本科基因工程實(shí)驗(yàn)論文開題報告

編號編號內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系基因工程實(shí)驗(yàn)室本科基因工程實(shí)驗(yàn)論文開題報告論文題目：堿性磷酸酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)學(xué)生姓名年 級專 業(yè)指導(dǎo)教師年月日學(xué)生姓名 民族 族 性別 出生年論文題目堿性磷酸酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)開題時間項(xiàng)目來源一、立論依據(jù)

年月 日 結(jié)題時間 年 月 本科生基因工程大實(shí)驗(yàn)課項(xiàng)目的研究意義，國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢分析，主要參考文獻(xiàn)及出處：堿性磷酸酶(alkalineAP廣泛學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)等領(lǐng)域。1大腸桿菌堿性磷酸酶2080AP、人胎盤型AP/骨/AP、人小腸型APAP25%~30%，活性部位Ser102殘基、Arg166及金屬離子配體，這些保守的與催化活性相關(guān)AP具有相似的作用機(jī)制。另外，功能相似的磷酸二酯酶，如蠟CAPAP還可作為其它磷酸酯酶和以金屬離子作輔助因子的磷酸酯酶的研究模型。AP確切的生理功能還不十分清楚，但認(rèn)為它對有機(jī)體內(nèi)磷代謝的調(diào)節(jié)有重要作用。APphoA，它是pho調(diào)節(jié)子主要調(diào)節(jié)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。PhoboxphoPhoB蛋白的調(diào)控。phoBphoPhoBPhoR蛋白磷酸化激活。細(xì)PhoRPst系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)接收到環(huán)境再去調(diào)節(jié)PhoBAPphoA的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)PhoB磷酸化，激活大腸桿菌APphoAPhoBphoAAP哺乳動物堿性磷酸酶APAP與催化活性相關(guān)的部位高度保守，2001PLAPX-1APAPAP1APAPAPAPAP分子兩個亞基可能不同。AP確切的生物學(xué)功能和作用機(jī)制還不十分清楚。目前認(rèn)為骨骼的礦化依賴于AP的活動，對此觀點(diǎn)最直接的證據(jù)可能是低磷酸酯酶癥。低磷酸酯酶癥是一種先天性代謝紊亂的骨疾病，為TNAP編碼的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，使血液中AP活力低于正常水平，表現(xiàn)為骨化及骨發(fā)育不全，至今已有200TNAP法治愈，但最近間葉干細(xì)胞移植的成功為該病的治療提供了新的途徑2養(yǎng)物質(zhì)的組織中如小腸上皮刷狀緣表面、胎盤合胞體滋養(yǎng)層表面、膽小管表面細(xì)胞膜上AP的含量很高，提示AP與磷酸的轉(zhuǎn)移和代謝有關(guān)。總之，不同組織和器官的AP有不同的生理功能，但有一些仍然是未知的。堿性磷酸酶的應(yīng)用APAP的活力已成為診斷和監(jiān)測多種疾病重要手段。AP主要用于阻塞性黃疸、原發(fā)性肝癌、繼發(fā)性肝癌、膽汁淤積性肝炎等的檢查，患這些疾病時，肝細(xì)胞過度制造AP，經(jīng)淋巴道和肝竇進(jìn)AP明顯升高3。而血中AP明顯升高可見于各種腸道疾病，也有文獻(xiàn)報道某些消化系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾APAP同工酶出現(xiàn)的機(jī)理尚APPLAPAP作為骨代謝異常的標(biāo)AP活力的定量測定可作為監(jiān)測骨形成變化的有效參數(shù)，在其他的骨代謝異常疾病(如骨軟化癥、佝僂病等)及早期甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)的病人、慢APAP活性的檢測及動態(tài)觀察將為疾病的早期診斷、治療效果的監(jiān)測、病情預(yù)后等提供有效的依4。在動物飼養(yǎng)和疾病診斷方面，AP是反映成骨細(xì)胞活性、骨生成狀況和鈣、磷代謝的AP主要來自骨骼，隨著動物長大成熟和骨骼APAP活性常作為重要的生化2APAPVD失調(diào)所引起AP的檢測比血鈣測定體內(nèi)鈣營養(yǎng)水平更具敏感性，因此，國內(nèi)外AP是反映骨改變?nèi)^程最正確的指標(biāo)，其特異性、靈敏度及準(zhǔn)確性優(yōu)于其它物質(zhì)的檢測5。另外，在動物患肝疾患、胃腸疾患、腎臟疾病和缺鋅時，血清APAPAP在不同動物體內(nèi)生理功能深入研AP在獸醫(yī)臨床上意義更大。在免疫學(xué)研究方面，已廣泛應(yīng)用AP標(biāo)記抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫熒光反應(yīng)(ELISA)WesternAP酶復(fù)合物的存在，與辣根過氧化物酶相比，AP用作標(biāo)記酶的優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定性高、靈敏度高缺點(diǎn)是成本高、標(biāo)記困難。在生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面，用APDNA5c末端磷酸基團(tuán)以防止AP5c末端磷酸基團(tuán)，再用(C-32P)ATP5cDNARNA片段的圖譜構(gòu)建。