PCR測定中常見問題分析

核酸檢測過程分析后采集容器采集方式保存運輸不合格樣本：脂血、溶血、樣本量不足樣本分析中分析前設(shè)備狀態(tài)儀器：日維護開機自檢準(zhǔn)備試劑配制核酸擴增結(jié)果分析結(jié)果記錄核酸純化檢測系統(tǒng)試劑設(shè)備質(zhì)控品人員操作核酸檢測1目前一頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點結(jié)果不準(zhǔn)確

問題出在哪？試劑耗材的質(zhì)檢標(biāo)本的采集與儲存儀器設(shè)備清潔維護（儀器設(shè)備狀態(tài)）人員操作--試劑準(zhǔn)備人員操作--樣本的制備--核酸純化人員操作--加樣設(shè)備狀態(tài)--擴增、檢測結(jié)果分析報告解釋污染控制目前二頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點標(biāo)本的采集與儲存1.采集的容器例如：血液樣本，采血管規(guī)格，抗凝劑種類？容器到達(dá)實驗室時應(yīng)處于未曾開啟狀態(tài)2．樣本的保存檢測前、檢測后保存容器？純化后DNA的保存避免反復(fù)凍融

目前三頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點儀器設(shè)備狀態(tài)1.儀器設(shè)備校準(zhǔn)加樣器方式：計量部門、廠家、自校準(zhǔn)擴增儀方式：廠家溫浴設(shè)備、溫濕度計2.設(shè)備狀態(tài)清潔維護

目前四頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點試劑的配制保證反應(yīng)的均一性，每次試驗的擴增反應(yīng)混和液應(yīng)一次配出，并至少多配1人份。配制時注意：試劑充分復(fù)融、混勻，開蓋前瞬時離心；配制后充分混勻，但不可劇烈震蕩，分裝前瞬時離心。

配制后不宜放置過久，因為PCR/RT-PCR反應(yīng)液中的酶、引物、底物在低溫與室溫下均可按較低的效率起反應(yīng)而消耗部分原料產(chǎn)生非特異的引物二聚體等，造成擴增效率降低，一般的建議是配制完P(guān)CR反應(yīng)液后的0.5—3小時內(nèi)應(yīng)及時上機擴增，加模板后應(yīng)盡快上機目前五頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點試劑準(zhǔn)備、加樣試劑配制的均一性、分裝的均一性常用試劑的分裝、儲存及使用容器加樣準(zhǔn)確性和重復(fù)性

加樣量目前六頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點樣本的制備----核酸純化核酸提取方法人員操作儀器設(shè)備狀態(tài)樣本量

目前七頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點樣本的制備----核酸純化一般原理：均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細(xì)胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結(jié)合于核酸的蛋白質(zhì)，從而將靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。一般步驟：去垢劑裂解--蛋白酶處理--有機溶劑提取--乙醇沉淀等步驟。純化目的：核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴增的物質(zhì)去除。

1.核酸提取方法目前八頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點樣本的制備----核酸純化純化質(zhì)量評價：抑制物的去除來自樣本--血紅素及其代謝產(chǎn)物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份、降解靶核酸的核酸酶等。

來自提取過程--乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢劑如十二烷基硫酸鹽(SDS)和chaotrope試劑如異硫氰酸胍和鹽酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有機溶劑。保證措施：對臨床標(biāo)本中可能存在的抑制/干擾物的質(zhì)控措施；核酸提取及擴增有效性的質(zhì)控目前九頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點樣本的制備----核酸純化2.人員操作

加樣的準(zhǔn)確避免交叉污染振蕩的幅度、時間溫育的溫度、時間

……目前十頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點樣本的制備----核酸純化3.儀器設(shè)備狀態(tài)離心機金屬浴/水浴加樣器全自動樣本處理系統(tǒng)目前十一頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點樣本的制備----核酸純化1．純化的原則

防止和抑制DNase對DNA的降解；

盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞，保持DNA分子的完整；

將蛋白質(zhì)、脂類、糖類等物質(zhì)分離干凈。2．可能出現(xiàn)的問題模板中含有雜蛋白質(zhì)，特別是染色體中的組蛋白模板中含有Taq酶抑制劑；在提取制備模板時丟失過多，提取效率低提出過程中引入的有機溶劑未去除。?目前十二頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點樣本的制備----核酸純化4.樣本量50l樣本靈敏度500IU/ml200l樣本靈敏度50IU/ml?目前十三頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點擴增、檢測1．加模板（上樣）加入提取好的核酸模板時需格外小心，往往PCR擴增所需加入的模板量只有2μl，加樣器的使用顯得尤其重要，須控制加樣精密度于準(zhǔn)確的。

擴增管蓋子要蓋緊，管蓋沒有蓋好造成PCR反應(yīng)液熱蒸發(fā)，影響反應(yīng)溫度的準(zhǔn)確控制及反應(yīng)也各成份的濃度，同時也成為一個污染源。（壓蓋時由于粗心或者用力不均致使部分蓋子變形，也是實驗室常見的問題）目前十四頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點擴增、檢測熟悉儀器設(shè)備的特點，標(biāo)本的放置，參數(shù)設(shè)置……擴增、檢測

影響因素：引物、探針、儀器設(shè)備狀態(tài)擴增效率：目前十五頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點關(guān)于污染1．樣本的污染

微生物、操作人員、標(biāo)本之間的交叉污染2．?dāng)U增產(chǎn)物或模板的污染

試劑、加樣器、操作臺面…

PCR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)

，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。

氣溶膠：空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染，據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝。目前十六頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點關(guān)于污染1．樣本的污染

微生物、操作人員、標(biāo)本之間的交叉污染2．?dāng)U增產(chǎn)物或模板的污染

試劑、加樣器、操作臺面…

PCR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)

，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。

氣溶膠：空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染，據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝。目前十七頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點關(guān)于污染3.污染的監(jiān)測--陰性對照

每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照，它包括：

陰性標(biāo)本對照

空白試劑對照目前十八頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點關(guān)于污染4．防止污染的方法實驗室合理分區(qū)制定工作流程并嚴(yán)格執(zhí)行實驗室的清潔使用哪種消毒（去污染）劑？設(shè)備、加樣器、工作臺面….選擇鹽酸還是次氯酸？

去污染效果取決于有效氯的濃度：0.05–0.5%目前十九頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點關(guān)于污染5．何時、怎樣去污染？

噴灑10%bleach15-30min清水擦

每次PCR后和泄漏時進行目前二十頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點目前二十一頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點目前二十二頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點關(guān)于污染

含氯消毒液的稀釋和貯存：用潔凈的水稀釋消毒液，自來水雖然方便，但是次氯酸不穩(wěn)定，尤其是在水質(zhì)較硬的情況下；盡量新鮮配置，1：10稀釋的消毒液，1-2周穩(wěn)定；稀釋的含氯消毒液放在室溫不透明的容器里；將稀釋的次氯酸消毒液放在常規(guī)使用的噴霧瓶中，放在水槽下。溫度、光照和氧化作用都可以使之分解變質(zhì)。目前二十三頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點關(guān)于污染紫外燈的使用

紫外波長（nm）一般選擇254/300nm

照射30min即可

有效距離：60-90cm需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時，要考慮PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大。目前二十四頁\總數(shù)二十六頁\編于十五點其他細(xì)節(jié)問題加樣器

吸樣器污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源，因而