蛋白質(zhì)工程專業(yè)資料

蛋白質(zhì)工程一、名詞解釋：1.蛋白質(zhì)工程:是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和定點(diǎn)改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一門學(xué)科。它運(yùn)用基因工程手段，通過有控制的基因修飾和基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行定向改造，以期獲得性能更加優(yōu)良、更符合人類社會(huì)需要的蛋白質(zhì)分子。2.抗體:指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下產(chǎn)生的可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。3.人-鼠嵌合抗體：用鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)融合形成的抗體。4.人源化抗體：將鼠雜交瘤抗體的超變區(qū)嫁接到人抗體上形成的抗體。5.一級結(jié)構(gòu)：是多肽鏈中氨基酸殘基從N-末端到C-末端的排列順序及二硫鍵的位置。6.二級結(jié)構(gòu)：是指多肽鏈主鏈借助氫鍵排列成特有的規(guī)則的反復(fù)構(gòu)象。7.超二級結(jié)構(gòu)（結(jié)構(gòu)模體）：一級順序上相鄰的二級結(jié)構(gòu)在三維折疊中，彼此靠近、按特定的幾何排布形成排列規(guī)則的、在空間結(jié)構(gòu)上可以辨認(rèn)的、可以同一結(jié)構(gòu)模式出現(xiàn)在不同蛋白質(zhì)中的二級結(jié)構(gòu)組合體，稱為結(jié)構(gòu)模體。8.發(fā)夾式β模體（或ββ組合單位）：兩段相鄰的反平行β鏈被一環(huán)鏈連接在一起構(gòu)成的組合單位，其形貌與發(fā)夾相似，稱為發(fā)夾式β模體。9.希臘鑰匙模體：四段緊鄰的反平行β鏈以特定的方式來回往復(fù)組合，其形貌類似于古希臘鑰匙上特有的回形裝飾紋，故稱為希臘鑰匙型模體。10.β-α-β模體:是序列上連續(xù)、相鄰的兩股平行β鏈和一段α螺旋連接而形成的組合。11.結(jié)構(gòu)域：二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)模體以特定的方式組織連接，在蛋白質(zhì)分子中形成兩個(gè)或多個(gè)在空間上可以明顯區(qū)分的三級折疊實(shí)體，稱為結(jié)構(gòu)域。12.三級結(jié)構(gòu)：在二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)模體的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步盤曲、折疊形成的，涉及主鏈、側(cè)鏈在內(nèi)的所有原子和基團(tuán)的空間排布。13.四級結(jié)構(gòu)：是指在多條肽鏈組成的一個(gè)蛋白質(zhì)分子中，各亞單位在寡聚蛋白質(zhì)中的空間排布及亞單位間的互相作用。14.優(yōu)勢構(gòu)象：任何氨基酸側(cè)鏈中的組成基團(tuán)都可以繞著其間的C-C單鍵旋轉(zhuǎn)，從而產(chǎn)生各種不同的構(gòu)象。AA分子的各種構(gòu)象異構(gòu)體并不是平均分布的,總是以其最穩(wěn)定的構(gòu)象為重要的存在形式即為優(yōu)勢構(gòu)象。15.交錯(cuò)構(gòu)象：是能量上最有利的排布，在這種構(gòu)象中，一個(gè)碳原子的取代基正好處在另一個(gè)碳原子的兩個(gè)取代基之間。16.旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體：大多數(shù)氨基酸殘基的側(cè)鏈都有一種或少數(shù)幾種交錯(cuò)構(gòu)象作為優(yōu)勢構(gòu)象最經(jīng)常出現(xiàn)在天然蛋白質(zhì)中，稱旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體。17.肽鍵：由一個(gè)氨基酸的α-COOH與另一個(gè)氨基酸的α-NH2脫水縮合形成的共價(jià)鍵（或酰胺鍵）。肽鍵具有局部雙鍵性質(zhì)，其鍵長比一般的C-N單鍵短，因此肽鍵不能旋轉(zhuǎn)。肽鍵有反式(trans)和順式(cis)兩種構(gòu)型。18.肽：通過肽鍵將氨基酸連接在一起而形成的鏈狀化合物。19.構(gòu)型：是一個(gè)分子中原子的特定空間排布。當(dāng)一種構(gòu)型改變?yōu)榱硪环N構(gòu)型時(shí)必須有共價(jià)鍵的斷裂和重新形成。20.構(gòu)象：是組成分子的原子或基團(tuán)繞單鍵旋轉(zhuǎn)而形成的不同空間排布。21.肽單位：由于肽鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，肽鍵連接的基團(tuán)處在同一平面，具有擬定的鍵長和鍵角，是多肽鏈中的剛性結(jié)構(gòu)，稱為肽單位（或肽平面）。22.多肽主鏈：有序連接的肽單位就是多肽鏈的主鏈。23.扭角：由4個(gè)原子(或基團(tuán))組成的系統(tǒng)投影在與B-C鍵正交的平面上，A-B鍵投影與C-D鍵投影之間的夾角稱為扭角。（這個(gè)角度也可視為A-B-C決定的平面與B-C-D決定的平面間的夾角，故也稱為雙面角）24.拉氏構(gòu)象圖：Ramachandran根據(jù)蛋白質(zhì)中非鍵合原子間的最小接觸距離,擬定了哪些成對二面角（φ，ψ）所規(guī)定的兩個(gè)相鄰肽單位的構(gòu)象是允許的,哪些是不允許的,并且以φ為橫坐標(biāo),以ψ為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)圖上標(biāo)出,該坐標(biāo)圖稱拉氏構(gòu)象圖。25.偶極子：大小相等符號相反的兩個(gè)電荷組成的體系。26.偶極矩（μ）：正、負(fù)電荷中心間的距離（r）和電荷中心所帶電量(q)的乘積。μ=r×q。它是一個(gè)矢量，方向規(guī)定為從正電中心指向負(fù)電中心。27.疏水內(nèi)核：是指蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水側(cè)鏈緊密堆積而構(gòu)成的疏水區(qū)域。28.疏水作用：是指蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)彼此靠近、聚集，以避開水的現(xiàn)象。29.β層:兩條或多條伸展的β鏈側(cè)向聚集，通過相鄰肽鏈主鏈上的N-H與C=O之間有規(guī)則的氫鍵連接形成的鋸齒狀片層結(jié)構(gòu)。30.混合型β層:即一部分以平行方式排布，而另一部分以反平行方式排布。31.環(huán)肽鏈：在蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中，連接相對剛性的α螺旋和β層組合的環(huán)狀肽鏈，稱環(huán)肽鏈(loop)。環(huán)肽鏈常具有相稱不同的長度和形貌（即構(gòu)象的靈恬性），并具有較大的構(gòu)象柔性。是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的另一類基本組件。回折結(jié)構(gòu)的基本特性是使其所連接的肽鏈發(fā)生180°的急轉(zhuǎn)彎。32.β轉(zhuǎn)折：是由4個(gè)氨基酸殘基[i～(i+3)]順序連接的，使肽鏈彎折180°的特殊構(gòu)象。33.γ轉(zhuǎn)折：由三個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的，使肽鏈彎折180°的構(gòu)象。34.β發(fā)夾：通過一段短的環(huán)鏈將兩條相鄰的β鏈連接在一起的結(jié)構(gòu)，稱為β發(fā)夾或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。35.β-α-β模體：是序列上連續(xù)、相鄰的兩股平行β鏈和一段α螺旋連接而形成的組合。蛋白質(zhì)折疊：體內(nèi)新生的多肽鏈或體外變性的多肽鏈的一維線性氨基酸序列轉(zhuǎn)化為具有特性三維結(jié)構(gòu)的活性蛋白質(zhì)的過程。36.分子伴侶：是一類在細(xì)胞內(nèi)能幫助新生肽鏈對的折疊、組裝成為具有特定空間結(jié)構(gòu)和生物活性功能的蛋白質(zhì)，而自身不作為最終功能蛋白分子組成成分的分子。37.同源蛋白：是指不同生物體中表現(xiàn)功能相同或相似，在序列上具有顯著相似性的兩個(gè)蛋白質(zhì)。38.“EF”手”：在小白蛋白的結(jié)構(gòu)中，鈣與HTH模體的結(jié)合方式與右手三指握球相似，構(gòu)成模體的兩段螺旋在整體結(jié)構(gòu)中命名為E和F，故這一模體也稱為“EF手”。39.遺傳密碼:DNA（或mRNA）中的核苷酸序列與多肽鏈中氨基酸序列之間的相應(yīng)關(guān)系稱為遺傳密碼。40.密碼子(codon)：mRNA上每3個(gè)相鄰的核苷酸編碼多肽鏈中的一個(gè)氨基酸，這三個(gè)核苷酸就稱為一個(gè)密碼子或三聯(lián)體密碼。41.基因：含特定遺傳信息的核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。即產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA（rRNA、mRNA等）所必需的所有核苷酸序列。42.蛋白質(zhì)折疊:體內(nèi)新生的多肽鏈或體外變性的多肽鏈的一維線性氨基酸序列轉(zhuǎn)化為具有特性三維結(jié)構(gòu)的活性蛋白質(zhì)的過程。43.蛋白折疊的動(dòng)力學(xué)說：在蛋白折疊途徑中存在著某個(gè)或某些能壘，阻礙蛋白最穩(wěn)定分子構(gòu)象的獲得，從而使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)處在某種亞穩(wěn)態(tài)。44.在蛋白質(zhì)對的折疊中最常出現(xiàn)的障礙：①中間體通過外露疏水基團(tuán)的聚合②不對的二硫鍵的形成③脯氨酸殘基的異構(gòu)化45.折疊中間體：在蛋白質(zhì)從變性態(tài)折疊整天然態(tài)的過程中，通常要經(jīng)歷若干個(gè)中間的分子構(gòu)象狀態(tài)，即蛋白折疊中間體，也叫做部分折疊態(tài)。熔球態(tài)是折疊的中間體，疏水側(cè)鏈內(nèi)埋是重要驅(qū)動(dòng)力。46.熔球體：在折疊途徑中第一個(gè)可觀測的中間體就是從柔性無序的未折疊多肽鏈卷折成局部有組織的球狀態(tài)，稱為熔球體。47.蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)：為了獲得具有特定功能的蛋白質(zhì)，在分子水平上對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，甚至構(gòu)建具有特定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。