病毒感染性疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷

關(guān)于病毒感染性疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷第1頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

病毒（Virus）是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單、體積最小的微生物。病毒感染十分常見，約70%~80%的傳染病由病毒感染所引起。迄今已證實(shí)500多種病毒對(duì)人有致病性，其中不少病毒危害極大，如最近流行的SARS病毒。因此盡快獲得病毒的實(shí)驗(yàn)診斷，對(duì)控制病毒的轉(zhuǎn)播、疾病的診斷和防治具有重要的意義。

第2頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

病毒性疾病實(shí)驗(yàn)診斷的一般原則是特異、敏感、快速和簡(jiǎn)便。首先根據(jù)流行病學(xué)和臨床特點(diǎn)，初步判斷可能感染的病毒；然后根據(jù)可疑病毒生物學(xué)特點(diǎn)、機(jī)體免疫應(yīng)答和臨床過(guò)程，以及病人當(dāng)前所處的時(shí)機(jī)，確定實(shí)驗(yàn)診斷的方法。目前病毒感染的檢查主要依靠經(jīng)典的方法和近來(lái)發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)等方法。前者主要包括病毒分離培養(yǎng)、鑒定及血清學(xué)實(shí)驗(yàn)；后者主要是核酸雜交與PCR及現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)。

第3頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月病毒學(xué)檢驗(yàn)

病毒分離培養(yǎng)病原學(xué)診斷形態(tài)學(xué)檢測(cè)分子生物學(xué)技術(shù)——病毒核酸補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中和試驗(yàn)血清學(xué)診斷血凝抑制試驗(yàn)間接免疫熒光檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

第4頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

一、標(biāo)本采集與運(yùn)送（一）標(biāo)本的采集

要從臨床標(biāo)本中成功地分離出病毒，很大程度上取決于標(biāo)本的恰當(dāng)采樣和處理，為了保證標(biāo)本質(zhì)量，應(yīng)注意以下問(wèn)題：

1．采樣時(shí)間

盡可能在發(fā)病的初期，急性期或患者入院的當(dāng)天進(jìn)行，越早越好，最好在治療之前。疾病后期體內(nèi)產(chǎn)生免疫力，病毒量減少或消失。第5頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

2．標(biāo)本種類的選擇

根據(jù)臨床感染的癥狀及流行病學(xué)資料，判斷可能感染病毒的種類，選擇相應(yīng)部位采取標(biāo)本，處理標(biāo)本時(shí)要考慮病毒的生物學(xué)特性。常見分離病毒標(biāo)本的選擇見書P64表4-2。

（1）

心臟疾病

（2）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染

（3）

先天或新生兒感染

（4）

胃腸道疾病

（5）

呼吸道感染

第6頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

3．常見標(biāo)本的采集方法

（1）

血液：以無(wú)菌手續(xù)抽取抗凝10ml，抗凝劑可選用100u/ml肝素鈉。為了血清學(xué)檢查的需要，應(yīng)抽取另一管5ml血液，不抗凝送檢。

（2）

腦脊液：以無(wú)菌手續(xù)抽取腦脊液

1~2ml，置無(wú)菌試管內(nèi)，在冰浴中第7頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

應(yīng)立即送檢。4℃可存放72h。

（3）宮頸或陰道拭子：采取病灶部位分泌物，將拭子置運(yùn)送液中；如無(wú)病損部位，則清理宮頸口粘液，將拭子伸入宮頸約1cm停留5秒以上取出，置運(yùn)送液中4℃冰浴立即送檢。第8頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（4）

糞便標(biāo)本：取2~4g糞便標(biāo)本在無(wú)菌的容器中，加8~10ml運(yùn)送液立即送檢。

（5）

含漱液：可用無(wú)菌生理鹽水，讓患者含漱幾次取得，與運(yùn)送液等量混合。

第9頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（6）

喉拭子：用生理鹽水濕潤(rùn)的拭子采取咽喉部表面，置運(yùn)送液中，注意避免唾液污染。

（7）尿道拭子及尿液標(biāo)本：尿道拭子伸入尿道4cm輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)2~3次，以獲得較多的上皮細(xì)胞，取出后置運(yùn)送液中。

（8）尸檢標(biāo)本：應(yīng)在死亡后盡早采取，采集各種器官時(shí)要分開使用器械和容器。

第10頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（二）標(biāo)本的運(yùn)送和保存

標(biāo)本采集后注意無(wú)菌、冷凍、保濕、立即送檢。

分離培養(yǎng)病毒的標(biāo)本要盡快送到實(shí)驗(yàn)室處理和接種。如不能及時(shí)送檢，可在4℃冷藏?cái)?shù)小時(shí)，如需較長(zhǎng)時(shí)間保存則應(yīng)置-70℃。放置在-20℃，病毒容易滅活，凍存液中需加入甘油或二甲亞砜等作保護(hù)，避免反復(fù)凍融使病毒滅活。第11頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

