性。整個40年代，新的物理學(xué)定律并未發(fā)現(xiàn)，但信息論，量

子論，氫鍵等概念把生物學(xué)推向分子水平。

2.微生物學(xué)向遺傳學(xué)的靠攏

1926年摩爾根的《基因論》已經(jīng)問世，但20世紀(jì)30年代，微生物學(xué)家采用拉

馬克的遺傳觀念，因為他們對微生物的遺傳可塑性有很深刻的印象。如在含有致

死藥物的培養(yǎng)基上，可以很容易培育出各種致死藥物有抗性的微生物品系；把不

能利用乳糖的微生物放在乳糖為主要營養(yǎng)的培養(yǎng)基上，可以培育出利用乳糖的新

品種。似乎人們所期望的微生物的任何變異都能通過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)而產(chǎn)生出來，這

使人們?nèi)菀紫嘈排囵B(yǎng)基中的物質(zhì)可以引起微生物遺傳結(jié)構(gòu)的定向變異。

事實并非如此，40年代抗生素的大規(guī)模使用，發(fā)生了病原菌的抗藥性問題。實

驗表明，病原菌的一種抗藥性在沒有該藥存在的情況下隨機地發(fā)生了。說明抗藥

性的產(chǎn)生并不是由于微生物在某種藥物的作用下的后天獲得性遺傳，而是隨機發(fā)

生的自發(fā)突變經(jīng)過藥物的篩選作用，使不具有抗藥性的菌體死亡，使具有抗藥性

的變異菌體大量繁殖起來。于是，拉馬克倒了，人們轉(zhuǎn)向摩爾根的基因突變理論。

3.生化遺傳學(xué)的出現(xiàn)

近代遺傳學(xué)的基礎(chǔ)已經(jīng)穩(wěn)固建立，開始研究基因是怎么發(fā)生作用的問題。生物化

學(xué)家自然把性狀的差別與不同的生化反應(yīng)聯(lián)系起來，把支配性狀的基因與控制生

化反應(yīng)的酶聯(lián)系起來。

1923年英國人加羅德（GARROD）,人類的尿黑酸尿癥是一種隱性遺傳病。當(dāng)這種

純合隱性基因存在時就不能產(chǎn)生尿黑酸酶，使尿黑酸（蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物）不能

最終分解為二氧化碳和水而積累于血液中。表明基因通過酶合成的控制而影響遺

傳性狀的發(fā)育。

4.從生化遺傳學(xué)到分子遺傳學(xué)

基因與酶（蛋白質(zhì)）的對應(yīng)性，使人們想到了基因在遺傳信息上與其產(chǎn)物相關(guān)。

三個重要發(fā)現(xiàn)更促成了生化遺傳學(xué)向分子遺傳學(xué)的轉(zhuǎn)變：

40年代解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題

1928年FGriffith,肺炎球菌

19440TAvery肺炎球菌遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化

50年代確定了分子水平上的遺傳機理問題

1953JWatsonFCrkckDNA分子的雙螺旋模型堿基配對原則

60年代解決了遺傳密碼問題

1955FSanger胰島素氨基酸序列確定

1958FCrick提出中心法則

1967年”遺傳密碼字典”問世

1.3分子遺傳學(xué)的展望

1.基因的概念

-I'J科學(xué)都是以概念為基礎(chǔ)的。

化學(xué)以原子-分子概念為基礎(chǔ)，而遺傳學(xué)則是以基因概念為基礎(chǔ)。

基因概念的演變標(biāo)志著遺傳學(xué)的發(fā)展。

什么是基因？

摩爾根在《基因論》中提出遺傳粒子理論，整個基因論是以粒子性的基因彼此獨

立互不重疊。好象線上的連珠。

分子遺傳學(xué)的發(fā)展證明基因不僅可以重疊，而且可被分隔。

為此，GILBERT1978年提出“基因是轉(zhuǎn)錄單位〃代替了''基因是功能單位〃的概念。

仍然有些不妥，因為有的基因（如啟動子基因或操縱子基因）并不轉(zhuǎn)錄或不完全

轉(zhuǎn)錄，而作為一個單位轉(zhuǎn)錄下來的MRNA也往往不是一個基因。

以前認(rèn)為基因是染色體上成直線排列的獨立單位，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)一些相關(guān)的基因在染

色體上的排列不是雜亂無章的，而是構(gòu)成一個小的“家族”或基因群。

基因及基因型的穩(wěn)定性一直是傳統(tǒng)遺傳學(xué)的重要概念，而1952年MCCLINTOCK

在玉米中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)座子即跳躍基因。30年后的1983年她為此獲得諾貝爾獎金。

基因的概念還將會不斷改進。

2.真核細(xì)胞的基因調(diào)控

原核生物的操縱子模型比較徹底地了解原核生物的基因調(diào)控。但操縱子模型對真

核生物不適用。因為：這一簡單的基因調(diào)控模型無法解釋高等生物體中復(fù)雜性狀

的分化與發(fā)育過程。這種模型的調(diào)控靈敏度MRNA很快地被制造又很快地被消耗

能夠?qū)ν饨绲纳鏃l件作出快速反應(yīng)，而真核生物中MRNA的半衰期很長。

真核生物許多協(xié)同作用的基因是分散在若干不同的染色體上，而原核生物只有一

條染色體。因此真核生物的調(diào)控過程是分子遺傳學(xué)的一項戰(zhàn)略性任務(wù)。

3.遺傳與發(fā)育

遺傳和發(fā)育的研究''分久必合

闡明基因?qū)Πl(fā)育中的個體如何發(fā)生作用？這將會進一步擴大遺傳學(xué)的觀念。

發(fā)育過程中基因通過怎樣的調(diào)控系統(tǒng)參與分化的？這些基因活動形式的發(fā)生與

遺傳的分子機制是什么？隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，或許會出現(xiàn)基因發(fā)育學(xué)。

將來通過遺傳物質(zhì)的分子活動能控制生物的發(fā)育分化嗎？能否控制生男生女，體

質(zhì)和容貌嗎？能否消滅遺傳病，癌癥？

1997年〃克隆羊”（Dolly）的誕生，由分化的體細(xì)胞發(fā)育出來的后代。

4.自我組合過程

生物的遺傳與發(fā)育過程就是一個自我組合過程。將T4的各個部件混于溶液中，

它們將會自動地裝配成完整的T4。'

5.遺傳工程

遺傳工程是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)，微生物遺傳學(xué)的手段來改

造或重組生物遺傳特性的一門新技術(shù)。主要指基因重組技術(shù)。

遺傳工程在實際應(yīng)用上有著巨大潛力。DNA擴增技術(shù)大量地生產(chǎn)細(xì)胞中產(chǎn)量極微

而又具有極大應(yīng)用價值的基因產(chǎn)物如胰島素，生長激素，干擾素等。

基因的重組與轉(zhuǎn)化主要以大腸桿菌，酵母以及培養(yǎng)細(xì)胞為受體，而遺傳工程的…

個引人注目的發(fā)展是試圖在整體動物或植物之間進行基因轉(zhuǎn)移，真正改造生物的

遺傳性狀或治療人類的遺傳疾病。超級小鼠的問世。

真核生物的基因組極其龐大。在整體情況下研究某一基因，常因條件錯綜復(fù)雜而

難以分析。重組DNA技術(shù)使我們可以把需要的基因分離出來，對其進行重組和改

造，或把他放回嚴(yán)格控制的細(xì)胞中去研究基因的結(jié)構(gòu)和功能，或獲取理想的蛋白

質(zhì)產(chǎn)品。

近年來的蛋白質(zhì)工程，應(yīng)用基因重組技術(shù)去改造蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，修改蛋白質(zhì)的

DNA編碼，創(chuàng)造出新的蛋白質(zhì)。'