48.分子?。河捎谶z傳基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子一級結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸殘基被更換所導(dǎo)致的一種遺傳病。49.突變的加和性原則：分子中多重突變的效應(yīng)等于單一突變效應(yīng)之和。50.分子剪裁：指在對天然蛋白質(zhì)的改造中替換1個(gè)肽段或1個(gè)結(jié)構(gòu)域。51.最小化途徑：把全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的復(fù)雜性簡化為幾個(gè)涉及天然蛋白穩(wěn)定性的關(guān)鍵特性，然后優(yōu)化這些特性。52.表達(dá)系統(tǒng)：基因工程中用來獲得有功能的異源蛋白質(zhì)的體系，涉及克隆載體，表達(dá)載體及受體細(xì)胞。53.操縱子：是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個(gè)遺傳單位54.啟動(dòng)子：是指能被RNA聚合酶辨認(rèn)、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。55.終止子:位于基因3’端,給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列56.HAMA（人抗鼠抗體）、常用氨基酸縮寫符號、Hsp（熱激蛋白）、GroEL（熱激蛋白Hsp60）、GroES（熱激蛋白Hsp10）、Dsb（二硫鍵形成酶）、PDI（二硫鍵異構(gòu)酶）、CD（園二色譜法）、NMR（核磁共振法）、2DNMR（二維核磁共振法）、Cis（順式肽鍵）、trans（反式肽鍵）CDRs（互補(bǔ)性決定區(qū)）、PDB（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫）、Tetr(四環(huán)素抗性基因)、Amps(無抗性氨芐青霉素抗性基因)、Ampr(氨芐青霉素抗性基因)、ung(尿嘧啶-N-糖基化酶)二、填空：1.1985年Wells證明若用其它氨基酸取代枯草桿菌蛋白酶中222位的Met（甲硫氨酸），可以提高酶的氧化穩(wěn)定性而保持高催化活性。2.將枯草桿菌蛋白酶中與酶活性部位有關(guān)的218位的Asn（天冬酰胺）變成Ser（絲氨酸），則酶在65℃的穩(wěn)定性顯著增長。3.酶的特性：高效性、專一性、反映條件溫和、可調(diào)控性、輔因子的作用。4.穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的重要因素：蛋白質(zhì)分子眾多基團(tuán)間的互相作用。5.蛋白質(zhì)特定的空間構(gòu)象由蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中某一個(gè)或某一段氨基酸序列決定。6.氨基酸是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化學(xué)基本組件。7.具有獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)是功能蛋白質(zhì)分子最基本的屬性。氨基酸是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化學(xué)基本組件。8.蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的基本建筑模塊是肽單位和側(cè)鏈基團(tuán)。9.拉氏構(gòu)象圖一直廣泛用于鑒定實(shí)驗(yàn)測定的和計(jì)算機(jī)模型建造的各種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的合理性。10.蛋白質(zhì)工程的基本困難是:從預(yù)期結(jié)構(gòu)到適配序列11.肽酰脯氨酰異構(gòu)酶可以催化提高脯氨酸肽鍵異構(gòu)化過程的速率，使折疊得以順利進(jìn)行。12.“對位排列”是一種比較序列相似性的方法。衡量序列相似性的指標(biāo)有“一致性百分?jǐn)?shù)”、“相似性分值”、“概率分值”。13.分子伴侶可以結(jié)合未折疊的、部分折疊和折疊不對的的蛋白質(zhì)。14.蛋白質(zhì)純度的鑒定通常采用物理化學(xué)的方法，如電泳法、超速離心沉降法、層析法、分光光度法等。15.蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)涉及：對已有蛋白質(zhì)的分子改造，亦稱蛋白質(zhì)的理性設(shè)計(jì)（或改造）；設(shè)計(jì)尚未在自然界中發(fā)現(xiàn)的、具有全新結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)，亦稱蛋白質(zhì)的從頭設(shè)計(jì)。16.抗體的可變結(jié)構(gòu)域可以分為超變區(qū)或稱互補(bǔ)性決定區(qū)（CDRs）和變化性較少的骨架區(qū)，而與抗原的結(jié)合是由超變區(qū)決定的。17.自然界唯一用于交叉連接的方法是二硫鍵.18.線性肽折疊形成獨(dú)特三維結(jié)構(gòu)的重要障礙：構(gòu)象熵。需要精心設(shè)計(jì)一系列的互相作用才干穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。19.組合庫設(shè)計(jì)應(yīng)考慮的兩個(gè)問題是：①核心問題：埋藏疏水部分，優(yōu)化疏水核。②優(yōu)化二級結(jié)構(gòu)單元間的界面。20.基因突變分為：①定位突變（或位點(diǎn)特異性突變）②隨機(jī)突變。三、簡答：1.蛋白質(zhì)工程研究的重要內(nèi)容:（1）運(yùn)用已知蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的信息作應(yīng)用研究。（2）從混雜變異體庫中篩選和選擇具有一定結(jié)構(gòu)—功能關(guān)系的蛋白質(zhì)。（3）定量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究。（4）根據(jù)已知結(jié)構(gòu)—功能的關(guān)系人工改造蛋白質(zhì)。該部分的重要研究內(nèi)容：①通過改變蛋白質(zhì)的活性部位，提高其生物功效及獨(dú)立工作的能力。②通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)順序，提高其在極端條件（如酸、堿、熱等）下的穩(wěn)定性。③通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)順序使其便于分離純化。2.妨礙酶開發(fā)運(yùn)用的重要因素：⑴酶含量甚少，傳統(tǒng)方法分離純化酶蛋白的成本太高；⑵酶蛋白分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性差；（過酸、過堿、高溫、氧化等因素均可破壞其結(jié)構(gòu)，使其喪失生物活性，因而在工業(yè)加工條件下，酶的半衰期短，運(yùn)用率較低）。⑶酶催化活性的最適pH值及底物專一性的范圍較窄，與工業(yè)應(yīng)用的規(guī)定有較大差距。3.人源化抗體不再被人的免疫系統(tǒng)視為外源蛋白，由此消除人抗鼠抗體反映。作用：能支持人的效應(yīng)器功能；在血漿中有較長的半壽期；減少了抗體的免疫原性。4.試述蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用：（一）研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（二）改變蛋白質(zhì)的特性：①改變酶的特性；②改變蛋白質(zhì)的活性（三）生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽類活性物質(zhì)：⑴提高酶的產(chǎn)量和發(fā)明新型酶蛋白質(zhì)工程技術(shù)的興起，為創(chuàng)建新型酶、改變酶的生理特性提供了強(qiáng)有力的工具。⑵設(shè)計(jì)和研制新型抗體⑶設(shè)計(jì)和研制多肽及蛋白質(zhì)類藥物（四）設(shè)計(jì)合成全新蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能的設(shè)計(jì)和預(yù)測5.影響鼠源單抗應(yīng)用的限制因素：⑴鼠源單克隆抗體只能對人體免疫系統(tǒng)效應(yīng)器功能產(chǎn)生弱的激活作用。⑵鼠源抗體在人血漿中的半壽期非常短。⑶鼠源抗體對人而言是一種異體蛋白，容易引起人體的免疫反映，產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)，這種人抗鼠抗體不僅會(huì)中和鼠源抗體的活性，并且會(huì)使人產(chǎn)生涉及高過敏性在內(nèi)的各種嚴(yán)重的副反映。6.a-氨基酸共同特點(diǎn)：①與羧基相鄰的α-碳原子上都有一個(gè)氨基，稱為α–氨基酸。②R表達(dá)側(cè)鏈，各種氨基酸在結(jié)構(gòu)上的差別僅在于側(cè)鏈（R）的不同。③除甘氨酸外，其它所有氨基酸分子中的α–碳原子都為不對稱碳原子。故：氨基酸都具有旋光性。④每種氨基酸都具有D－型和L－型兩種立體異構(gòu)體。目前已知的天然蛋白質(zhì)中的氨基酸都為L-型。7.氨基酸的分類：⑴疏水氨基酸（8種）Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Phe、Trp。⑵極性氨基酸（8種）Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Tyr、Gly。⑶荷電氨基酸（5種）涉及：Asp、Glu（荷負(fù)電）Lys、Arg、His（荷正電）8.在α-螺旋鏈中，遇上pro螺旋就會(huì)中斷，為什么？答：Pro殘基的側(cè)鏈與主鏈N原子形成共價(jià)鍵，使其喪失形成氫鍵的能力，并對α螺旋構(gòu)象產(chǎn)生空間障礙。因此，除螺旋的第一圈外，α螺旋中凡有Pro出現(xiàn)的地方就會(huì)發(fā)生彎折。9.為什么在蛋白質(zhì)中脯氨酸順式肽鍵的出現(xiàn)概率要遠(yuǎn)高于其他氨基酸？答：脯氨酸順式肽鍵與反式肽鍵的能量比為1：4。因此，脯氨酸在蛋白質(zhì)中存在反式和順式兩種肽鍵，而非脯氨酸順式肽鍵在天然蛋白質(zhì)中很少出現(xiàn)，10.如何預(yù)測一段已知α螺旋是否具有兩親性？答：螺旋轉(zhuǎn)輪法，將組成螺旋的氨基酸按100°間隔(360°/3.6個(gè)氨基酸)標(biāo)在螺旋轉(zhuǎn)輪線上，根據(jù)側(cè)鏈在螺旋表面的分布就可以判斷該α螺旋是否具有兩親性。