為了抑制細(xì)菌生長(zhǎng)通常在病毒傳送培養(yǎng)基（VTM）中加入抗生素如青霉素100U/l和鏈霉素100μg/ml，為了抑制真菌的生長(zhǎng)加入2.5μg/ml二性霉素B或40μg/ml制霉菌素。第12頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

二、病毒的分離與鑒定

（一）病毒分離和鑒定的一般程序

病毒分離和鑒定的一般程序見書P66

圖4-1（二）病毒的分離

病毒是專性細(xì)胞寄生，需要在活細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)才能得到分離。選擇何種動(dòng)物或細(xì)胞來(lái)分離，應(yīng)根據(jù)臨床感染的癥狀和流行病學(xué)資料，推測(cè)可能的病毒種類，選擇相對(duì)敏感的動(dòng)物和細(xì)胞來(lái)分離標(biāo)本中的病毒。

第13頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

1.組織培養(yǎng)（1）

概念

將人或動(dòng)物離體的活組織或分散的活細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)室的試管或培養(yǎng)基中，模擬體內(nèi)的生理?xiàng)l件使之生存和生長(zhǎng)，稱之為組織培養(yǎng)。（2）

組織培養(yǎng)的類型

A器官培養(yǎng)：如氣管、腸段。器官保存了原功能，用于分離某些有器官特異性的病毒。

B組織塊培養(yǎng)：如肝組織塊培養(yǎng)肝炎病毒。

C細(xì)胞培養(yǎng)（單層細(xì)胞培養(yǎng)）：現(xiàn)使用廣泛的組織培養(yǎng)技術(shù)。第14頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（3）細(xì)胞培養(yǎng)的種類和方法根據(jù)細(xì)胞的來(lái)源、染色體特性和傳代次數(shù)的不同可分為三類：

1．

原代和次代細(xì)胞培養(yǎng)

離體的新鮮組織或器官，機(jī)械處理

胰蛋白

洗滌

吹打酶消化

加入營(yíng)養(yǎng)液?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞懸液

1-3次

細(xì)胞計(jì)數(shù)

、調(diào)整細(xì)胞濃度

分裝培養(yǎng)

生長(zhǎng)

瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)形成單層細(xì)胞，稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)

第15頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

胰酶消化轉(zhuǎn)種新的培養(yǎng)瓶形成單層細(xì)胞，稱為次代細(xì)胞培養(yǎng)

2．

二倍體細(xì)胞株原代細(xì)胞多次連續(xù)傳代后仍保持二倍體染色體特性（即含23對(duì)染色體），稱之為二倍體細(xì)胞。傳代細(xì)胞壽命一般為40~50代，大多數(shù)為成纖維細(xì)胞,如人胚肺細(xì)胞。廣泛用于病毒分離和疫苗制備。第16頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3．傳代細(xì)胞系來(lái)源于腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞株傳代過(guò)程的變異細(xì)胞。細(xì)胞增殖特征和染色體均類似于腫瘤細(xì)胞。不宜用于疫苗的制備，常用于病毒的分離和鑒定。

（4）組織培養(yǎng)的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：A．來(lái)源廣；B．不受機(jī)體免疫因素影響，個(gè)體差異小，敏感范圍廣；C.易于觀察病變；D.可用于病毒的分離、鑒定、疫苗的制備；E.易管理，相對(duì)比較經(jīng)濟(jì)。缺點(diǎn)：條件要求高，必須要有細(xì)胞培養(yǎng)的條件。第17頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

2.

雞胚接種

雞胚是用于分離粘病毒科、皰疹病毒、痘類病毒的較為理想的材料。

（1）

常用接種部位和用途

38-39℃

新鮮受精卵

5-13天

卵黃囊接種羊水腔接種尿囊腔接種絨毛尿囊膜接種第18頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

卵殼氣室尿囊絨毛尿囊膜卵黃囊卵白羊膜羊水囊第19頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①

卵黃囊接種：用于流行性腦炎病毒分離②

羊水腔接種：用于流感病毒、副流感病毒的初次分離③尿囊腔接種：用于流感病毒、腺病毒、腮腺炎病毒分離④絨毛尿囊膜接種：用于痘病毒、皰疹病毒分離第20頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（2）

雞胚接種的特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：A.雞胚是一個(gè)整體，可有多種接種途徑；

B.可收獲大量病毒；

C.雞胚本是無(wú)菌無(wú)病毒的，對(duì)接種病毒不產(chǎn)生抗體；

D.來(lái)源廣，操作簡(jiǎn)便。

缺點(diǎn):A.易感病毒較少，應(yīng)用較局限

B.反復(fù)用雞胚傳代，病毒毒力可下降第21頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

3.