6.基因組計劃

人類基因組計劃（humangenomeprojectHGP）在全世界以深為人知，這應(yīng)該

是當(dāng)今生命科學(xué)中最重大而熱門的課題。人類基因組計劃的最主要的目的是解讀

人類基因組的正常結(jié)構(gòu)，功能，及基因的異常與人類疾病。并由此會帶來巨大

的經(jīng)濟效益。

這項計劃是從1987年主要在美國以全基因組DNA測序為目標(biāo)開始進行的（1990

年正式啟動）。已耗資300億美元并將接近完成

1.3分子遺傳學(xué)的展望

1.基因的概念

一門科學(xué)都是以概念為基礎(chǔ)的。

化學(xué)以原子-分子概念為基礎(chǔ)，而遺傳學(xué)則是以基因概念為基礎(chǔ)。

基因概念的演變標(biāo)志著遺傳學(xué)的發(fā)展。

什么是基因？

摩爾根在《基因論》中提出遺傳粒子理論，整個基因論是以粒子性的基因彼此獨

立互不重疊。好象線上的連珠。

分子遺傳學(xué)的發(fā)展證明基因不僅可以重疊，而且可被分隔。

為此，GILBERT1978年提出“基因是轉(zhuǎn)錄單位〃代替了''基因是功能單位〃的概念。

仍然有些不妥，因為有的基因（如啟動子基因或操縱子基因）并不轉(zhuǎn)錄或不完全

轉(zhuǎn)錄，而作為一個單位轉(zhuǎn)錄下來的MRNA也往往不是一個基因。

以前認(rèn)為基因是染色體上成直線排列的獨立單位，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)一些相關(guān)的基因在染

色體上的排列不是雜亂無章的，而是構(gòu)成一個小的“家族”或基因群。

基因及基因型的穩(wěn)定性一直是傳統(tǒng)遺傳學(xué)的重要概念，而1952年MCCLINTOCK

在玉米中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)座子即跳躍基因。30年后的1983年她為此獲得諾貝爾獎金。

基因的概念還將會不斷改進。

2.真核細(xì)胞的基因調(diào)控

原核生物的操縱子模型比較徹底地了解原核生物的基因調(diào)控。但操縱子模型對真

核生物不適用。因為：這一簡單的基因調(diào)控模型無法解釋高等生物體中復(fù)雜性狀

的分化與發(fā)育過程。這種模型的調(diào)控靈敏度MRNA很快地被制造又很快地被消耗

能夠?qū)ν饨绲纳鏃l件作出快速反應(yīng)，而真核生物中MRNA的半衰期很長。

真核生物許多協(xié)同作用的基因是分散在若干不同的染色體上，而原核生物只有一

條染色體。因此真核生物的調(diào)控過程是分子遺傳學(xué)的一項戰(zhàn)略性任務(wù)。

3.遺傳與發(fā)育

遺傳和發(fā)育的研究"分久必合”。

闡明基因?qū)Πl(fā)育中的個體如何發(fā)生作用？這將會進一步擴大遺傳學(xué)的觀念。

發(fā)育過程中基因通過怎樣的調(diào)控系統(tǒng)參與分化的？這些基因活動形式的發(fā)生與

遺傳的分子機制是什么？隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，或許會出現(xiàn)基因發(fā)育學(xué)。

將來通過遺傳物質(zhì)的分子活動能控制生物的發(fā)育分化嗎？能否控制生男生女，體

質(zhì)和容貌嗎？能否消滅遺傳病，癌癥？

1997年〃克隆羊“（Dolly）的誕生，由分化的體細(xì)胞發(fā)育出來的后代。

4.自我組合過程

生物的遺傳與發(fā)育過程就是一個自我組合過程。將T4的各個部件混于溶液中，

它們將會自動地裝配成完整的T4。'

5.遺傳工程

遺傳工程是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)，微生物遺傳學(xué)的手段來改

造或重組生物遺傳特性的一門新技術(shù)。主要指基因重組技術(shù)。

遺傳工程在實際應(yīng)用上有著巨大潛力。DNA擴增技術(shù)大量地生產(chǎn)細(xì)胞中產(chǎn)量極微

而又具有極大應(yīng)用價值的基因產(chǎn)物如胰島素，生長激素，干擾素等。

基因的重組與轉(zhuǎn)化主要以大腸桿菌，酵母以及培養(yǎng)細(xì)胞為受體，而遺傳工程的…

個引人注目的發(fā)展是試圖在整體動物或植物之間進行基因轉(zhuǎn)移，真正改造生物的

遺傳性狀或治療人類的遺傳疾病。超級小鼠的問世。

真核生物的基因組極其龐大。在整體情況下研究某一基因，常因條件錯綜復(fù)雜而

難以分析。重組DNA技術(shù)使我們可以把需要的基因分離出來，對其進行重組和改

造，或把他放回嚴(yán)格控制的細(xì)胞中去研究基因的結(jié)構(gòu)和功能，或獲取理想的蛋白

質(zhì)產(chǎn)品。

近年來的蛋白質(zhì)工程，應(yīng)用基因重組技術(shù)去改造蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，修改蛋白質(zhì)的

DNA編碼，創(chuàng)造出新的蛋白質(zhì)。'

6.基因組計劃

人類基因組計劃(humangenomeprojectHGP)在全世界以深為人知，這應(yīng)該

是當(dāng)今生命科學(xué)中最重大而熱門的課題。人類基因組計劃的最主要的目的是解讀

人類基因組的正常結(jié)構(gòu)，功能，及基因的異常與人類疾病。并由此會帶來巨大

的經(jīng)濟效益。

這項計劃是從1987年主要在美國以全基因組DNA測序為目標(biāo)開始進行的(1990

年正式啟動)。已耗資300億美元并將接近完成

第二章遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)——DNA的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

2.1核酸是遺傳物質(zhì)

遺傳物質(zhì)這種特殊的分子必須具備以下基本特點：

1.穩(wěn)定地含有關(guān)于有機體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，功能，發(fā)育和繁殖的各種信息

2.能精確地復(fù)制，這樣后代細(xì)胞才能具有和親代細(xì)胞相同的信息

3.能夠變異，通過突變和重組生物才能發(fā)生改變，適應(yīng)和進化

遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)

1928年英國FGriffith的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗導(dǎo)致了遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)。十年后0

Avery的體外轉(zhuǎn)化實驗弄清了這種轉(zhuǎn)化因子的化學(xué)本質(zhì)是DNA,而不是蛋白質(zhì)或

其他的大分子。

1952年Hershey-Chase的實驗使遺傳物質(zhì)的結(jié)論得到了進一步的證實，而于

1969年獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎。

RNA也是遺傳物質(zhì)：如煙草花葉病毒的遺傳物質(zhì)是RNAO

2.2DNA攜帶兩類不同的遺傳信息

DNA幾乎是所有生物的遺傳信息的攜帶者，除開少數(shù)RNA病毒之外。

DNA攜帶著兩類不同的遺傳信息：

一類是負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的氨基酸組成的信.息，以三聯(lián)體密碼子進行編碼

另一類遺傳信息是關(guān)于基因選擇性表達的信息

2.3DNA和RNA的化學(xué)組成及雙螺旋模型

1.DNA和RNA的化學(xué)組成

核酸包括DNA和RNAo經(jīng)水解成單核昔酸(nucleotides),單核甘酸由磷酸基團

(phosphategroup)和核昔(nucleotide)組成，核甘含有戊糖(pentose)和

堿基(base)。DNA中戊糖是D-脫氧核糖，堿基是ATGC；而RNA中戊糖是D-核糖。

堿基是AUGC。

2.DNA雙螺旋模型的誕生

美國JDWatson在芝加哥大學(xué)讀本科時對鳥類趕興趣，到了高年級時，他想了

解基因是什么。1949年他帶著這種想法進入了劍橋大學(xué)卡文迪實驗室醫(yī)學(xué)研究

組，與物理出生的青年學(xué)者FCrick合作，決定研究DNA的分子結(jié)構(gòu)。Crick在

1946年讀了薛定譚(ESchrodinger)的名著(生命是什么)后，舍棄物理學(xué)轉(zhuǎn)