兩親性的α螺旋通常變現(xiàn)為在螺旋轉(zhuǎn)輪線的一側(cè)集中分布疏水氨基酸，而在另一側(cè)集中分布有荷電氨基酸（親水氨基酸）11.強(qiáng)烈傾向于和非常不利于形成α螺旋的AA殘基有哪些？答：⑴強(qiáng)烈傾向于形成α螺旋的AA殘基有：Ala、Glu、Leu和Met。（Ala、Leu、Met是非極性AA，Glu是荷電AA）⑵非常不利于α螺旋形成的AA殘基有：Pro、Gly、Tyr和Ser（Pro是非極性AA，Gly、Tyr、Ser是極性AA）12.β層與α-螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)別：①α螺旋結(jié)構(gòu)的肽鏈?zhǔn)蔷砬陌魻罱Y(jié)構(gòu),而β層結(jié)構(gòu)的肽鏈幾乎是完全伸展的一種折疊形式。②α螺旋是由一條多肽鏈在序列上相近的連續(xù)區(qū)構(gòu)成。β層則是由一條多肽鏈在序列上離得很遠(yuǎn)的(分子內(nèi))或不同多肽鏈(分子間)區(qū)域（即β鏈）組合而成的。③α螺旋在鏈內(nèi)形成氫鍵；β層在相鄰β鏈間形成鏈間氫鍵。④α螺旋有左手和右手兩種類型；β層有β層平行、反平行和混合β層三種。⑤：α螺旋的氨基酸側(cè)鏈位于螺旋的外側(cè)；β層的氨基酸側(cè)鏈交替分布在片層的上下兩側(cè)。13.蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的基本組件有哪些？環(huán)肽鏈涉及哪些結(jié)構(gòu)？β凸起的類型有哪些？答:⑴基本組件：①α-螺旋②β層(平行β層/反平行β層/混合β層)③環(huán)肽鏈(回折/β發(fā)夾/β凸起/Ω環(huán)/無規(guī)則卷曲)⑵環(huán)肽鏈涉及：①回折：a.β轉(zhuǎn)折（也稱β轉(zhuǎn)角，是最常見的回折結(jié)構(gòu)）b.γ轉(zhuǎn)折.②β發(fā)夾③β凸起(β-bulge)：標(biāo)準(zhǔn)型、G1型、寬型、GX型。④Ω環(huán)14.穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力有哪些？答：①疏水作用：是指蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)彼此靠近、聚集，以避開水的現(xiàn)象。②氫鍵和范德華力：范德華力涉及吸引和排斥兩種互相作用力，只有當(dāng)兩個(gè)非極性殘基間處在一定距離時(shí)，作用力才干達(dá)成最大。氫鍵是特殊的分子間或分子內(nèi)的作用力。它是由極性很強(qiáng)的共價(jià)鍵(A-H)上的氫原子跟另一個(gè)鍵上電負(fù)性很強(qiáng)、原子半徑較小的B原子（如F、O、N等）的孤對電子之間互相吸引而成的一種鍵（A－H…B）。③共價(jià)交聯(lián)和離子互相作用④配位鍵：兩個(gè)原子之間有單方面提供共用電子對形成的共價(jià)鍵。蛋白質(zhì)中的金屬離子往往以配位鍵與蛋白質(zhì)連接。15.按結(jié)構(gòu)域可將蛋白質(zhì)分為哪幾類？答：①α型結(jié)構(gòu)：重要由α螺旋組成。如：肌紅蛋白、血紅蛋白等。②β型結(jié)構(gòu)：重要由反平行β層構(gòu)成。如：絲氨酸屬水解酶、免疫球蛋白A等。③α/β型結(jié)構(gòu)：重要是β-α-β模體的組合。如：乳酸脫氫酶、醇脫氫酶等。④α+β型結(jié)構(gòu)：既含α螺旋又含β層，但α螺旋與β層在空間上彼此不混雜，分別處在分子的不同部位，有時(shí)α螺旋和β層分別形成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。如：溶菌酶、嗜熱菌蛋白酶、核酸酶等。⑤無規(guī)則型／富含二硫鍵和金屬離子型：沒有典型的二級結(jié)構(gòu)，或所含二級結(jié)構(gòu)的組成和組織沒有明顯的規(guī)律可循。16.雙層β螺旋的特性：①每圈螺旋由2股β鏈與2段環(huán)鏈區(qū)相間構(gòu)成。②在形成結(jié)構(gòu)域時(shí)這一基本結(jié)構(gòu)單位反復(fù)3次,產(chǎn)生右手纏繞螺旋結(jié)構(gòu)，中間形成疏水內(nèi)核。③包含兩組反復(fù)的9殘基共有序列。17.TIM桶式折疊與上下折疊β桶有什么異同？答：⑴相同點(diǎn)：①都是桶狀結(jié)構(gòu)②最后一股β鏈與第一股β鏈以氫鍵相連。⑵不同點(diǎn)：①模體不同：TIM桶式折疊的模體是β-α-β；上下β桶是連續(xù)的β發(fā)夾模體。②結(jié)構(gòu)域不同：TIM桶屬于α/β型結(jié)構(gòu)域，上下β桶是屬于β型結(jié)構(gòu)域。③結(jié)構(gòu)特性不同：TIM桶是平行β鏈；上下β桶是反平行β鏈。18.試述原核生物蛋白質(zhì)生物合成的過程。答：(一)氨基酸的活化（二）肽鏈合成的起始:（1）原核生物蛋白質(zhì)合成的起始:①起始因子IF-3和IF-1結(jié)合于小亞基。IF-3的作用是促使上一輪蛋白質(zhì)合成的核糖體大小亞基解聚；IF-1的作用是與30S小亞基結(jié)合，增長起始復(fù)合物形成速度。②小亞基16SrRNA序列與SD序列互補(bǔ)配對使小亞基結(jié)合于SD序列（真核生物無SD序列）③甲酰甲硫氨酰-tRNAffMet與起始密碼AUG配對結(jié)合，與GTP結(jié)合的起始因子IF-2也結(jié)合上去，形成30S起始復(fù)合物④GTP水解釋放能量，促使大亞基結(jié)合，形成完整的70S起始復(fù)合物，同時(shí)IF-1、IF-2、IF-3脫離復(fù)合體。（2）真核生物起始階段與原核生物的不同點(diǎn)：①核糖體更大、更復(fù)雜②真核生物mRNA無SD序列，但有5′帽子和3′polyA尾巴③需要帽子結(jié)合蛋白(CBPs)促使小亞基與mRNA結(jié)合④起始因子為eIF，有10種以上（3）注意:①啟動(dòng)過程需消耗1個(gè)GTP。②復(fù)合體含3種RNA、蛋白質(zhì)或(甲酰)甲硫氨酰，無DNA（三）肽鏈的延長:進(jìn)位、轉(zhuǎn)肽、移位。（四）肽鏈合成的終止與釋放：①終止因子RF1辨認(rèn)UAA、UAG或RF2辨認(rèn)UAA、UGA，進(jìn)入核糖體A位。②多肽鏈的釋放③70S核糖體解離19.多肽鏈生物合成的三個(gè)重要環(huán)節(jié)是什么？答：①基因攜帶規(guī)定氨基酸序列的核苷酸三聯(lián)體遺傳密碼。②雙鏈DNA分子的遺傳信息轉(zhuǎn)錄到單鏈信使RNA(mRNA)。③mRNA在核糖體上的翻譯。20.遺傳密碼的性質(zhì)：①讀碼的連續(xù)性②由一種以上密碼子編碼同一個(gè)氨基酸的現(xiàn)象稱為密碼的簡并性。③密碼的擺動(dòng)性：密碼子的專一性重要由第1、2位堿基決定，第3位堿基有較大的靈活性；將第3位堿基的這一特性稱為擺動(dòng)性。④密碼子通用性與例外（1979年發(fā)現(xiàn)人線粒體中AUA、AUU不再編碼Ile，而是起始密碼；AGA、AGG不再編碼Arg，而是終止密碼；UGA不再是終止密碼，而編碼Trp）⑤起始密碼子和終止密碼子：起始密碼子：AUG；終止密碼子：UAA、UAG、UGA21.動(dòng)力學(xué)途徑會(huì)對蛋白質(zhì)對的折疊產(chǎn)生哪些障礙？答：動(dòng)力學(xué)上可以接受的構(gòu)象，并不一定就是能量最低的構(gòu)象，這就有也許使蛋白質(zhì)在折疊過程中陷入具有高位壘的局部低能狀態(tài)，使其達(dá)不到整體能量極小，從而不能形成對的的折疊結(jié)構(gòu)。①中間體通過外露疏水基團(tuán)的聚合②不對的二硫鍵的形成③脯氨酸殘基的異構(gòu)化22.幫助對的折疊的蛋白質(zhì)和酶有哪些？答:①分子伴侶(molecularchaperone)②幫助對的二硫鍵形成的酶（二硫鍵形成酶/二硫鍵異構(gòu)酶）③肽酰脯氨酰異構(gòu)酶（催化脯氨酸殘基Cis-trans異構(gòu)化的酶）23.原核細(xì)胞mRNA的特點(diǎn)：①半衰期短、更新快②許多原核生物mRNA以多順反子形式存在③AUG作為起始密碼；AUG上游7～12個(gè)核苷酸處有一被稱為SD序列的保守區(qū)，16SrRNA3′-末端反向互補(bǔ)而使mRNA與核糖體結(jié)合。24.真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）Poly(A)尾巴的功能：①保護(hù)mRNA②提高了mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性（2）帽子結(jié)構(gòu)功能：①保護(hù)mRNA（使mRNA免遭核酸酶的破壞）②參與肽鏈合成的起始，（被多肽鏈合成的起始因子所辨認(rèn)）③使mRNA能與核糖體小亞基結(jié)合并開始合成多肽鏈25.氨酰-tRNA合成酶的特點(diǎn):(1)專一性：氨酰-tRNA合成酶具有極高的專一性，每種氨基酸至少有一種對其專一的酶，這種酶既辨認(rèn)特異的氨基酸，也辨認(rèn)攜帶該氨基酸的特異tRNA，保證了AA與其特定tRNA的準(zhǔn)確匹配。(2)校對作用：若前面（第1步）形成不對的的氨酰基-AMP-酶絡(luò)合物，在氨酰-tRNA形成時(shí)，氨酰-tRNA合成酶的水解部位可以水解錯(cuò)誤絡(luò)合的氨基酸。原核生物蛋白質(zhì)合成的起始AA是甲酰甲硫氨酸真核生物的起始AA是甲硫氨酸26.多肽鏈生物合成的三個(gè)重要環(huán)節(jié)：①基因攜帶規(guī)定氨基酸序列的核苷酸三聯(lián)體遺傳密碼。②雙鏈DNA分子的遺傳信息轉(zhuǎn)錄到單鏈信使RNA(mRNA)。③mRNA在核糖體上的翻譯。27.蛋白質(zhì)折疊意義：具有生物活性的蛋白質(zhì)都具有特性性的三維結(jié)構(gòu)，一旦這種三維結(jié)構(gòu)遭到破壞，該蛋白質(zhì)的功能活性也就喪失。蛋白質(zhì)工程研究從主線上說，就是從設(shè)定的功能出發(fā)，尋求特性的氨基酸序列，由此導(dǎo)出具有預(yù)期功能的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。故也稱反向生物學(xué)。28.維系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)力：①維系和穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力為非共價(jià)互相作用力:范德華力、靜電互相作用力、氫鍵和疏水互相作用力。②疏水互相作用力是啟動(dòng)蛋白質(zhì)折疊中形成內(nèi)部疏水核心的驅(qū)動(dòng)力。③與氫鍵形成有關(guān)的分子內(nèi)部特定的排列是決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特異性的重要因素。④天然蛋白質(zhì)穩(wěn)定構(gòu)象是在疏水互相作用存在的同時(shí)，最大限度滿足氫鍵的形成而達(dá)成的能量最低狀態(tài)。29.蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)基礎(chǔ)：（1）Anfinsen提出“熱力學(xué)假說”：一級結(jié)構(gòu)決定天然構(gòu)象。