動(dòng)物接種

（1）

常用動(dòng)物：小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等

（2）

接種途徑：

呼吸道病毒，如流感病毒，滴鼻接種3周齡新生小鼠

腸道病毒，如柯薩奇病毒，腹腔接種乳鼠（一日齡）

乙肝病毒，靜脈注射猩猩

嗜神經(jīng)病毒，如乙腦病毒（用3周齡小鼠）、狂犬病毒（用家兔），顱內(nèi)接種

第22頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（3）

接種后觀察應(yīng)每日至少兩次，必要時(shí)每隔2~4小時(shí)觀察一次。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌^察不同的反應(yīng)情況。

（4）

動(dòng)物接種特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：A.可以按照不同途徑分離鑒定病毒，可模擬人類感染途徑

B.可用于疫苗的篩選、制備

C.可用于制備抗血清

D.操作簡(jiǎn)便，對(duì)環(huán)境要求低

第23頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

缺點(diǎn)：A.可自然帶毒或隱性感染，影響結(jié)果的觀察

B.存在個(gè)體差異

C.敏感病毒較少，或有些病毒感染后不出現(xiàn)明顯癥狀，不宜觀察

D.不經(jīng)濟(jì)，難管理

第24頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）病毒的鑒定

1.初步鑒定

根據(jù)臨床癥狀、流行病學(xué)特點(diǎn)、標(biāo)本來(lái)源、易感動(dòng)物范圍、細(xì)胞病變特征及生物學(xué)特性、理化性質(zhì)，可初步確定病毒屬于何科何屬。

（1）

動(dòng)物感染范圍及潛伏期

病毒感染動(dòng)物的范圍、發(fā)病的潛伏期有差異。如柯薩奇基B組病毒對(duì)新生乳鼠致病，對(duì)成年小鼠不致??；小鼠腦內(nèi)接種乙腦病毒，潛伏期一般為4天，少于4天發(fā)病則可能為非乙腦病毒引起。第25頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（2）對(duì)雞胚的敏感性

不同病毒對(duì)雞胚不同接種途徑敏感性不同。

直接法：如觀察絨毛尿囊膜是否有病灶

間接法：尿囊液、羊水做血凝抑制試驗(yàn)等

第26頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（3）

病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)

①細(xì)胞代謝類型改變：細(xì)胞代謝產(chǎn)酸可導(dǎo)致培養(yǎng)液pH指示劑呈黃色，病毒增殖抑制了細(xì)胞代謝，使培養(yǎng)液不變色或變紅。但腺病毒不抑制細(xì)胞代謝，反而促進(jìn)糖酵解增加產(chǎn)酸。

②

細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

由病毒增殖所引起的細(xì)胞變化稱為細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,CPE)。

第27頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

A.細(xì)胞溶解，細(xì)胞培養(yǎng)液中出現(xiàn)空斑,

如腸道病毒；

B.細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞，如皰疹病毒；

C.細(xì)胞腫大，變圓堆積成葡萄狀，如腺病毒；

D.胞漿內(nèi)或核內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體，如狂犬病毒：

E.不出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象。

第28頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

③空斑或蝕斑（plaque）形成試驗(yàn)：空斑是指在單層細(xì)胞中被病毒感染引起死亡的細(xì)胞區(qū)域，周圍被活細(xì)胞包圍。一般而言，一個(gè)空斑是由一個(gè)感染性病毒顆粒感染所引起。不同的病毒引起的空斑形態(tài)和大小不同?？蛇M(jìn)行病毒顆粒的計(jì)數(shù)、純化，結(jié)合中和試驗(yàn)可進(jìn)行病毒的鑒定。

第29頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

④干擾現(xiàn)象：一種病毒感染細(xì)胞后，可以干擾以后進(jìn)入的病毒的增殖。利用此現(xiàn)象鑒定不引起形態(tài)學(xué)變化的病毒。如某些型別的鼻病毒能干擾以后進(jìn)入的副流感Ⅰ型病毒的增殖，從而阻抑后者的紅細(xì)胞吸附作用。