向生命科學(xué)領(lǐng)域。剛到劍橋大學(xué)時Watson由于自己的化學(xué)與物理學(xué)基礎(chǔ)較差而

擔(dān)心聽不懂RFranklin所做的關(guān)于DNAX-衍射的研究學(xué)術(shù)報告，而兩年后(1953

年)他與Crick卻建立了DNA分子的雙螺旋模型，論文雖然很短，卻是劃時代的

發(fā)現(xiàn)?？梢哉f是孟德爾定律之后，在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中最偉大的發(fā)現(xiàn)。

因此，人們將這一發(fā)現(xiàn)看成是分子遺傳學(xué)的起點。沒有雙螺旋就沒有現(xiàn)在的基因

工程，就沒有分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展。這一?模型是生物學(xué)與物理學(xué)，結(jié)構(gòu)化學(xué)交

叉融合的結(jié)果。

盡管FRANKLIN和WILKINS在DNA的X衍射研究方面非常突出，但卻未能提出DNA

的結(jié)構(gòu)模型，就因為他們?nèi)狈ι锘瘜W(xué)方面的知識。但沒有他們的工作，WATSON

和CRICK建立的模型也不能及時得到驗證。1951年WATS0NG去英國進修生物化

學(xué)。

雙螺旋的建立是建立在前人科研成果的基礎(chǔ)上的主要是四個影響：

a.WTAstury和BellX衍射技術(shù)研究DNA。1947年拍攝了第一張DNA的衍射照

片。

b.1951年P(guān)auling和Corey在美國科學(xué)院報上連載了7篇有關(guān)a-螺旋結(jié)構(gòu)的文

章轟動了全世界，引起了Watson和劍橋科學(xué)家們的注意。

c.美國晶體學(xué)者JDonohue的指正和Chargaff的當(dāng)量規(guī)律都幫助

Watson-Crick糾正了

起初A-AG-GC-CT-T的同類配對的錯誤想法。而提出堿基互補的正確構(gòu)型。

d.RFranklin和Wilkins在1952年底拍得了一張十分清晰的DNA結(jié)晶X衍射

照片。為雙螺旋結(jié)構(gòu)模型提供了強有力的依據(jù)和佐證。他們把數(shù)據(jù)整理好后與

“DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)”一文同時發(fā)表，因此JKWatson,Crick,Wilkins分享了

1962年的諾貝爾獎，可惜的是FRANKLIN1958年就英年早世未能享受這一最高

榮譽。

3.雙螺旋模型的特點

DNA雙螺旋模型有以下特點：

a.DNA分子由兩條反向平行的多核甘酸鏈組成，形成右手雙螺旋，即從一端看過

去，是以順時針方向旋轉(zhuǎn)。

b.雙螺旋的直徑是2nm；螺距為3。4nm,上下相連的堿基的垂直距離為0。34nm,

交角為36度，每個螺旋有10個堿基對。

c.兩條鏈反向平行即兩條鏈的5\'和3V的方向相反。

d.糖-磷酸鍵是在雙螺旋的外側(cè)，兩條鏈上的堿基通過氫鍵形成堿基對，使兩條

鏈在一起。

e.糖與附著在糖上的堿基近于垂直。

f.堿基配對為嗯吟對口密咤。

g.DNA雙螺旋有大溝(majororwidegroove)和小溝(minorornarrowgroove)

的存在

2.4DNA的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

l.DNA的-一級結(jié)構(gòu)

DNA結(jié)構(gòu)是由脫氧核糖核酸通過3\'5V磷酸二酯鍵連接而成的高聚物。DNA的

一?級結(jié)構(gòu)是指核甘酸在DNA分子中的排列順序。

DNA的一級結(jié)構(gòu)的測序工作進展很快。1975年Sanger提出新的測序策略。

酶法：Sanger加減法一＞末端終止法(雙脫氧法)

化學(xué)方法：MaxamGilbert化學(xué)斷裂法(硫酸二甲酯，腓)'

2.DNA的二級結(jié)構(gòu)

雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的特點(見上一節(jié))

DNA雙螺旋的種類(DNA二級結(jié)構(gòu)多形性)：1953年WatsonandCrick提出的DNA

右手雙螺旋模型屬于B型雙螺旋。除B型構(gòu)象外，還存在有A,C,D,E等構(gòu)象

的右手雙螺旋構(gòu)象以及Z構(gòu)象左手雙螺旋。

B-DNA與Z-DNA

DNA類型每一螺旋的堿基對數(shù)每對螺旋的堿基對數(shù)堿基對間的距離(nm)螺

旋直徑(nm)

B10右旋36度0.338

1.9-2.0

Z12左旋30度0.371

1.8

Z-DNA與染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能的關(guān)系

a.與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)系

SV40基因組中三個潛在的Z-DNA區(qū)段處于不能形成核小體的區(qū)域，說明Z-DNA

構(gòu)象與核小體結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)

b.與基因活性的關(guān)系

與基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控有關(guān)

Z-構(gòu)象的研究意義：1979年AHJWANG發(fā)現(xiàn)六聚體D(CpGpCpGpCpGp)

決定雙螺旋結(jié)構(gòu)狀態(tài)的因素(維系該結(jié)構(gòu)的力)

氫鍵

堿基堆集力

帶負(fù)電荷的磷酸基的靜電斥力

堿基分子內(nèi)能

3.DNA物理結(jié)構(gòu)的不均一性

反向重復(fù)序列（invertedrepeats）：又稱回文結(jié)構(gòu)Palindrome（圖示）

富含A/T的序列

喋吟和喀喔的排列順序?qū)﹄p螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響（圖表）

4.DNA的變性，復(fù)性，雜交，Cot曲線

1）變性

變性的方法，測量變性的方法：光吸收法，增色效應(yīng)

2）復(fù)性

復(fù)性條件，復(fù)性機制

3）雜交

雜交原理及程序圖示

4）Cot曲線

DNA復(fù)性的二級方程

5.DNA超螺旋和拓?fù)洚悩?gòu)現(xiàn)象（略）

6.常見的DNA分子形式及其相互關(guān)系（略）

2.4DNA的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

1.DNA的一級結(jié)構(gòu)

DNA結(jié)構(gòu)是由脫氧核糖核酸通過3\'5V磷酸二酯鍵連接而成的高聚物。DNA的

?級結(jié)構(gòu)是指核甘酸在DNA分子中的排列順序。

DNA的一級結(jié)構(gòu)的測序工作進展很快。1975年Sanger提出新的測序策略。

酶法：Sanger加減法一＞末端終止法（雙脫氧法）

化學(xué)方法：MaxamGilbert化學(xué)斷裂法（硫酸二甲酯，胱）'

2.DNA的二級結(jié)構(gòu)

雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的特點（見上一節(jié)）

DNA雙螺旋的種類（DNA二級結(jié)構(gòu)多形性）：1953年WatsonandCrick提出的DNA

右手雙螺旋模型屬于B型雙螺旋。除B型構(gòu)象外，還存在有A,C,D,E等構(gòu)象

的右手雙螺旋構(gòu)象以及Z構(gòu)象左手雙螺旋。

B-DNA與Z-DNA

DNA類型每一螺旋的堿基對數(shù)每對螺旋的堿基對數(shù)堿基對間的距離（nm）螺

旋直徑（nm）

B10右旋36度0.338

1.9-2.0

Z12左旋30度0.371

1.8

Z-DNA與染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能的關(guān)系

a.與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)系

SV40基因組中三個潛在的Z-DNA區(qū)段處于不能形成核小體的區(qū)域，說明Z-DNA

構(gòu)象與核小體結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)

b.與基因活性的關(guān)系

與基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控有關(guān)