（2）天然態(tài)蛋白質(zhì)只有脆弱的穩(wěn)定性。（3）折疊態(tài)蛋白質(zhì)和變性態(tài)蛋白質(zhì)間的能量差重要由焓和熵兩個(gè)因素產(chǎn)生：①焓是由一條多肽鏈的非共價(jià)作用產(chǎn)生，涉及疏水作用、氫鍵、離子鍵等。②熵是多肽鏈產(chǎn)生有序性所需的能量。30.蛋白質(zhì)折疊動(dòng)力學(xué)要解決的最重要問題:①一維多肽鏈在水溶液中是如何折疊成二維乃至蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)②蛋白質(zhì)在作用時(shí)它的三維結(jié)構(gòu)又是如何發(fā)揮其活性的?31.幫助對的二硫鍵形成的有哪兩種酶？其作用是什么？答：①二硫鍵形成酶（Dsb)：催化二硫鍵的對的形成。①二硫鍵異構(gòu)酶（PDI)：可以有效防止二硫鍵的錯(cuò)配和分子間聚合。能使錯(cuò)配的二硫鍵異構(gòu)化，轉(zhuǎn)化為天然結(jié)構(gòu)高活性構(gòu)象蛋白。32.改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的途徑:①同源蛋白模建②突變一系列有結(jié)構(gòu)傾向的氨基酸③從熱力學(xué)第一定律出發(fā)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)33.增長蛋白質(zhì)穩(wěn)定的基本途徑：①減少折疊與非折疊的熵差：a.引進(jìn)二硫鍵：減少非折疊構(gòu)象的最有效方法b.替換Gly或增長Pro：減少非折疊構(gòu)象是提高穩(wěn)定性的又一條有效途徑。②穩(wěn)定α螺旋③填充疏水內(nèi)核34.蛋白質(zhì)工程：⑴蛋白質(zhì)工程的基本目的：以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造，設(shè)計(jì)、構(gòu)建性能比天然蛋白質(zhì)更加優(yōu)良的新型蛋白質(zhì)。⑵蛋白質(zhì)工程的最終目的：是按熱力學(xué)第一定律從頭設(shè)計(jì)一個(gè)氨基酸序列，并使其能折疊成一個(gè)預(yù)期的結(jié)構(gòu)，且具有盼望的功能。（3）蛋白質(zhì)工程的基本途徑：從預(yù)期功能出發(fā)，設(shè)計(jì)盼望結(jié)構(gòu)，尋求與之相相應(yīng)的氨基酸序列，再轉(zhuǎn)譯成核苷酸序列，獲得預(yù)期功能蛋白。（4）中心問題：按盼望結(jié)構(gòu)尋求最適氨基酸序列。35.同源模建：⑴依據(jù)：①序列高度相似的蛋白質(zhì)具有相似的三維結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)比一級結(jié)構(gòu)更保守。②同源蛋白之間具有保守的結(jié)構(gòu)內(nèi)核（分子骨架），差異僅存在分子表面的回折區(qū)。⑵前提條件：①要模建的目的蛋白必須有一個(gè)或多個(gè)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)與模建的目的蛋白序列相似（一般要有30%，最低不低于25％）。②已知結(jié)構(gòu)的相關(guān)蛋白質(zhì)可以作為模建的模板。⑶基礎(chǔ)：①數(shù)據(jù)庫：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、序列數(shù)據(jù)②計(jì)算機(jī)：工作站③分子模擬系統(tǒng)：軟件系統(tǒng)（4）環(huán)節(jié)：①從數(shù)據(jù)庫中通過序列的“對位排列”搜尋具有目的序列的同源序列。②根據(jù)同源序列蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，構(gòu)建目的序列蛋白結(jié)構(gòu)的骨架。③在骨架上布置核心側(cè)鏈。④構(gòu)建環(huán)區(qū)。⑤對模型進(jìn)行修正。⑥評估模型的準(zhǔn)確性。36.蛋白質(zhì)工程的基本途徑：從預(yù)期功能出發(fā)，設(shè)計(jì)盼望結(jié)構(gòu)，尋求與之相相應(yīng)的氨基酸序列，再轉(zhuǎn)譯成核苷酸序列，獲得預(yù)期功能蛋白。37.分離純化蛋白質(zhì)的一般程序：前解決、粗分級、細(xì)分級和結(jié)晶四步。⑴前解決：①材料的清潔；②將蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中提取出來，并保持其天然狀態(tài)，不喪失活性。⑵粗分級：選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒛康牡鞍着c其它雜質(zhì)蛋白分開，獲取粗蛋白。常用的方法有，等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀。⑶細(xì)分級：將粗分級環(huán)節(jié)獲取的粗蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。常用的方法有，凝膠過濾層析、離子互換層析、親和層析、電泳等。有時(shí)還需要這幾種方法聯(lián)合使用才干獲得高純度的蛋白質(zhì)樣品。⑷結(jié)晶：將細(xì)分級獲得的較高純度的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行結(jié)晶。38.分離純化的方法：⑴根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同：①透析和超濾：透析：按照分子大小進(jìn)行分離。分離取決于透析袋截留的分子量②密度梯度離心（速率區(qū)帶離心法/等密度梯度離心法）③凝膠過濾層析⑵根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異：①等電點(diǎn)沉淀②鹽析③有機(jī)溶劑沉淀⑶根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同：①電泳②離子互換層析⑷根據(jù)蛋白質(zhì)專一性不同:親和層析39.區(qū)分L-型和D-型氨基酸的方法：如圖以H為頂點(diǎn)，沿H-Cα鍵方向觀測各組成基團(tuán)的投影，假如從R→N→CO是順時(shí)針方向，則是L-型分子；反之，假如是逆時(shí)針方向，則為D-型。40.（一）疏水氨基酸的側(cè)鏈一般都沒有化學(xué)反映性，其共同的特性是疏于與水互相作用，趨于彼此間或與其他非極性原子互相作用。所有蛋白質(zhì)分子都有一部分這類殘基密集地堆積在內(nèi)部，形成疏水內(nèi)核，這是穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的重要因素。這類殘基的疏水互相作用被認(rèn)為是多肽鏈折疊的原初推動(dòng)力。Pro殘基可對各肽鏈的構(gòu)象產(chǎn)生重要影響。（二）極性氨基酸的側(cè)鏈都具有極性基因，可以是氫鍵的給體或受體，并且有不同限度的化學(xué)反映性。（三）二硫鍵可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。（四）荷電氨基酸的側(cè)鏈在生理?xiàng)l件下都可以解離，使其帶上負(fù)電荷或正電荷。41.肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：①無分枝的長鏈②具有方向性。兩個(gè)末端分別為N端(氨基端)和C端(羧基端)③由“-NH-C-C-”單元的周期性連接，構(gòu)成多肽鏈的主鏈；氨基酸殘基的R基團(tuán)連接在主鏈的Ca上，形成多肽鏈的側(cè)鏈。42.許多α螺旋的一側(cè)重要分布著親水(荷電、極性)基團(tuán)，而另一側(cè)重要集中疏水基團(tuán)，從而具有兩親性.疏水殘基與親水殘基按螺旋旋轉(zhuǎn)周期規(guī)律地相間分布，是產(chǎn)生兩親性的基本因素。一段α螺旋是否具有兩親性的預(yù)測:—螺旋轉(zhuǎn)輪(helicalwheel)法:將組成螺旋的氨基酸按100°間隔(360°/3.6個(gè)氨基酸)標(biāo)在螺旋轉(zhuǎn)輪線上，側(cè)鏈在螺旋表面的分布就一目了然。43.β層的重要特性：①β層可以由同一肽鏈的不同區(qū)域或不同肽鏈的β鏈形成。②β鏈按層排列，呈鋸齒狀結(jié)構(gòu)，靠鏈間氫鍵維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。氫鍵是由相鄰肽鏈上的N-H和C=0之間形成的。③相鄰β鏈的走向可以是平行或反平行的。44.（一）標(biāo)準(zhǔn)β轉(zhuǎn)折有三種類型：I型、Ⅱ型、Ⅲ型。（二）按照發(fā)夾環(huán)區(qū)所含氨基酸殘基的數(shù)量，β發(fā)夾可分為：類型1、類型2、類型3和類型4四類。（三）β凸起：是指β折疊中，一股鏈上有一個(gè)殘基的肽鍵沒有參與和相鄰β鏈間的氫鍵形成（即一股鏈上的兩個(gè)殘基對著另一股鏈上的一個(gè)殘基）致使這部分有所凸起?；窘Y(jié)構(gòu)特性是在兩個(gè)連續(xù)β型氫鍵之間有一個(gè)凸起區(qū)域，一股鏈上的兩個(gè)殘基對著另一股鏈上的一個(gè)殘基。β凸起能對局部側(cè)鏈的取向進(jìn)行嚴(yán)格而專一的調(diào)控，因此經(jīng)常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的活性位置。四種類型：標(biāo)準(zhǔn)型、G1型、寬型、GX型。（1）標(biāo)準(zhǔn)型:常出現(xiàn)于反平行鏈的窄對氫鍵之間，位置1、位置2都有側(cè)鏈，X在β層的同一側(cè)。（2）G1型：出現(xiàn)在反平行鏈的窄對氫鍵之間，特點(diǎn)是位置1總是甘氨酸(故稱G1)，且常與轉(zhuǎn)折結(jié)構(gòu)相連。G1型β凸起在其末端很少有連續(xù)的β結(jié)構(gòu)。（3）寬型：出現(xiàn)在寬對氫鍵之間，構(gòu)象較少制約，氫鍵結(jié)合方式也可有較大變異。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中不常出現(xiàn)。（4）GX型：特點(diǎn)是在X位置上是甘氨酸，可出現(xiàn)在平行鏈中。45.Ω環(huán)：是一類外形與希臘字母Ω相似的環(huán)肽鏈。Ω環(huán)的重要特性：(1)由不超過16個(gè)氨基酸殘基組成的肽段。最常見的是6-8個(gè)殘基組成，尤以8個(gè)氨基酸殘基最多。（2）Ω環(huán)肽段改變了肽鏈的走向，構(gòu)成Ω環(huán)形的首尾兩個(gè)氨基酸殘基間的距離小于10?，最常見的是5-5.5?。46.長環(huán)肽鏈（或稱無規(guī)則卷曲）:長的環(huán)區(qū)肽鏈，?？刹捎脭?shù)種構(gòu)象，從而使其構(gòu)象有相稱的柔性。這類柔性肽鏈的構(gòu)象一般難于測定。