第30頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

⑤

紅細(xì)胞吸附及吸附抑制試驗(yàn)：紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于病毒在細(xì)胞膜成熟時(shí)，將其血凝素插入細(xì)胞膜，使受染細(xì)胞吸附紅細(xì)胞，是病毒增殖的指標(biāo)。該現(xiàn)象可被相應(yīng)的病毒特異性抗體所抑制，稱為紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)，可用來(lái)鑒定病毒。

第31頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（4）

理化性質(zhì)的測(cè)定

①病毒的大小和形態(tài)：可用電鏡觀察病毒的大小和形態(tài)。

②核酸類型鑒別及序列測(cè)定：利用5-溴-2-脫氧尿苷（BUDR）抑制DNA復(fù)制的特性，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入該物質(zhì)，可抑制DNA病毒的復(fù)制和增殖，抑制細(xì)胞病變的出現(xiàn)，但對(duì)RNA病毒無(wú)抑制作用，以次判斷病毒核酸類型。也可對(duì)病毒特異序列或全序列的堿基排列測(cè)定或DNA

雜交、DNA-RNA雜交來(lái)鑒定病毒。第32頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月③

耐酸試驗(yàn)：腸道病毒對(duì)酸有耐受力，而鼻病毒在酸性環(huán)境下易被滅活。④

乙醚敏感試驗(yàn)：病毒外周如有類脂包膜，則易被乙醚破壞，而失去感染性，不能感染細(xì)胞。可作為病毒是否具有類脂包膜的依據(jù)，也可用氯仿或去膽酸鈉代替乙醚進(jìn)行試驗(yàn)。第33頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

2最后鑒定——血清學(xué)試驗(yàn)在初步鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)已分離出陽(yáng)性結(jié)果需選擇適當(dāng)?shù)难鍖W(xué)方法對(duì)病毒分離株作最后鑒定。血清學(xué)方法鑒定是將分離到的病毒和已知病毒的參考血清作中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)等。由于分子病毒學(xué)的發(fā)展，病毒的最后鑒定還應(yīng)包括分子生物學(xué)方法的鑒定，它還能檢出不產(chǎn)生細(xì)胞病變的那些病毒。

第34頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（1）中和試驗(yàn)：是將病毒與特異性抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，使病毒失去感染性，在細(xì)胞培養(yǎng)和活的機(jī)體內(nèi)不出現(xiàn)病變的試驗(yàn)。常用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行中和試驗(yàn)。第35頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月方法：①固定病毒（100TCID50），稀釋血清，測(cè)Ab效價(jià)。兩次效價(jià)相差4倍以上有診斷意義。

TCID50：50%組織細(xì)胞感染的病毒劑量(50%TissuecellinfectivedoseTCID50)②固定血清（1：20或1：40），稀釋病毒，求中合指數(shù)。

第36頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月中和指數(shù)>50為陽(yáng)性，有意義中和指數(shù)<9為陰性，無(wú)意義中和指數(shù)10~49，為可凝。中和試驗(yàn)較復(fù)雜和費(fèi)時(shí)，多用于V的鑒定和流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)臨床診斷價(jià)值不大。（2）血凝與血凝抑制試驗(yàn)?zāi)承┎《究膳c一定種類的哺乳動(dòng)物或禽類的紅細(xì)胞產(chǎn)生血凝現(xiàn)象。加入相應(yīng)的血凝素抗體可抑制血凝現(xiàn)象的發(fā)生，是為血凝抑制試驗(yàn)?？勺鳛椴《拘蛣e確定的依據(jù)。（3）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)第37頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

三、病毒感染的快速診斷（一）、病毒的形態(tài)學(xué)檢查

1.

光學(xué)顯微鏡

可以觀察到大型的病毒如痘病毒類。在光學(xué)顯微鏡下還可以觀察到病毒感染的宿主細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性的包涵體（inclusionbody）。根據(jù)包涵體的特點(diǎn)，可以作出輔助診斷。包涵體可能是病毒增殖的場(chǎng)所或病毒顆粒的聚合體，也可能是宿主細(xì)胞對(duì)病毒作用的反應(yīng)產(chǎn)物，大致上產(chǎn)生核內(nèi)包涵體的是在細(xì)胞核內(nèi)裝配的病毒（通常為DNA病毒），產(chǎn)生胞質(zhì)包涵體的是在胞質(zhì)中裝配病毒（通常為RNA病毒）。第38頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

2.