Z-構(gòu)象的研究意義：1979年AHJWANG發(fā)現(xiàn)六聚體D（CpGpCpGpCpGp）

決定雙螺旋結(jié)構(gòu)狀態(tài)的因素（維系該結(jié)構(gòu)的力）

氫鍵

堿基堆集力

帶負(fù)電荷的磷酸基的靜電斥力

堿基分子內(nèi)能

3.DNA物理結(jié)構(gòu)的不均一性

反向重復(fù)序列（invertedrepeats）：又稱回文結(jié)構(gòu)Palindrome（圖示）

富含A/T的序列

噂吟和口密咤的排列順序?qū)﹄p螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響（圖表）

4.DNA的變性，復(fù)性，雜交，Cot曲線

1）變性

變性的方法，測量變性的方法：光吸收法，增色效應(yīng)

2）復(fù)性

復(fù)性條件，復(fù)性機制

3）雜交

雜交原理及程序圖示

4）Cot曲線

DNA復(fù)性的二級方程

5.DNA超螺旋和拓?fù)洚悩?gòu)現(xiàn)象（略）

6.常見的DNA分子形式及其相互關(guān)系（略）

3.2真核生物C值矛盾

同一物種的基因組DNA含量總是恒定的，一個單倍體基因組中的全部DNA量稱為

該物

種的C值。

不同物種的C值也不同。最小的支原體為104bp,而最大的兩棲類或某些顯花植

物可

達lOllbp。后者比人類高出幾十倍，這無法讓人理解，這種形態(tài)學(xué)復(fù)雜程度與C

值大小不一致的C值反常現(xiàn)象稱為C值矛盾。

有待回答的兒個問題：

位于基因內(nèi)DNA成分（包括轉(zhuǎn)錄而不翻譯的區(qū)域，如內(nèi)含子以及編碼序列的兩翼

序列）究竟占基因組的多大比例？這些基因中有多少是必需基因？多少是非必需

基因？非基因DNA成分的功能是什么？基因組DNAC值的巨大差異對基因組的

活動和功能究竟有什么影響

3.3原核生物染色體及其基因

原核生物和真核生物比較

第二節(jié)基因組大小與C值矛盾

第三節(jié)原核生物染色體及其基因

第四節(jié)真核生物的染色體

第五節(jié)真核生物的基因

第六節(jié)基因定位

第七節(jié)基因的分子進化

第八節(jié)早期生命進化的三界系統(tǒng)理論

3.5真核生物的基因

1.真核生物基因組的一般特點

真核生物的基因組一般比較龐大，遠大于原核生物的基因組。

真核生物的DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，儲存于細(xì)胞核內(nèi)。

真核基因組存在著許多重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可達兒百萬以上。

絕大多數(shù)真核生物編碼蛋白質(zhì)的基因為斷裂基因，即結(jié)構(gòu)基因是不連續(xù)排列

的，中

間由插入序列隔開。

真核生物基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼區(qū)域。

真核生物不僅含有核內(nèi)染色體DNA,還有核外細(xì)胞器DNA、核外細(xì)胞器有線

立體DNA和葉綠體DNAo

2.斷裂基因（不連續(xù)基因）interruptedordiscontinuousgenes

SV40A蛋白基因含有一段346NT的間隔區(qū)。

每個活性珠蛋白基因含有兩個間隔區(qū)。

卵清蛋白基因含有7個插入序列被分成八段。

3.基因家族與基因簇genefamily&genecluster

定義：真核生物基因組中許多來源相同，結(jié)構(gòu)相似，功能相關(guān)的基因在染色

體上成

串存在，這樣的一組基因稱為基因家族。多基因家族是真核生物基因組織的一個

重要特征。

多基因家族在基因組中的分布情況不同，有些基因成串排列集中在一條染色

體上，

集中成簇的一組基因形成基因簇。也稱串聯(lián)重復(fù)基因（見后）。如組蛋白基因，

rRNA基因，tRNA基因等。而有些基因家族成員不集中排列，而是分散在基因組

的不同部位。如干擾素，珠蛋白，生長激素，SOX基因家族。

在多基因家族中，有些成員不具有任何功能，這類基因叫假基因

（pseudogene）。

4.串聯(lián)重復(fù)基因'

特征：

A.各成員間有高度的序列一致性或完全相同。

B.拷貝數(shù)高，兒十個至兒百個。因其在細(xì)胞中的需要量很大。

C.非轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)短而一致。

組蛋白基因

五種組蛋白基因彼此靠近構(gòu)成一個重復(fù)單位。許多這樣的重復(fù)單位串聯(lián)在一

起，構(gòu)

成組蛋白基因簇。

rRNA基因

原核生物有三種rRNA：5S,16S,23S

真核生物有四種rRNA：5.8S,18S,28S,5S

主體rRNA：三種主體rRNA基因組成重復(fù)單位，轉(zhuǎn)錄出一個45SrRNA,經(jīng)轉(zhuǎn)

錄后處理切除間隔區(qū)成為18S,5.8S,28S三種rRNA。

核仁：核中rRNA基因大量地轉(zhuǎn)錄成RNA,由于其染色性質(zhì)與DNA不同，在

光學(xué)顯微鏡下形成特殊的區(qū)域，這一結(jié)構(gòu)，稱為核仁（nucleole）。含有rDNA

串聯(lián)重復(fù)單位的染色體稱為核仁組織者（nucleoolarorganizers）0

tRNA基因

tRNA長約70-80bp,其基因約長140bPoTRNA也是串聯(lián)重復(fù)排列，但個重復(fù)

單位中各個tRNA基因可以相同可以不相同。

5.細(xì)胞器基因

真核生物細(xì)胞器中有兩類細(xì)胞器能夠攜帶遺傳物質(zhì)。

動物生殖細(xì)胞中只有卵子才有線立體基因，而精子缺乏。線立體DNA多為環(huán)

狀非重復(fù)DNA序列。屬于核外DNA。

線粒體和葉綠體均編碼自身所需的某些蛋白質(zhì)以及tRNA和rRNA,其余均由

核基因編碼。

細(xì)胞器有自己的蛋白質(zhì)合成器。只有兩種rRNA。哺乳為12s和16S,酵母為

18S和21s（含有一內(nèi)含子）。tRNA比核內(nèi)編碼的tRNA小。酵母DNA為84kb。

其上面的基因有三個特點。

哺乳動物線立體DNA不同于酵母。人體線立體基因排列非常緊密。人類線立

體DNA為16.569kb。含37個基因；13個蛋白質(zhì)基因；1個cytb基因；2個ATP

酶亞基基因；3個CO亞基基因(細(xì)胞色素氧化酶亞基)；7個NADH脫氫酶亞基基

因；2個rRNA基因：12SrRNA、16SrRNA；22個tRNA基因

3.4真核生物的染色體

真核生物DNA復(fù)性動力學(xué)

真核生物染色體上的單一序列和重復(fù)序列以及衛(wèi)星DNA

單一序列又稱非重復(fù)序列

輕度重復(fù)序列

中度重復(fù)序列

高度重復(fù)序列

衛(wèi)星DNA的等級結(jié)構(gòu)及其起源和進化

染色質(zhì)和核小體

染色質(zhì)chromatin

核小體nucleosome

著絲粒centromere

端粒telomere

第四章DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與翻譯

4.1DNA復(fù)制

DNA的半保留復(fù)制

Watson&Crick最早提出DNA的半保留復(fù)制機制。即是：DNA分子的雙螺旋在復(fù)

制時分開，各自作為新鏈合成時的模板，復(fù)制后，每一個新的雙鏈DNA分子都

是由一條親鏈和一條新合成的子鏈組成的。合成過程中親鏈和子鏈間嚴(yán)格的堿基

配對是DNA復(fù)制的基礎(chǔ)。

圖示DNA復(fù)制(Meselson-Stahl實驗Cscl超離心顯示不同比重DNA帶)