生物學(xué)意義：通過這種柔性肽段的運(yùn)動(dòng)，可以將蛋白質(zhì)的活性中心打開，也可以將其關(guān)閉，以適應(yīng)在活性發(fā)揮不同階段的不同立體化學(xué)環(huán)境規(guī)定。長鏈環(huán)一般易受蛋白酶降解，它們經(jīng)常結(jié)合金屬離子(重要是Ca2+)來穩(wěn)定自己并拮抗蛋白酶的襲擊。47.疏水作用從本質(zhì)上說，是一種從高能態(tài)趨于低能態(tài)的自動(dòng)發(fā)生的能量效應(yīng)。疏水內(nèi)核的作用:⑴是蛋白質(zhì)折疊的重要驅(qū)動(dòng)力⑵是天然蛋白質(zhì)穩(wěn)定的基本結(jié)構(gòu)因素48.水分子在穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的作用：①一定量的水分子結(jié)合在蛋白質(zhì)表面的特定位置（大多在荷電或極性側(cè)鏈周邊），對于穩(wěn)定表面?zhèn)孺湹臉?gòu)象和暴露在分子表面的二級結(jié)構(gòu)片段具有重要作用。②少量水分子結(jié)合在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部（有時(shí)是在活性位置），不僅有助于局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，有的還直接參與功能作用。③大量水組成局部有序的介質(zhì)環(huán)境對蛋白質(zhì)的折疊和三維形成具有重要作用。49.蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的意義與作用：⑴意義：①獲得具有特定功能、能滿足人類需要的蛋白質(zhì)。②用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系。⑵作用：①檢查蛋白質(zhì)折疊機(jī)理及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的知識和信息的對的性。②獲得和積累關(guān)于蛋白質(zhì)折疊和結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的信息。50.蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)可分為哪幾類？答：⑴按照改造部位的多寡可分為三類：①小改（或點(diǎn)突變）：少數(shù)殘基的替換?？赏ㄟ^定位突變或化學(xué)修飾來實(shí)現(xiàn)。②中改（或分子拼接）：對來源于不同蛋白的肽段或結(jié)構(gòu)域進(jìn)行拼接組裝。③大改（從頭設(shè)計(jì)）：從頭設(shè)計(jì)全新的蛋白質(zhì)。⑵根據(jù)設(shè)計(jì)層次的不同可分為兩類：①蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)。目的是設(shè)計(jì)出具有特定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。②蛋白質(zhì)功能的分子設(shè)計(jì)。目的是獲得具有特定功能的蛋白質(zhì)。51.蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)考慮的因素：①氨基酸②肽鏈特性③蛋白質(zhì)構(gòu)象的特點(diǎn)④蛋白質(zhì)分子間的作用⑤蛋白質(zhì)分子內(nèi)的作用52.蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)存在的問題：⑴設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)相比缺少結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性及明顯的功能優(yōu)越性.⑵設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)有對的的形貌、顯著的二級結(jié)構(gòu)及合理的熱力學(xué)穩(wěn)定性，但三級結(jié)構(gòu)的擬定性較差.53.蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)層次及設(shè)計(jì)循環(huán)：（1）依蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)可將設(shè)計(jì)分為兩個(gè)層次：①結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)：在未知立體結(jié)構(gòu)的情況下，借助于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的序列信息及生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行的分子設(shè)計(jì)工作。②功能設(shè)計(jì)：在已知立體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，直接將立體結(jié)構(gòu)信息與蛋白質(zhì)功能相關(guān)聯(lián)的高層次的設(shè)計(jì)工作。（2）蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)循環(huán)：運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，建立蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，確立突變位點(diǎn)或區(qū)域以及預(yù)測突變后的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。這對蛋白質(zhì)工程來說是至關(guān)重要的。54.蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)大體涉及的幾個(gè)重要方面：①蛋白質(zhì)來源：真菌、細(xì)胞、動(dòng)物蛋白質(zhì)和植物蛋白質(zhì).②篩選以及純化蛋白質(zhì)。需要進(jìn)行細(xì)致的表征，測定它們的序列、三維結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、生物活性。③專一性突變產(chǎn)物。是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)成敗的關(guān)鍵。一些新技術(shù),如PCR及自動(dòng)化技術(shù)的發(fā)展使各種類型的基因工程變得快速、容易。④計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)。在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)循環(huán)中占有重要位置。建立蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，確立突變位點(diǎn)或區(qū)域以及預(yù)測突變后的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，對蛋白質(zhì)工程是至關(guān)重要的。⑤定位突變。在明確突變位點(diǎn)或蛋白質(zhì)序列應(yīng)改變的區(qū)域后,可以進(jìn)行定位突變。55.蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目的及解決辦法⑴設(shè)計(jì)目的：熱穩(wěn)定性。解決辦法：引入二硫橋，增長內(nèi)氫鍵數(shù)目，改善內(nèi)疏水堆積，增長表面鹽橋⑵設(shè)計(jì)目的：對氧化的穩(wěn)定性。解決辦法：把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser，把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu，把Trp轉(zhuǎn)換為Phe或Tyr⑶設(shè)計(jì)目的：對重金屬的穩(wěn)定性。解決辦法：把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser，把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu替代表面羧基⑷設(shè)計(jì)目的：pH穩(wěn)定性。解決辦法：替換表面荷電基團(tuán)，內(nèi)His、Cys以及Tyr的置換，內(nèi)離子對的置換⑸設(shè)計(jì)目的:提高酶學(xué)性質(zhì).解決辦法:專一性的改變，增長逆轉(zhuǎn)數(shù)(turnovernumber)，改變酸堿度56.蛋白質(zhì)突變體設(shè)計(jì)分環(huán)節(jié):①以蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)擬定突變位點(diǎn)及替換的氨基酸。②運(yùn)用能量優(yōu)化及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)方法預(yù)測修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。③預(yù)測的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較，運(yùn)用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能或功能-穩(wěn)定性相關(guān)知識及理論計(jì)算預(yù)測新蛋白質(zhì)也許具有的性質(zhì)。57.蛋白質(zhì)突變體設(shè)計(jì)時(shí)注意的問題：①擬定蛋白質(zhì)折疊敏感的區(qū)域，涉及帶有特殊扭角的氨基酸、鹽橋、密堆積區(qū)等。②擬定對蛋白質(zhì)功能非常重要的位置。③考察剩余位置對所希望改變的影響。④當(dāng)進(jìn)行互換或插入/刪除殘基是應(yīng)考慮他們對結(jié)構(gòu)特性的影響，如疏水堆積、側(cè)鏈取向、氫鍵、鹽橋等。58.蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)原理：①內(nèi)核假設(shè)。蛋白質(zhì)的獨(dú)特的折疊形式是由蛋白質(zhì)內(nèi)核殘基的互相作用決定；②蛋白質(zhì)內(nèi)部都是密堆積（很少有空穴大到可以結(jié)合一個(gè)水分子或惰性氣體）；③所有內(nèi)部的氫鍵都是最大滿足的（主鏈和側(cè)鏈）④疏水及親水基團(tuán)需要合理的分布在溶劑可及表面及不可及表面，分布代表疏水效應(yīng)的重要驅(qū)動(dòng)力；⑤在金屬蛋白中，配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何，符合對的的鍵長、鍵角及整體的幾何。