應(yīng)用APAP（1細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP（2SAP(來源于一種北極蝦（3）(CIAP（4）胎盤堿性磷酸酶(PLAP)和分泌性堿性磷酸酶(SEAP)CPLAP相比，SEAP沒有PLAP的C24個氨基酸(24個氨基酸構(gòu)成了與糖基化磷脂酰肌醇靶向錨定的區(qū)域)phoAAPAP作為檢驗(yàn)牛奶的巴氏滅菌的標(biāo)志。展望AP的研究已經(jīng)有近百年的歷史，對于AP的結(jié)構(gòu)、功能、性質(zhì)、作用機(jī)理、活性調(diào)等方面的研究均已取得了不小的成就。近年來，科研工作者將研究目光聚焦在AP的生理功能及應(yīng)用上，取得了許多新成果，如Lall?s 研究結(jié)果認(rèn)為，腸型AP在保持腸道平衡中發(fā)揮重要作用，膳食可以影響它的活性，腸型AP具有參與調(diào)節(jié)碳酸氫鹽分泌和十二指腸p通過脫磷酸作用控制細(xì)菌內(nèi)毒素誘發(fā)的腸道炎癥等功能6但對該酶在生物體內(nèi)確切的生物學(xué)功能、工作機(jī)理，以及哺乳類AP的晶體結(jié)構(gòu)分析等方面還有待進(jìn)一步研究，相信隨著科學(xué)的發(fā)展、科研手段的進(jìn)步、對AP認(rèn)識的不斷深入，將使AP在科研和臨床診3斷中發(fā)揮更大的作用。參考文獻(xiàn)：① LeDuMH,StigbrandT,TaussigMJ,etal.Crystalstructureofalkalinephosphatasefromhumanplacentaat1.8Aresolutionimplicationforasubstratespecificity[J].JBiolChem,2001,276(12):9158~9165.② OrimoH.Themechanismofmineralizationandtheroleofalka-linephosphatasehealthanddisease[J].JNipponMedSch,2010,77(1):4~12.③FernandezNJ,KidneyBA.Alkalinephosphatase:beyondtheliver[J].VetClinPathol,2007,34(9):68~70.④周新,涂植光.[M].第3版.北京:,2006.⑤王石瑩,閆素梅1堿性磷酸酶在動物骨骼代謝中的研究進(jìn)展 [J].飼料博覽2009(4):14~17.⑥ Lall?sJP.Intestinalalkalinephosphatase:multiplebiologicalrolesinmaintenanceofintestinalhomeostasisandmodulationbydiet[J].NutrRev,2010,68(6):323~332.4二、實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，擬解決的關(guān)鍵問題：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及目標(biāo)：DNApET-HisDNA電泳鑒定DNA的酶切PCR擴(kuò)增制備目的基因目的基因片段與載體連接DNA片斷感受態(tài)菌的制備細(xì)菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)SDS檢測表達(dá)蛋白關(guān)鍵問題：IPTG誘導(dǎo)量及誘導(dǎo)時間的優(yōu)化；超聲破碎的方案優(yōu)化。5實(shí)驗(yàn)思路：按照技術(shù)路線完成試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法：電泳PCR擴(kuò)增原核誘導(dǎo)表達(dá)等。技術(shù)路線：可行性分析：實(shí)驗(yàn)室相關(guān)技術(shù)成熟，實(shí)驗(yàn)人員熟悉相關(guān)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容以及方法，實(shí)驗(yàn)的可行性很高。實(shí)驗(yàn)進(jìn)度10天之內(nèi)：準(zhǔn)備：發(fā)放實(shí)驗(yàn)器材，搖pET-His，pMD-18T-NK。第一天：提質(zhì)粒并PCR擴(kuò)增NK，然后與pMD19-T連接過夜。DH5aEcoRIBamHIpMD19-T-NKDH5a涂板?；厥誴ET-His。第三天：挑p-T-NK平板克隆，搖菌。提質(zhì)粒pMD19-T-NK。第四天：EcoRI和BamHI雙酶切驗(yàn)證?；厥誑K。NK與pET-His連接過夜。pET-His-NKBL21(DE3)第六天：作感受態(tài)BL21(DE3)。提質(zhì)粒HindIII酶切驗(yàn)證。轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，涂板過夜。BL21(DE3)SDSOD600=0.5離心集菌。第八天：灌膠加樣電泳（2-3h45min，脫色。觀察脫色膠，轉(zhuǎn)入清水，照相。6預(yù)期實(shí)驗(yàn)成果：BAP；BAP表達(dá)載體；撰寫實(shí)驗(yàn)報告。曾參與與本實(shí)驗(yàn)有關(guān)的學(xué)習(xí)和研究工作積累以及已取得的工作成績：（學(xué)過基因工程課程、讀過相關(guān)的文獻(xiàn)、寫過有關(guān)的綜述、參加過相關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計或研究課題、獲得學(xué)術(shù)獎勵情況等）閱讀相關(guān)文獻(xiàn)書籍：王秋穎.堿性磷酸酶特性及其應(yīng)用的研究進(jìn)展