復(fù)制原點，方向和方式或DNA復(fù)制是從特定的位點開始并按特定的方向進行

實驗證明，DNA分子復(fù)制時不是隨機起始的，而是從特定的位點開始的，這一特

定的位點叫做復(fù)制起始點或復(fù)制原點，常用。ri或。表示。

許多生物的復(fù)制點都是DNA呼吸作用強烈的區(qū)段，即是經(jīng)常開放的區(qū)段

(frequentlyopeningregion)亦即富含A,T的區(qū)段。這?,區(qū)段產(chǎn)生瞬時單

鏈與SSB蛋白(single-strandedDNAbindingprotein)結(jié)合，對復(fù)制的起始

十分重要。復(fù)制從特定的位置開始，大多數(shù)雙向進行，也有一些單向的或以不對

稱的雙向方式進行。

在復(fù)制原點雙鏈DNA解旋形成復(fù)制叉。在復(fù)制叉處，新合成的子鏈DNA以各自的

親鏈為模板，總是從5\'-3\'方向合成。復(fù)制叉是不對稱的，即兩條新合成的鏈

中，一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成，叫前導(dǎo)鏈(leadingstrand),另一條鏈?zhǔn)窃谀０錎NA

指導(dǎo)下，通過一個叫DNA引發(fā)酶的蛋白質(zhì)，在特定的間隔區(qū)先合成大約10個NT

的RNA引物為DNA聚合酶提供3'―OH,然后合成一個稱之為岡崎片段的不連

續(xù)的DNA片段，再經(jīng)專門的DNA修復(fù)系統(tǒng)，去除RNA引物，再經(jīng)DNA連接酶通過

磷酸二酯鍵將其連起來，完成該子鏈的合成，這一條鏈叫后隨鏈(lagging

strand)

。依據(jù)DNA合成的起始方式，復(fù)制分為兩種類型：復(fù)制叉式(包括復(fù)制)和滾環(huán)

式復(fù)制又叫復(fù)制。

三.DNA復(fù)制的酶學(xué)

是一個復(fù)雜的酶學(xué)過程，需要30多種酶而后蛋白質(zhì)的參與，構(gòu)成復(fù)制體

(replisome)

1.DNA聚合酶及其聚合反應(yīng)

DNAPOL是指以脫氧核甘三磷酸為底物催化合成DNA的一類酶，其催化反應(yīng)為：

DNApol.DNA-0H》DNA-(pdN)n+nppidNTPMg2+

這一原理被應(yīng)用于現(xiàn)代技術(shù)中如PCR中的Tag酶作用機理。

所有真核生物和原核生物都有兒種DNA聚合酶，這些聚合酶協(xié)同作用負(fù)責(zé)染色體

DNA的復(fù)制，DNA分子的修復(fù)，核DNA的重組以及染色體外DNA的復(fù)制。

原核生物有三種DNA聚合酶，即PolI,PolII,PolIII,PolHI是DNA復(fù)

制的主酶。

真核生物有五種DNA聚合酶，即，，，，。，，是復(fù)制主酶，是核DNA復(fù)制的重要酶。

2.脫氧核甘三磷酸前體的來源

有兩個來源：廢物利用——體內(nèi)核酸降解或直接來自培養(yǎng)基

新合成途徑——利用生物體的氨基酸，C02,NH3和磷酸核糖焦磷酸合成核

糖核甘單磷酸(NMP)

核甘單磷酸激酶

NMP+ATPNDP+ADP

核糖核甘酸還原酶

NDPdNDP

脫掉核糖2'上的氧

核甘二磷酸激酶

dNDP+ATPdNTP+ADP(dNTP：四種脫氧核糖核甘酸)

所有生物的核酸鏈的合成都是按5'——》3'方向進行的，無一例外。

3.三種DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能

4.DNA連接酶

DNAPol雖能填充缺口，但不能使缺口接合，而連接酶則能完成接合任務(wù)。

5.與DNA幾何性質(zhì)有關(guān)的酶

螺旋酶(helicases)又稱解旋酶，使雙鏈DNA分離：

C.螺旋酶I,H,與產(chǎn)物單鏈DNA結(jié)合

F.螺旋酶IH,催化雙鏈DNA分離，與SSDNA結(jié)合蛋白質(zhì)配合。

DNA旋轉(zhuǎn)酶（Eco拓?fù)洚悩?gòu)酶H）

多數(shù)天然DNA具有負(fù)超螺旋，可變?yōu)榕轄顔捂溞问?，利于蛋白質(zhì)結(jié)合，并可緩解

復(fù)制又前移造成的抄纏現(xiàn)象，但當(dāng)5%的環(huán)行DNA雙鏈已經(jīng)復(fù)制時，原有的負(fù)超

螺旋已被用盡，若復(fù)制叉再前移，就產(chǎn)生拓?fù)鋵W(xué)問題，就需要拓?fù)洚悩?gòu)酶來解決。

在Ecoli中，主要是DNA旋轉(zhuǎn)酶（Eco拓?fù)洚悩?gòu)酶H）,他能產(chǎn)生負(fù)超螺旋并消

除復(fù)制叉前移產(chǎn)生的正超螺旋。

所以，如果加入兒種DNA螺旋酶的抑制劑，如香豆霉素，新生霉素，蔡咤酮酸等

均能抑制細(xì)菌DNA的復(fù)制，P94圖示復(fù)制叉前移的拓?fù)鋵W(xué)問題。

DNA復(fù)制的半不連續(xù)性

1.半不連續(xù)性復(fù)制的發(fā)現(xiàn)

2.引物和引發(fā)酶

DNA復(fù)制過程中，復(fù)制叉是不對稱的。兩條新合成的鏈中，一條是連續(xù)合成的，

叫前導(dǎo)鏈

;另一條是在模板DNA指導(dǎo)下，通過一種叫DNA引發(fā)酶的蛋白質(zhì)，在特定的間隔

區(qū)先合成大約10個核甘酸組成的RNA引物（RNAprimer）為DNA聚合酶提供3'

-0H,然后合成稱為岡崎片段的不連續(xù)的DNA片段，最后由DNA修復(fù)系統(tǒng)去除RNA

引物而代之以DNA,再由DNA連接酶通過3'5'-磷酸二酯鍵將其連接起來，完

成此子鏈的合成，這條子鏈叫后隨鏈。

由于DNA聚合酶在沒有引物情況下不能從頭合成DNA,必須有一條引物。研究發(fā)

現(xiàn)的引物大多數(shù)為一段RNA,長度和序列隨基因組的種類而異，為1-10個核昔

酸見表3P98o

該引物RNA與經(jīng)典的RNA（mRNA）不同，，他們合成后不與模板分離，而是以氫

鍵與模板結(jié)合。他可能由一種獨特的RNA聚合酶所合成，這種合成RNA引物的酶

舊叫引發(fā)酶。那么，前導(dǎo)鏈?zhǔn)侨绾魏铣傻?？三種可能性：1）同后隨鏈一樣，由

RNA引物提供3'-0H；

2）可能模板上的起始點產(chǎn)生缺口，暴露3,-0H作引物；3）可能由后隨鏈提供

3'-0H。

3.前體片段的連接

真核生物的DNA復(fù)制

1真核生物的復(fù)制原點，復(fù)制元和復(fù)制元族

真核生物的DNA聚合酶活性比大腸桿菌低得多，復(fù)制速度為500bp-5000bp/分

（Ecoli為105bp/分）如按哺乳動物的DNA比細(xì)菌大約50倍，真核生物DNA復(fù)

制時間就會是大腸桿菌的1000倍?，即約一個月，而事實上，真核生物DNA復(fù)制

時間一般為幾小時，這是因為通過從許多原點同時開始并雙向復(fù)制而實現(xiàn)的。放

射形自顯影可見許多的復(fù)制泡。每一復(fù)制泡有固定的一點（復(fù)制原點），然后雙

向伸展，與相鄱的復(fù)制泡會合。這樣一-段DNA稱為復(fù)制單元，簡稱復(fù)制元

（replicon）o而幾個復(fù)制元可組成復(fù)制元族，同一族內(nèi)的復(fù)制元基本同步。

真核生物復(fù)制原點的DNA序列并無固定的模式，但大多包含一個富含AT的序列,

可能還有一個特異性蛋白質(zhì)的結(jié)合位點。

2真核生物的DNApol和引發(fā)酶primase

與真核生物多起點復(fù)制相適應(yīng)的是，細(xì)胞中DNA聚合酶的分子數(shù)目多，在Ecoli

中，P0LIH只有10-20個分子，而哺乳動物細(xì)胞中DNAPOL有2000-60000個分

子，DNAPOL與DNA引發(fā)酶結(jié)合很緊，是復(fù)制體系必需的復(fù)合物。

實驗表明，在細(xì)胞DNA合成期（S期），DNAPOL含量劇增。協(xié)同的作用，負(fù)責(zé)