⑥對于金屬蛋白，大部分派基具有多于一個(gè)與金屬作用或形成氫鍵的基團(tuán)。其余形成圍繞金屬中心的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，這涉及與蛋白質(zhì)主鏈、側(cè)鏈或水分子的互相作用。=7\*GB3⑦最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列。=8\*GB3⑧結(jié)構(gòu)及功能的專一性。形成獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，獨(dú)特的分子間互相作用是生物互相作用及反映的標(biāo)志。實(shí)踐表白這是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)最困難的問題。59.蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中的結(jié)構(gòu)－功能關(guān)系：（一）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)－功能關(guān)系的重要性：⑴蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能：①蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的變異與分子病：例：血紅蛋白異常病變鐮刀狀細(xì)胞貧血?、诙嚯逆湹木植繑嗔雅c蛋白質(zhì)激活：例：胰島素原的激活⑵蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系：①蛋白質(zhì)高級構(gòu)象破壞，功能喪失②空間構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致其生物功能改變：實(shí)例：血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)和輸氧功能（二）定位突變在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究中的作用：⑴根據(jù)結(jié)構(gòu)信息擬定殘基的突變：酪氨酰tRNA合成酶。定位突變研究是結(jié)識專一性及酶催化的基礎(chǔ)。⑵其他實(shí)驗(yàn)方法鑒定功能殘基：HIV-1蛋白酶(人類免疫缺陷病毒蛋白酶)；GM-CSF(鼠和人的粒狀白細(xì)胞大噬菌體激活因子)掃描刪除分析鑒定GM-CSF的重要活性區(qū)域⑶運(yùn)用蛋白質(zhì)同源性鑒定功能殘基：功能殘基（三）突變蛋白質(zhì)構(gòu)象的探測：①溶解性：可作為突變蛋白穩(wěn)定表達(dá)的結(jié)構(gòu)整體性標(biāo)志②Ｘ射線晶體學(xué)及ＮＭＲ譜：可直接提供突變蛋白高分辨率的結(jié)構(gòu)及評估結(jié)構(gòu)整體性。③園二色散法：可提供二級及三級結(jié)構(gòu)的相對變化。④單克隆抗體探測構(gòu)象變化：僅能提供突變蛋白表面的構(gòu)象變化，對分子內(nèi)結(jié)構(gòu)的微小變化無法檢測。（四）結(jié)構(gòu)與功能的容忍度：①蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能對殘基的替換有一定的容忍度，即結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系有一定的穩(wěn)健度。②Fersht等替換了Barnase的所有內(nèi)核殘基。結(jié)果表白23％的突變體保存了酶的活性。③Mathews及其合作者在溶菌酶內(nèi)核中替換多至10個(gè)殘基。實(shí)驗(yàn)證明多重取代的蛋白仍具有活性以及協(xié)同折疊。60.定位突變種類：①插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。②刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。③替換或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。61.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從頭設(shè)計(jì)的中心問題及需要克服的障礙是什么？采用的策略是什么？答：(一）中心問題：設(shè)計(jì)一個(gè)具有穩(wěn)定及獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。(二）克服的障礙：線性聚合鏈的構(gòu)象熵。(三）采用的策略：(1)使互相作用的強(qiáng)度與數(shù)目達(dá)成最大。（理論基礎(chǔ)：分析已知結(jié)構(gòu)的天然蛋白質(zhì)中的二級結(jié)構(gòu)單元）(2)通過共價(jià)交叉連接減小折疊的構(gòu)象熵。62.蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(jì)：⑴蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)⑵蛋白質(zhì)功能的從頭設(shè)計(jì)⑶取得的進(jìn)展：①血紅素結(jié)合蛋白②氧化還原活性蛋白質(zhì)③DNA結(jié)合蛋白④基于蛋白質(zhì)的高分子材料63.（一）計(jì)算機(jī)篩選分：⑴建立側(cè)鏈的旋轉(zhuǎn)構(gòu)象庫⑵把旋轉(zhuǎn)構(gòu)象庫作為輸入，計(jì)算低能序列組合的也許性。（二）運(yùn)用組合庫方法尋找全新蛋白質(zhì)已取得成功的方面有：①α螺旋②β層③單體④自組裝為有序的排列⑤堆積為天然類蛋白質(zhì)⑥超熱穩(wěn)定性⑦結(jié)合輔因子的能力⑧催化活性64.α螺旋設(shè)計(jì)使用的策略：①使用形成螺旋傾向性大的AA殘基，如亮氨酸、谷氨酸或賴氨酸等。②使用合適的基團(tuán)去除端基電荷，防止與螺旋偶極不合適的電荷互相作用。③使用極化或荷電氨基酸引入穩(wěn)定的氫鍵或在螺旋中相隔一圈殘基間的離子互相作用。④使用在螺旋中相隔一圈的殘基間疏水的范德華互相作用。⑤使用芳香-荷電或芳香-疏水的互相作用。65.模板組裝合成蛋白方法的特點(diǎn)是：每條肽鏈顯示最低限度的濃度依賴關(guān)系，但是一旦它們連接到模板上，它們的結(jié)構(gòu)傾向于穩(wěn)定并且不依賴于濃度。66.α4顯著穩(wěn)定性的關(guān)鍵特性：①α-螺旋明顯的兩親性（最重要特性）。②形成明顯的疏水核（重要特性）。③Glu和Lys形成的鹽橋。④螺旋偶極的電荷中和。⑤增長了在螺旋/轉(zhuǎn)折連接處的柔性。67.蛋白質(zhì)的功能設(shè)計(jì)涉及：①通過反向擬合天然蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)新的功能②鍵合及催化的從頭設(shè)計(jì)③在全新蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點(diǎn)④催化活性蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)⑤膜蛋白及離子通道的設(shè)計(jì)⑥新材料的設(shè)計(jì)68.模擬天然離子通道的特點(diǎn)：①單通道②能區(qū)別不同的陽離子。③在毫秒時(shí)間范圍內(nèi)能打開與關(guān)閉通道。④對局部麻醉通道阻塞劑是敏感的。69.Lear等設(shè)計(jì)的離子通道特點(diǎn)：①序列與天然離子通道序列不同②不用模板，是通過自組裝形成圍繞一個(gè)中心親水孔的多聚體③具有天然離子通道的基本特性70.Ghadiri等設(shè)計(jì)的中空納米管新材料的設(shè)計(jì)肽模塊的序列是什么？為什么在酸性條件下能自組裝？答：設(shè)計(jì)肽模塊的序列為：含(Ala-Glu-Ala-Gln)2的環(huán)肽。在酸性條件下（Glu質(zhì)子化不荷電，并形成平面分子間的氫鍵）介質(zhì)的酸化導(dǎo)致環(huán)肽的自組裝。71.如何設(shè)計(jì)兩親的α螺旋或β層？答：①α螺旋的周期是3.6個(gè)AA殘基，因此兩親性α螺旋的AA殘基排列順序?yàn)椋篜（極性）-N（非極性）-P-P-N-N-P-P-N。②β鏈有一個(gè)交替的周期(上-下-上-下-)。因此兩親β鏈的AA殘基排列順序?yàn)椋篜-N-P-N-P-N-P-N。72.序列優(yōu)化方法的內(nèi)容：從隨機(jī)序列S0開始，構(gòu)筑結(jié)構(gòu)模型，計(jì)算能量E0;然后，隨機(jī)選擇兩個(gè)位置產(chǎn)生替換，產(chǎn)生新的序列Sl，建立Sl的模型，計(jì)算能量El。序列從S0轉(zhuǎn)換為Sl是接受或拒絕，應(yīng)根據(jù)蒙特卡羅（Metropolis）概率得出。通過多次反復(fù)，直到體系達(dá)成平衡，能量保持穩(wěn)定。73.能量表達(dá)涉及：⑴內(nèi)坐標(biāo)項(xiàng)（涉及共價(jià)鍵、鍵角、扭角等；通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的記錄分析能產(chǎn)生很好的內(nèi)坐標(biāo)能。）⑵范德華作用項(xiàng)（范德華勢對于蛋白質(zhì)內(nèi)核的設(shè)計(jì)，堆積是非常關(guān)鍵的。依據(jù)范德華勢可以設(shè)計(jì)很好折疊的蛋白質(zhì)）⑶氫鍵項(xiàng)（氫鍵對蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)也是非常重要的，特別是對α螺旋及全序列設(shè)計(jì)）⑷靜電互相作用項(xiàng)（靜電互相作用對擬定專一性是非常重要的。在極端的條件下鹽橋可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)）⑸溶劑效應(yīng)項(xiàng)（溶劑化能可以從溶劑可及表面的改變乘以原子的溶劑化參數(shù)得到。雖然計(jì)算蛋白質(zhì)-溶劑互相作用是非常復(fù)雜和費(fèi)時(shí)的，但在能量函數(shù)中加入溶劑化項(xiàng)將有助于提高蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的理論預(yù)測與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性）⑹熵效應(yīng)項(xiàng)（依賴于折疊的側(cè)鏈熵的改變與可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)目的改變相關(guān)。這種簡樸的熵效應(yīng)模型在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的實(shí)踐中沒有取得成功）等。74.能量優(yōu)化方法有兩類：1、⑴隨機(jī)算法(蒙特卡羅方法和遺傳算法)：①優(yōu)點(diǎn)：能解決組合復(fù)雜的問題，不規(guī)定徹底搜索。