電子顯微鏡檢查（1）電鏡直接檢查：某些病毒感染的早期在臨床標(biāo)本中就可出現(xiàn)病毒顆粒。經(jīng)粗提濃縮后用磷鎢酸鹽負(fù)染，電鏡下直接觀察，可發(fā)現(xiàn)病毒顆粒，獲得診斷。（2）免疫電鏡檢查：在含病毒的標(biāo)本中，加入特異抗體。經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后，使標(biāo)本中的病毒顆粒聚集成塊，再經(jīng)負(fù)染觀察，比直接電鏡檢查更易發(fā)現(xiàn)病毒體，靈敏度可提高100倍。第39頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）、病毒抗原檢查病毒抗原是病毒特異性的標(biāo)志，通過(guò)免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本中的特異性抗原存在，可以早期診斷病毒感染。用于病毒抗原檢查的抗體，最好是單克隆抗體。

1.

免疫熒光技術(shù)

有直接和間接熒光法。具有快速、實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)。適合于病毒型別少，細(xì)胞培養(yǎng)難以成功的病毒。間接熒光技術(shù)具有放大作用，因而靈敏度比直接法高。免疫熒光技術(shù)易出現(xiàn)非特異性熒光，導(dǎo)致假陽(yáng)性，需要嚴(yán)格對(duì)照和排除試驗(yàn)。第40頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

2.

酶免疫技術(shù)有酶免組化和酶免吸附試驗(yàn)法。酶免組化法與免疫熒光技術(shù)相同，不同的是將熒光標(biāo)記改為酶標(biāo)記。由于酶反應(yīng)的產(chǎn)物具有累積性，因而靈敏度比熒光技術(shù)高。

3.其它技術(shù)

如固相放射免疫技術(shù)、發(fā)光免疫分析技術(shù)、膠體金標(biāo)記的免疫層析技術(shù)等。

第41頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（四）、病毒核酸檢測(cè)

1.

斑點(diǎn)雜交法(dotblothybridization)：

將待測(cè)的DNA或RNA直接點(diǎn)在雜交濾膜上,變性后,用標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。

（三）、早期抗體檢測(cè)檢測(cè)病毒感染機(jī)體后產(chǎn)生的早期特異性抗體。第42頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

2.

固相雜交技術(shù)：將核酸探針進(jìn)行修飾后，包被強(qiáng)力吸附的聚苯乙烯微孔板中，加入待測(cè)的核酸序列和標(biāo)記的指示探針在微孔板的雜交液中，進(jìn)行雜交，洗滌后，用酶免疫技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)?；?qū)⒑怂崽结槹挥谖⑿×４胖楸砻?，懸浮于雜交液中。與待測(cè)的核酸序列及標(biāo)記的指示探針進(jìn)行雜交。用磁分離技術(shù)分離結(jié)合有雜交體的磁體，進(jìn)行檢測(cè)。第43頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.原位分子雜交技術(shù)（insituhybridization）：是核酸雜交技術(shù)結(jié)合細(xì)胞學(xué)技術(shù)的一種特殊檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)將細(xì)胞固定后，在不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的前提下，在細(xì)胞原位釋放暴露DNA或RNA，加入標(biāo)記的特異核酸探針，進(jìn)行雜交。通過(guò)顯色技術(shù)，可以顯示特定的雜交探針在細(xì)胞內(nèi)的位置，和核酸的數(shù)量。直接觀察待測(cè)核酸在細(xì)胞內(nèi)的分布狀態(tài)與細(xì)胞染色體的關(guān)系。第44頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

4.

Southern印跡和Northern印跡法：

Southern印跡法用于DNA的雜交。將DNA提取后，直接或經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后，在瓊脂糖電泳中使DNA按分子量大小分開，然后將瓊脂糖凝膠中的DNA移至硝酸纖維膜上，用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交?？梢詸z測(cè)病毒DNA中的特異序列。

Northern印跡法用于RNA的雜交分析。利用RNA與DBM(diagobenloxymethyl)結(jié)合的特點(diǎn)，將瓊脂糖電泳后的RNA移至DBM膜上，用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。RNA也可轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上進(jìn)行雜交分析。用于檢測(cè)RNA或mRNA。第45頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)：選擇病毒的特異、保守片段作為靶基因，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增，可診斷病毒性感染。選擇病毒的易變區(qū)，結(jié)合RFLP，測(cè)序等技術(shù)可以對(duì)病毒進(jìn)行分析和突變的研究。（1）

DNA病毒：可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增其特異片段。第46頁(yè)，課件共54頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）

RNA病毒：可通過(guò)RT-PCR技術(shù)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，常結(jié)合巢式PCR(nest-PCR)技術(shù)進(jìn)行二次擴(kuò)增，提高了反應(yīng)的靈敏度和特異性。（3）

定量PCR技術(shù)：PCR技術(shù)是以指數(shù)方式對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增。采