線立體DNA的復(fù)制，含量變化不大，與損傷DNA修復(fù)有關(guān)。

引發(fā)酶的作用：

B.是與引發(fā)酶復(fù)合物所必需的

E.其引物合成方式特別，陣發(fā)性合成，

F.可利用rNTP和dNTP為合成前體。

引物一般為6T5個NT。

1SV40以及其他真核生物的DNA復(fù)制過程

SV40所編碼的蛋白質(zhì)中，只有一個大T抗原參與其DNA復(fù)制，其余復(fù)制機制由

寄主的蛋白質(zhì)構(gòu)成。大T抗原四聚體在復(fù)制原點有三個結(jié)合位點，同時還具有

ATPase活性和螺旋酶活性。

SV40的DNA復(fù)制有可能代表真核生物的DNA復(fù)制的主要過程：首先由一特異的

蛋白質(zhì)識別復(fù)制原點并與之結(jié)合。——》再由螺旋酶促進負(fù)超螺旋狀的復(fù)制原點

解鏈——》單鏈DNA結(jié)合蛋白質(zhì)（SSB）維持解鏈區(qū)并以動態(tài)左右前移——》在

由P0L和引發(fā)酶與原點上的特異蛋白質(zhì)相互作用，從而引發(fā)復(fù)制又的先導(dǎo)鏈的

合成；然后再印發(fā)另一先導(dǎo)鏈的合成——》隨著復(fù)制叉的前進，需要拓?fù)洚悩?gòu)酶

解除復(fù)制又前進造成的超纏現(xiàn)象。當(dāng)相鄱的兩個復(fù)制元的相向的兩個復(fù)制又結(jié)合

時就完成了這一段DNA的復(fù)制，可能并不存在固定的終止序列。而真核生物染色

體末端DNA的復(fù)制卻不那么簡單。見后。

2真核生物染色體末端DNA的復(fù)制

由于RNA引物的水解，兩個子代分子中各有一個5'端缺少一段核甘酸，而沒有

一個目前已知的DNAPOL能填補。

腺病毒DNA的5'末端共價連接一個55kD的蛋白質(zhì)，即末端蛋白質(zhì)（Terminal

ProteinTP）,而正在復(fù)制的腺病毒新生的DNA5'端為80kD的蛋白質(zhì)，為末端

蛋白質(zhì)前體（pTP），這一引發(fā)方式避免了線性DNA在復(fù)制結(jié)束后的5,末端隱縮

問題。真核生物同樣面臨線性DNA復(fù)制結(jié)束時產(chǎn)生的5'末端隱縮問題。這個問

題的解決取決于端粒的結(jié)構(gòu)和能夠識別和結(jié)合端粒的蛋白和酶。

四膜蟲端粒中有--種端粒酶（）能將其端粒結(jié)構(gòu)中單鏈尾巴5'TTGGGG3'延長,

延長的部分仍是5'TTGGGG3',這一富含G的序列總是突出12T6個NT。這種酶

是,?種核糖核蛋白，由RNA和蛋白質(zhì)組成。有人證明該酶中的RNA是富含G序列

的模板，對拷貝出富含G序列所必需的部分為5'CAAAACCCCAAAA3',此RNA可

能還有其他作用，這單鏈尾巴可能彎轉(zhuǎn)成為引物復(fù)制5'末端，另一可能是某種

端粒蛋白結(jié)合末端的單鏈重復(fù)序列，并作為蛋白質(zhì)引物復(fù)制DNA地’末端。

復(fù)制的調(diào)控

DNA復(fù)制是受調(diào)控的，細(xì)胞分裂時間因營養(yǎng)條件變化很大（21-70分鐘/Ecoli）,

而DNA復(fù)制時間為40分鐘左右，可用成熟前起始加以解釋細(xì)胞分裂時間為21

分鐘的DNA復(fù)制。

DNA復(fù)制調(diào)控，可能涉及許多專一性的蛋白因子（EcoliDnaA,SV40大T抗原

等）和至少一類RNA分子（RNA2,RNA1）。細(xì)胞中蛋白質(zhì)和DNA總量的比例也可

能是一重要因素，因為氨基酸饑餓時會抑制蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制起始。

在此說明一下RNA2和RNA1：

大腸桿菌質(zhì)粒ColEl的復(fù)制需要一種RNA引物，RNAP0L從復(fù)制原點上游方向

555bp處轉(zhuǎn)錄，這個轉(zhuǎn)錄物就是RNA2oRNA2延伸至復(fù)制原點區(qū)域時，由RNAaseH

將RNA與DNA模板形成的雜合雙鏈中的RNA切斷，從而產(chǎn)生3'-0H末端，然后，

DNAP0L以此引物合成DNAo圖示P130。

在ColEl復(fù)制原點上游方向445bp處（相當(dāng)于RNA2的第111個堿基位置），起始

轉(zhuǎn)錄另一個RNA分子，即是RNA1,其轉(zhuǎn)錄方向與RNA2相反。這個反義的RNA1

有111個堿基與RNA2的5'末端互補，從而改變了RNA2的二級結(jié)構(gòu)使之不能為

RNAaseH（識別雜交雙鏈但不識別二級結(jié)構(gòu)）所識別，于是，RNA2的轉(zhuǎn)錄能夠繼

續(xù)進行，而不能在復(fù)制原點區(qū)域RNA。有些機理有待繼續(xù)探討

4.2轉(zhuǎn)錄

一概述

三類RNA都必須以DNA模板，在依賴于DNA的RNAP0L作用下合成，他包括RNA

鏈的起始，延

伸，終止等步驟，這一系列過程叫轉(zhuǎn)錄。

轉(zhuǎn)錄是基因表達的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。

轉(zhuǎn)錄涉及兩個方面

一是RNA合成的酶學(xué)過程

二是RNA合成的起始信號和終止，即DNA上的特定序列。

DNA和RNA的堿基序列方向總是5\'-3\'。

闡述幾個概念：

對DNA總是講模板鏈，在轉(zhuǎn)錄時DNA兩條鏈有混亂不一。新文獻規(guī)定：

把不作模板轉(zhuǎn)錄的鏈稱為有義鏈（sense）又稱編碼鏈（coding）,非模板鏈=1^附

鏈=有義鏈而把作為模板轉(zhuǎn)錄的鏈稱反義鏈（antisensestrand）或模板鏈，模板

=反義鏈。

對RNA,也容易將DNA序列直接與氨基酸的密碼子聯(lián)系起來：

SSDNAphage如中X174,其SSDNA作為復(fù)制模板進入細(xì)胞后復(fù)制合成互補DNA,

后者（互補DNA）作為轉(zhuǎn)錄模板（即反義鏈）合成RNAo即SSDNA=有義鏈=RNA

序列=正鏈對于SSRNA病毒，若其基因組RNA能作為mRNA或與mRNA相同，則該

RNA病毒為正鏈RNA病毒；若其RNA進入宿主需要進行RNA復(fù)制，再產(chǎn)生互補鏈

作為mRNA,則這種RNA稱為負(fù)鏈RNA病毒。

二RNA合成的酶學(xué)

1.RNA合成的基本特征

1）RNA的前體是四種核糖核甘三磷酸（rNTP）：ATP,GTP,CTP,UTP

2）RNA鏈的生長方向也是5'—3'