遺傳算法有移動(dòng)的性質(zhì)，特別合用于大序列空間的搜索并能克服勢壘。②缺陷：不能保證得到最低能量解。⑵序列-結(jié)構(gòu)空間半隨機(jī)采樣方法(死端消除法和平均值法)：死端消除法：①優(yōu)點(diǎn)：能達(dá)成全局能量最低點(diǎn)（是一種組合搜索，可不斷消除能量高的構(gòu)象）②缺陷：對大的復(fù)雜體系它也許失敗。自洽平均法(SCMF)采用側(cè)鏈的多復(fù)制表達(dá)及復(fù)迭代直到構(gòu)象的概率收斂，該法也不能保證達(dá)成最低能量解75.計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)涉及能量表達(dá)、能量優(yōu)化、側(cè)鏈構(gòu)象的離散化、殘基分類(內(nèi)核、表面、邊界)、功能位點(diǎn)設(shè)計(jì)、專一性、穩(wěn)定性及序列空間的穩(wěn)健性預(yù)測等方面內(nèi)容。76.蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑有哪些？功能基團(tuán)的特異性修飾涉及那些？答：(一)功能基團(tuán)的特異性修飾:①氨基的化學(xué)修飾②羧基的化學(xué)修飾③巰基的化學(xué)修飾；(二)基于蛋白質(zhì)片段的嵌合修飾:①非共價(jià)締合②二硫鍵締合③肽鍵締合——通過酶連接反映形成肽鍵④非天然型共價(jià)締合；77.氨基的化學(xué)修飾:采用某些化合物使蛋白質(zhì)鏈上的氨基發(fā)生改變的方法稱為氨基修飾。⑴多位點(diǎn)取代修飾:①常規(guī)的氨基保護(hù)（可取代α-氨基和ε-氨基，無選擇性）：取代基(物)與氨基共價(jià)結(jié)合將氨基暫時(shí)屏蔽，以防止其他反映試劑對氨基的作用。②亞氨代乙?；揎棧ㄓ休^高的選擇性，取代側(cè)鏈ε-氨基）亞氨代乙?；从晨蓞^(qū)分α-氨基和ε-氨基。被亞氨代乙酰基取代的氨基仍可解離，但pK值稍高。⑵單一或限制性修飾78.羧基的化學(xué)修飾:采用某些化合物使蛋白質(zhì)鏈上的羧基發(fā)生改變的方法稱為羧基修飾:(1)多位點(diǎn)取代修飾:羧基的甲酯化：羧基的甲酯化反映，可以在室溫下（將蛋白質(zhì)加入到具有乙酰氯的無水甲醇中）完畢。(2)單一或限制性修飾:①C末端羧基的酰肼化修飾②C末端羧基的醛基化修飾③C末端羧基的酰胺化修飾（產(chǎn)物是肽的α-酰胺）79.化學(xué)修飾的條件及其影響：溫和的反映條件是防止蛋白質(zhì)分子變性的一個(gè)必要條件。影響：①pH值的變化：決定了具有潛在反映能力的基團(tuán)所處的離子狀態(tài)（可反映或不可反映）。②溫度：影響活性巰基的微環(huán)境。③有機(jī)溶劑：試劑需要有機(jī)溶劑來助溶，但有機(jī)溶劑可使蛋白質(zhì)變性。80.多肽締合的方法重要有：①非共價(jià)締合②二硫鍵締合③肽鍵締合④非天然型的共價(jià)締合81.蛋白質(zhì)修飾的分子生物學(xué)途徑:⑴編碼基因的專一性位點(diǎn)和區(qū)域性定向突變⑵基因融合和基因剪接⑶tRNA介導(dǎo)定點(diǎn)摻入非天然氨基酸82.(一)定位突變：①在已知DNA序列中的特定位點(diǎn)取代、插入或缺失一定長度的核苷酸片斷。②優(yōu)點(diǎn)：突變率高、簡樸易行、反復(fù)性好③方法：寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變及盒式突變④應(yīng)用：基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究；讀基因調(diào)控機(jī)理研究；疾病的病因和機(jī)理研究。（二）隨機(jī)突變：①在特定編碼序列的多個(gè)位點(diǎn)上產(chǎn)生隨機(jī)的突變體②優(yōu)點(diǎn)：在體外模擬自然進(jìn)化的過程③方法：易錯(cuò)PCR、基因家族改組技術(shù)等83.寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變：（1）概念：是指用品有突變堿基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下啟動(dòng)DNA分子進(jìn)行復(fù)制的過程。（2）幾種常用突變方法：①Kunkel突變法②基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變法③PCR(聚合酶鏈反映)法的定點(diǎn)突變84.試述PCR產(chǎn)生基因中心區(qū)定點(diǎn)突變的原理。答：通過重疊延伸PCR技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。重疊延伸過程的依據(jù)：加到PCR引物5?端的核苷酸序列摻入到PCR產(chǎn)物末端。通過加上適當(dāng)?shù)男蛄?，一個(gè)PCR的擴(kuò)增片段可與另一個(gè)PCR擴(kuò)增片段上的序列互相重疊。這樣在其后的反映中，這段重疊序列可以作為引物被DNA聚合酶所延伸，由此而產(chǎn)生一個(gè)新的重組分子。85.什么是盒式突變？其必須滿足的兩個(gè)關(guān)鍵條件是什么？答：盒式突變是運(yùn)用一段人工合成的含基因突變序列的DNA片段，取代目的基因（野生型或化學(xué)合成的）中的相應(yīng)序列。①目的基因中要有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶辨認(rèn)位點(diǎn)。作用：使盒式突變序列能有效地插入目的基因。②突變序列的兩端具有與目的基因上相匹配的限制性內(nèi)切酶辨認(rèn)位點(diǎn)。作用：保證盒式突變序列的對的插入方向。86.盒式突變的環(huán)節(jié)：①將克隆片斷用限制性內(nèi)切酶切割。②將合成的寡核苷酸片斷與酶切后的克隆片斷混合。③產(chǎn)生突變基因產(chǎn)物。87.試對Kunkel突變法、PCR法、盒式突變?nèi)N定點(diǎn)突變方法作一比較。答：（1）Kunkel突變法：①優(yōu)點(diǎn)：保真度比PCR突變法高。②缺陷：操作過程復(fù)雜、周期長，待突變位點(diǎn)會(huì)受到限制性酶切位點(diǎn)的限制。（2）PCR方法：①優(yōu)點(diǎn)：操作簡樸，突變成功率達(dá)100%。②缺陷：后續(xù)工作復(fù)雜，要與載體相連；TaqDNA聚合酶保真性低，要分析序列。（3）盒式突變：①優(yōu)點(diǎn)：簡樸、突變效率高。②缺陷：合成多條引物的成本較高。88.（一）基因融合的作用：①避免外源蛋白的快速降解，特別是小肽。②使表達(dá)產(chǎn)物快速、有效的回收與純化。③使表達(dá)的外源蛋白質(zhì)定向地定位在宿主細(xì)胞的不同區(qū)位。（如與分泌信號肽的融合）4、④是獲得天然蛋白的可靠和可反復(fù)性的方法。（先同特定蛋白形成融合蛋白，然后再通過體外切割去除融合部分，即可獲得天然序列的外源蛋白質(zhì)分子）⑤改變外源蛋白的溶解性，防止包涵體的形成。⑥基因融合是對基因進(jìn)行改造的手段，廣泛用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的研究。（二）基因融合的方法：①將重組基因直接剪接于適當(dāng)?shù)男盘栯闹螅詈啒愕娜诤戏绞?。?yōu)點(diǎn)：產(chǎn)生的重組蛋白可具有天然的N末端。②將外源基因自身按閱讀框架自我融合，這種方式對一些小肽的穩(wěn)定表達(dá)特別重要。③目的蛋白在與其融合的蛋白伙伴序列的C端或N端融合。C端融合的優(yōu)點(diǎn)：啟動(dòng)子和翻譯起始信號都處在基因的5′端，因此在3′端所進(jìn)行的基因融合并不改變本來的啟動(dòng)子和翻譯起始信號，目的基因的表達(dá)水平可預(yù)測。N端融合的缺陷：目的基因產(chǎn)物特異性的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始元件必須在其5′端設(shè)計(jì)好。④分泌-親和融合。此法是將分泌和親和純化的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，即N端為信號肽，然后是融合蛋白伙伴(用于親和分離)，再接目的基因。⑤雙親和融合法。即將目的基因X與兩個(gè)異源結(jié)構(gòu)域A、B（分別對兩個(gè)不同配基有特異性親和），以A-X-B的形式進(jìn)行融合。這為以后的親和純化提供了方便。⑥分泌-插入融合法。此法是將目的基因插入到信號肽序列和一個(gè)插入序列之間，該插入序列是可插入到細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的蛋白編碼。目的是將受體或抗原定位于細(xì)胞的外表面或裝配成融合蛋白進(jìn)入類病毒顆粒。這對于開發(fā)疫苗或產(chǎn)生具免疫原的復(fù)合物是故意義的。89.產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子嵌合體的方法有哪些？答：（1）基因水平的方法：①基因剪接：若兩個(gè)蛋白質(zhì)基因序列間有合適的、相容的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，可以通過將不同的編碼序列經(jīng)酶切后再用連接酶相連，形成一個(gè)首尾閱讀框?qū)Φ牡闹亟M蛋白質(zhì)基因，然后通過基因工程手段進(jìn)行表達(dá)，獲取嵌合蛋白。②基因突變：假如相連的蛋白質(zhì)分子編碼序列間存在額外的堿基序列，可以通過產(chǎn)生缺失突變的方法去除。然后通過基因工程手段進(jìn)行表達(dá)，獲取嵌合蛋白。③PCR重疊延伸法：不需要分子間具有相容的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，就可以將兩個(gè)編碼不同蛋白的DNA分子重組到一起，形成DNA分子嵌合體。a.雙側(cè)重疊延伸b.單側(cè)重疊延伸（2）蛋白質(zhì)水平的方法—蛋白質(zhì)內(nèi)含肽（或內(nèi)含子）介導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子間的連接，內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接過程：①在剪接體的上游，內(nèi)含肽（或內(nèi)含子）的N端殘基半胱氨酸（Cys1）的側(cè)鏈發(fā)生N→S轉(zhuǎn)移（或?；嘏牛纬删哂袔€酯鍵。②通過C端外部肽的半胱氨酸（Cys）巰基親核襲擊上游剪切處的羰基碳原子，導(dǎo)致N端外部肽轉(zhuǎn)移到C端外部肽第一個(gè)殘基的側(cè)鏈上。③內(nèi)含肽C末端剪切處的天冬酰胺環(huán)化形成琥珀酰亞胺和通過酯鍵連接的兩個(gè)外部肽。④琥珀酰亞胺水解，連接兩個(gè)外部肽之間的酯鍵發(fā)生S→N轉(zhuǎn)移（或酰基重排），產(chǎn)生自然穩(wěn)定的肽鍵。