3）核昔三磷加到新生鏈的3\',同時除去一分子焦磷酸而生成磷酸二酯鍵。

4）轉(zhuǎn)錄必須以一條DNA鏈為模板，按堿基互補進行轉(zhuǎn)錄。

5）RNAPOL能起始一條新鏈的合成，起始的核甘酸一般是喋吟核甘三磷酸（XTP）

RNA合成含四步：RNAPOL結(jié)合于DNA上的特定位點，起始，鏈的延長，鏈終止

和釋放。

2.EColi和真核生物的RNAP0L（自己看）'

三控制轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列——操作子和啟動子結(jié)構(gòu)

1.操縱元（operon）及其結(jié)構(gòu)

操縱元：包括結(jié)構(gòu)基因和控制區(qū)以及調(diào)節(jié)基因的整個核甘酸序列。

控制區(qū)為兩部分：

1）從結(jié)構(gòu)基因溯流而上的緊靠結(jié)構(gòu)基因的部分叫操作子（operator）（即結(jié)構(gòu)基

因的5'上游），好比電器開關(guān)，控制其后面的全部結(jié)構(gòu)基因的開閉。

2）從操作子逆行而上的就是另一控制區(qū)域，叫啟動子（promoter）對轉(zhuǎn)錄非常

重要。

2.原核生物的啟動子

1）Pribnow框：-10bp處，是RNAPOL結(jié)合位點

2）Sextama框：-35bp處，RNApol先結(jié)合與此處，再結(jié)合于一10bp處。

3）CAP位點：CAP為環(huán)腺甘酸受體蛋白（cyclicAMPreceptor）。調(diào)節(jié)基因產(chǎn)

生的阻遏蛋白與操縱子以及誘導(dǎo)物互作實現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控；而葡萄糖的調(diào)

控機理則為正調(diào)控。

3.真核生物的啟動子

真核生物有三種RNAPOL：

POLI：負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄rRNA,只有一種啟動子。

POLII：負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)基因和部分snRNA基因的轉(zhuǎn)錄，啟動子最復(fù)雜。

POLIII：負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄tRNA和5SrRNA,啟動子位于轉(zhuǎn)錄的DNA序列內(nèi)（內(nèi)部啟動

子

1）RNAPOLI的啟動子

2）RNAPOLII的啟動子結(jié)構(gòu)

A.帽子位點

B.TATA框：

C.CAAT框

D.增強子

3）RNAPOLIII的下游啟動子

第五章基因工程

5.1基因工程的四大要素及其實施要點

1.工具酶

1)限制性內(nèi)切酶

2)連接酶

3)修飾酶

4)DNA聚合酶:

A.DNA聚合酶I；

B.Klenowfragment

C.T4orT7DNApolymerase

D.TaqDNApolymerase

E.RT:依賴RNA的DNApolymerase

5)依賴于DNA的RNA聚合酶

6)T4噬菌體多核甘酸激酶TK：磷酸化

7)堿性磷酸酶:脫磷酸

細(xì)菌堿性磷酸酶(B.AlkalinePhosphatase)

小牛腸堿性磷酸酶(CalfintestinalPhosphatase)

2.目的基因的分離方法及其用途

分離方法

基因分離的物理化學(xué)方法

鳥槍法

cDNA文庫的建立與基因的分離

直接從特定的mRNA中分離基因

基因組文庫的建立和基因的分離

從蛋白質(zhì)入手分離編碼此蛋白的基因

基因的化學(xué)合成

利用PCRorRT-PCR分離基因

用途

研究該基因的全貌與內(nèi)涵，如詳細(xì)分析其結(jié)構(gòu)，功能及其調(diào)控

與正?；?qū)Ρ?，尋找異常基因的異常點，進而探索疾病發(fā)生的分子生物學(xué)機理

及治療

對策

研究生物種系進化與相關(guān)同源性

應(yīng)用某種基因的大量表達，生產(chǎn)所需要的蛋白質(zhì)或多肽

改良某些目的基因，以改良品種

建立基因療法。選用某種正?；颍牖颊唧w內(nèi)，治療某些先天性遺傳疾病。

3.基因工程載體

~1>定義

二、載體具備3的條件：

三、載體的種類：

質(zhì)粒載體

細(xì)菌用的表達載體

人載體

粘粒載體

M13噬菌體載體

真核細(xì)胞用載體

人工染色體（YAC,8BAC,9PAC,10MAC）

4.受體細(xì)胞和重組基因的導(dǎo)入

5.基因重組的方法與策略

6.基因重組體的篩選

5.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR

第一節(jié)PCR基本原理和影響因素

1983年美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase

chainre

action,PCR）,1985年公開報道，使人們能在試管內(nèi)以兒小時的反應(yīng)將DNA擴

增10'9倍。

1987年P(guān)CR得到美國的專利權(quán)，PCR技術(shù)在生命科學(xué)中掀起了一場革命，并形成

了巨大的市場，有人預(yù)言，本世紀(jì)末PCR產(chǎn)值可達到4xl0~8美元。本章介紹PCR

的原理、常用的各種PCR方法及主要應(yīng)用范圍。

一、基本原理

DNA在細(xì)胞中的復(fù)制是一個比較復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的基本因素有：DNA

聚合酶、DNA連接酶、DNA模板、由引發(fā)酶合成的RNA引物、核昔酸原料、無機

離子、合適的pH、以及解開DNA的超螺旋及雙螺旋等結(jié)構(gòu)的若干酶與蛋白質(zhì)因

子等。

PCR是在試管中進行DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與體內(nèi)相似，不同之處是耐熱

的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加熱（變性）、冷

卻（退火、保溫（延伸）等改變溫度的辦法使DNA得以復(fù)制，反復(fù)進行變性、退火、

延伸循環(huán)，就可使DNA無限擴增。PCR的具體過程如下：

將PCR反應(yīng)體系升溫至95c左右，雙鏈的DNA模板就解開成兩條單鏈，此

過程為變性。然后將溫度降至引物的Km值以下，3\'端與5\'端的引物各自與兩

條單鏈DNA模板的互補區(qū)域結(jié)合，此過程稱為退火。當(dāng)將反應(yīng)體系的溫度升至

70℃左右時，耐熱的TaqDNA聚合酶催化四種脫氧核糖核甘酸按照模板DNA的核

甘酸序列的互補方式依次加至引物的3\'端，形成新生的DNA鏈。每一次循環(huán)使

反應(yīng)體系中的DNA分子數(shù)增加約一倍。理論上循環(huán)兒次，就增加為2~n倍。當(dāng)經(jīng)

30次循環(huán)后，DNA產(chǎn)量達2C30拷貝，約為10~9個拷貝。PCR擴增過程見圖8T。

由于實際上擴增效率達不到2倍，因而應(yīng)為（1+R）-n,R為擴增效率。

二、參與PCR反應(yīng)體系的因素及其作用

參與PCR反應(yīng)的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、緩沖液、

Mg2+、三磷酸脫氧核甘酸（dNTP）、反應(yīng)溫度與循環(huán)次數(shù)、PCR儀等?，F(xiàn)對它們的

作用介紹如下：

（一）模板核酸

用于PCR的模板核酸可以是DNA,也可以是RNA。當(dāng)用RNA作模板時，首先

要進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA,然后再進行正常的PCR循環(huán)。核酸模板來源廣泛，可

以從培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、組織、病理標(biāo)本、考古標(biāo)本等中提取。

PCR反應(yīng)時加入的DNA模板量一般為100-100000拷貝，現(xiàn)在的技術(shù)水平已

能從單個細(xì)胞制備出相應(yīng)的cDNA文庫。DNA模板含量合適，可以減少PCR多次

循環(huán)帶來的堿基錯配。

通常模板DNA用線性DNA分子，若為環(huán)狀質(zhì)粒，最好先用酶將其切開成線狀

分子，因為環(huán)狀DNA復(fù)性太快。

（二）引物

引物決定PCR擴增產(chǎn)物的特異性與長度。因此，引物設(shè)計決定PCR反應(yīng)的成

敗。

PCR反應(yīng)中有兩種引物，即5V端引物與3\'端引物。5\'端引物是指與模板

5V端序列相同的寡核昔酸，3\'端引物是指與模板3V端序列互補的寡核甘酸。

對引物的基本要求有：①引物的長度過短會影響PCR的特異性，要求有16-30bp,

因為4-6=4.29x109,已大于哺乳動物基因組3xl0”9bp,保證了特異性結(jié)合；

引物過長使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74度），亦會影響產(chǎn)物的

特異性。②G+C的含量一般為40%-60%。③四種堿基應(yīng)隨機分布，不要有連續(xù)

3個以上的相同喋吟或嗑咤存在。尤其是引物3\'端，不應(yīng)有連續(xù)3個G或c,

否則會使引物與核酸的G或c富集區(qū)錯誤互補，而影響PCR的特異性。④引物自

身不應(yīng)存在互補序列而引起自身折疊，起碼引物自身連續(xù)互補堿基不能大于

3bPo⑤兩引物之間不應(yīng)互補，尤其是它們的3\'端不應(yīng)互補。一對引物之間不

應(yīng)多于4個連續(xù)堿基有互補性，以免產(chǎn)生引物二聚體。④引物與非特異靶區(qū)之間

的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源，否則導(dǎo)致非特異性擴增。

①引物3\'端是引發(fā)延伸的點。因此不應(yīng)錯配。由于ATCG引起錯配有一定規(guī)律,

以引物3\'端A影響最大，因此，盡量避免在引物3\'端第一位堿基是A。引物

3\'端也不要是編碼密碼子的第三個堿基，以免因為密碼子第3位簡并性而影響

擴增特異性。⑧引物5\'端可以修飾，包括加酶切位點，用生物素、熒光物質(zhì)、

地高辛等標(biāo)記，引入突變位點，引入啟動子序列，引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列等，

引物的設(shè)計最好以電腦軟件進行指導(dǎo)。

反應(yīng)體系中，引物濃度一般要求在0.1-0.5umol之間。濃度太高，容易生

成引物二聚體，或非特異性產(chǎn)物。

引物Tm值與退火溫度有關(guān)，計算公式為：Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物Tm值最

好在55-80℃范圍，以接近72c為最好。

（三）耐熱的TaqDNA聚合酶

1976年Chien分離出熱穩(wěn)定聚合酶，1986年Erlich分離并純化了適于PCR

的Tq熱穩(wěn)定性聚合酶，為PCR成為實用技術(shù)奠定了基礎(chǔ)，現(xiàn)已用基因重組生產(chǎn)。

日前可用于PCR的聚合酶有多種：有從水生棲熱菌中提取的Taq酶、從嗜熱棲熱

苗中獲得的Taq酶、從Litoralis棲熱球菌中分離的VENT酶、及從酸熱浴硫化

裂片苗中分離的Sac酶，而以Taq酶用得最廣泛。TaqDNA聚合酶分子量為94kD,

75℃時酶比活性為150bs/酶分子，反應(yīng)溫度過高或過低均影響其延伸率，Taq

蕾有很高的耐熱穩(wěn)定性。實驗表明，在92.5℃、95℃、97.5C時，其半衰期分

別為40min、30min和5min0

純化的Taq酶在體外無3\'-5\'外切酶活性，因而無校正閱讀功能，在擴增

過程可引起錯配。錯配堿基的數(shù)量受溫度、悔2+濃度和循環(huán)次數(shù)的影響。通常，

30次循環(huán)Taq酶的錯配率約為0.25%,高于Klenow酶的錯配率。Taq酶在每…

次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000,堿基替換率為1/8000。應(yīng)用低濃度的

dNTP(各20口mol/L)、1.5mmol/L的Mg2+濃度、高于55℃的復(fù)性溫度，可提高

Taq酶的忠實性，此時的平均錯配率僅為5xl(T-6次/(核甘酸*循環(huán))。

Taq酶具有類似于末端轉(zhuǎn)移酶的TdT的活性，可在新生成的雙鏈產(chǎn)物的3\'

端加上一個堿基，尤其是dATP最容易加上。因此，欲將PCR產(chǎn)物克隆到載體上，

可以用兩種處理辦法：一是構(gòu)建d『載體；二是用Klenow酶將3\'端的A去掉，

即在PCR反應(yīng)后，先在99℃加熱lOmin滅活Taq酶，調(diào)整Mg2+濃度至5-10mmol/L,

加入1-2UKlenow片段，室溫下作用15-20min,3\'端的A即被切去，

Taq酶還具有反轉(zhuǎn)錄活性。在2-3mmol/LMg2+濃度下68℃時出現(xiàn)類似反轉(zhuǎn)

錄酶的活性。若有Mg2+存在，則反轉(zhuǎn)錄活性更佳，利用這一活性，可直接用于

RNA-PCR,尤其是短片段的擴增。

以往用Taq酶進行PCR擴增，一般只能擴增小于400bp的DNA片段，經(jīng)過對

酶的結(jié)構(gòu)與功能的改造，以及PCR方法學(xué)的改進，現(xiàn)已能擴增20kb以上的DNA

分于。

Taq酶在PCR反應(yīng)中加入的量也很重要，太少當(dāng)然不好，太多一方面浪費，

同時也導(dǎo)致非特異性擴增,通常每100u1反應(yīng)液中含1-2.5UTaq酶為好。最好

在0.5-5U范圍內(nèi)確定最佳酶濃度。另一個問題是，雖然Taq酶是熱穩(wěn)定性較好

的工具酶，也應(yīng)注意在-20C貯存。

(四)緩沖液

緩沖液提供PCR反應(yīng)合適的酸堿度與某些離子，常用10-50mmol/L。

Tris-HCI(pH8.3-8.8)緩沖液。緩沖液中含有50mmol/LKC1有利于引物的退火。

有人并加入小牛血清白蛋白(100ug/L)或明膠(0.0%)或Twen20(0.05%-0.1%)

或二硫基蘇糖醇(DDT,5mmol/L)等，認(rèn)為這些物質(zhì)可以保護Taq酶。

(五)Mg2+Taq酶的活性需要Mg2+。Mg2+濃度過低，Taq酶活力顯暑降低；Mg2+

濃度過高，又使酶催化非特異性擴增。Mg2+濃度還影響引物的退火、模板與PCR

產(chǎn)物的解鏈溫度、引物二聚體的生成等。Taq酶的活性只與游離的Mg2+濃度有關(guān)，

而PCR反應(yīng)體系中，dNTP、引物、DNA模板等中的所有磷酸基團均可與悔2+結(jié)合

而降低Mg2+的游離濃度。因此,Mg2+的總量應(yīng)比dNTP的濃度高0.2-0.25mmol/L。

如果反應(yīng)體系中含有EDTA等螯合劑，也可結(jié)合掉一部分Mg2+O

為了獲得Mg2+的最佳濃度，可用下面的優(yōu)化法。首先在PCR緩沖液小不加

入Mg2+,從配置的10mmol/L的Mg2+儲存液中取一定量加入到各反應(yīng)管中，開始

以0.5mmol/L的濃度梯度遞增(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,...5.0mmol/L),由PCR

反應(yīng)后的電泳結(jié)果可確定Mg2+大概濃度范圍，再在該濃度的上下以0.2mniol/L

遞增與遞減幾個濃度來精確確定悔2+最適濃度。

(六)dNTP

dNTP為PCR反應(yīng)的合成原料。每種dNTP濃度應(yīng)相等，通常的濃度范圍為

20-200gmol/L,在此范圍內(nèi)，PCR產(chǎn)物的量、反應(yīng)的特異性與忠實性之間的平衡

最佳。例如，當(dāng)每種dNTP為20umol/L時，理論上可以產(chǎn)生2.6ug的400bp

的DNA。使四種dNTP的濃度保持在其Km值(10-15umol/L)以上，可保持堿基摻

入的忠實性；若dNTP的濃度大于50mmol/L,則可抑制Taq酶的活性。

(七)反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)

1.變性溫度與時間

PCR反應(yīng)中變性這一步很重要,若不能使模板D