90.tRNA介導(dǎo)的非天然氨基酸摻入：非天然氨基酸定點(diǎn)摻入的基本過程：①將目的蛋白質(zhì)的基因重組入可用于體外轉(zhuǎn)錄的載體中。②運(yùn)用寡核苷酸介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性突變，將特定氨基酸的密碼子突變?yōu)闊o義密碼（TAG）。③運(yùn)用runoff轉(zhuǎn)錄或化學(xué)/酶法反密碼子環(huán)取代法合成相應(yīng)的校正tRNA，將氨基酸連接在校正tRNA上。④通過體外轉(zhuǎn)錄體系，產(chǎn)生在特定位點(diǎn)突變成UAG的mRNA。⑤通過體外翻譯體系，將非天然氨基酸摻入到蛋白質(zhì)分子中的特定位點(diǎn)。91.操縱子特點(diǎn)：①原核生物基因表達(dá)的基本單位（即一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位）。②共同協(xié)調(diào)作用，完畢某一多肽的表達(dá)調(diào)控。③涉及：調(diào)控區(qū)(調(diào)節(jié)基因，啟動(dòng)基因，操縱基因)、結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子特點(diǎn)：①一般長40-60bp，富含A-T堿基對②具有保守序列：-10區(qū)（pribnowbox）：TATAAT，-35區(qū)：③RNA聚合酶辨認(rèn)并結(jié)合啟動(dòng)子，但并不開始轉(zhuǎn)錄④各種啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄能力不同。⑤啟動(dòng)子強(qiáng)弱取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列四、論述：1.試述蛋白質(zhì)工程的基本程序。答：（一）一方面分離純化0.1—1.0mg純蛋白質(zhì)，測定其部分肽段的一級結(jié)構(gòu)，根據(jù)編碼原則合成相應(yīng)同位素標(biāo)記的寡核苷酸探針。以此從基因文庫中釣?。ɑ蚍Q篩選）編碼該蛋白質(zhì)的克隆化基因，轉(zhuǎn)入噬菌體M13系統(tǒng)克隆，并分離其突變體，然后進(jìn)行DNA序列分析。通過表達(dá)載體獲得較大量的純化的突變蛋白質(zhì)。（二）運(yùn)用獲得的純化突變蛋白質(zhì)，一方面進(jìn)行分子性質(zhì)測試，以指導(dǎo)進(jìn)一步分子設(shè)計(jì)；另一方面用于空間結(jié)構(gòu)模型的建立及結(jié)構(gòu)與功能研究，借助計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)提出蛋白質(zhì)分子預(yù)測性質(zhì)及定向改造方案。（三）通過寡核苷酸M13系統(tǒng)定點(diǎn)誘變并分離其新改造的突變體，引入表達(dá)載體生產(chǎn)并純化多量突變蛋白，分析其性質(zhì)，指導(dǎo)進(jìn)一步分子設(shè)計(jì)，以最終獲得所預(yù)期性質(zhì)的蛋白質(zhì)分子。2.目前蛋白質(zhì)工程常用的宿主表達(dá)系統(tǒng)有哪些?各有何優(yōu)缺陷?答：⑴細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)（重要是大腸桿菌）：①優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)方法簡樸、增殖快、生產(chǎn)成本低。②缺陷：缺少真核細(xì)胞所具有的復(fù)雜的翻譯后加工修飾（如N-末端起始氨基酸的切除、糖基化、烷基化、磷酸化、特異性的蛋白質(zhì)水解加工等）；并且在菌體中表達(dá)的外源蛋白，在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定，易被菌體蛋白酶破壞。③合用于不需要翻譯后加工修飾就能保持其生物活性的蛋白質(zhì)。⑵酵母表達(dá)系統(tǒng)（一個(gè)重要的真核表達(dá)系統(tǒng)）：①優(yōu)點(diǎn)：既具有原核細(xì)胞增殖快、操作簡樸、成本低的優(yōu)點(diǎn)，又能同其他真核細(xì)胞同樣完畢對蛋白質(zhì)翻譯后的加工修飾，也能進(jìn)行誘導(dǎo)性分泌。②缺陷：具有活化的蛋白水解酶類，可降解異體蛋白質(zhì)，使產(chǎn)品產(chǎn)量減少。⑶昆蟲表達(dá)系統(tǒng)：①優(yōu)點(diǎn)：是能較高水平地表達(dá)不同動(dòng)物來源的基因，可以胞內(nèi)表達(dá)，也可以進(jìn)行分泌性表達(dá)，可以有效地進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后加工。②缺陷：重要是不能連續(xù)合成重組蛋白。（由于重組病毒感染昆蟲細(xì)胞或昆蟲幼蟲4~5天后，細(xì)胞就裂解，幼蟲即死亡)⑷哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：①優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)真核基因比其它表達(dá)系統(tǒng)更優(yōu)越，能對蛋白質(zhì)進(jìn)行各種類型的加工和修飾，還能表達(dá)有功能的膜蛋白及分泌性蛋白。②缺陷：對組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)規(guī)定高，培養(yǎng)和篩選細(xì)胞株的周期長，成本較高。3.蛋白質(zhì)α-螺旋和β層的重要特性各有哪些？答：⑴α-螺旋重要特性：①肽鏈的主鏈繞中心軸形成規(guī)則的螺旋結(jié)構(gòu)。Φ=-57°和ψ=-47°,位于拉氏構(gòu)象圖的第三象限最大允許區(qū)中。②每圈螺旋具有3.6個(gè)AA殘基，每個(gè)氨基酸殘基沿螺旋中心軸上升0.15nm,沿軸旋轉(zhuǎn)100°。故螺距（即每圈高度）為0.54nm。③相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵，氫鍵的取向幾乎與中心軸平行。④螺旋中心是沒有空腔的原子密堆積結(jié)構(gòu)。⑤α-螺旋中所有氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)都伸向外側(cè)⑥α-螺旋有右手和左手螺旋兩種。但天然蛋白質(zhì)中絕大多數(shù)是右手螺旋,左手螺旋只在少數(shù)蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。⑵β層的重要特性：①β層可以由同一肽鏈的不同區(qū)域或不同肽鏈的β鏈形成。②β鏈按層排列，呈鋸齒狀結(jié)構(gòu)，靠鏈間氫鍵維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。氫鍵是由相鄰肽鏈上的N-H和C=0之間形成的。③相鄰β鏈的走向可以是平行或反平行的。④β鏈氨基酸殘基的側(cè)鏈（R）交替分布在片層的上下兩側(cè)。4.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)涉及哪些層次？答:（一）一級結(jié)構(gòu)：是多肽鏈中氨基酸殘基從N-末端到C-末端的排列順序及二硫鍵的位置。（二）二級結(jié)構(gòu)：是指多肽鏈主鏈借助氫鍵排列成特有的規(guī)則的反復(fù)構(gòu)象。它不涉及側(cè)鏈的構(gòu)象和與多肽鏈其他部分的關(guān)系。常見的二級結(jié)構(gòu)涉及：α螺旋、β層、β轉(zhuǎn)折、β凸起、310螺旋等。它們是蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的重要組件。主鏈氫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的重要作用力。（三）超二級結(jié)構(gòu)（結(jié)構(gòu)模體）：一級順序上相鄰的二級結(jié)構(gòu)在三維折疊中，彼此靠近、按特定的幾何排布形成排列規(guī)則的、在空間結(jié)構(gòu)上可以辨認(rèn)的、可以同一結(jié)構(gòu)模式出現(xiàn)在不同蛋白質(zhì)中的二級結(jié)構(gòu)組合體，稱為結(jié)構(gòu)模體。結(jié)構(gòu)模體是三級結(jié)構(gòu)的建筑模塊，但多數(shù)模體并不具生物功能。類型：（1）螺旋-轉(zhuǎn)折-螺旋模體：DNA結(jié)合模體和鈣結(jié)合模體，是具有特定功能的最簡樸的模體。（2）發(fā)夾式β模體（或ββ組合單位）：兩段相鄰的反平行β鏈被一環(huán)鏈連接在一起構(gòu)成的組合單位，其形貌與發(fā)夾相似，稱為發(fā)夾式β模體。特性：①在反平行β結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)最多。②可作為單獨(dú)的組合單位存在，也可以是更為復(fù)雜的β層的一部分。③在序列上相鄰的β鏈都強(qiáng)烈地傾向于形成這種模體，其β鏈間的環(huán)鏈長度大多由2～5個(gè)AA殘基構(gòu)成。④沒有特定的功能與模體相關(guān)聯(lián)。（3）希臘鑰匙模體：四段緊鄰的反平行β鏈以特定的方式來回往復(fù)組合，其形貌類似于古希臘鑰匙上特有的回形裝飾紋，故稱為希臘鑰匙型模體，也稱反平行β層回紋模體。該模體并不與特定的功能相關(guān)。（4）β-α-β模體:是序列上連續(xù)、相鄰的兩股平行β鏈和一段α螺旋連接而形成的組合。（四）結(jié)構(gòu)域：二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)模體以特定的方式組織連接，在蛋白質(zhì)分子中形成兩個(gè)或多個(gè)在空間上可以明顯區(qū)分的三級折疊實(shí)體，稱為結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)可以由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，也可以由多個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。特性：①結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的基本單位，它可由一條多肽鏈(在單域蛋白質(zhì)中)或多肽鏈的一部分(在多域蛋白質(zhì)中)獨(dú)立折疊形成。②一個(gè)分子中的結(jié)構(gòu)域之間以共價(jià)鍵相連接，這是與蛋白質(zhì)亞基結(jié)構(gòu)(非共價(jià)締合)的基本區(qū)別。③一般來說，較大的蛋白質(zhì)都有多個(gè)結(jié)構(gòu)域存在，它們可以以不同的方式組合，從而以有限的結(jié)構(gòu)域類型組合成極為復(fù)雜多樣的蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)。④結(jié)構(gòu)域是功能單位，不同的結(jié)構(gòu)域經(jīng)常與蛋白質(zhì)的不同功能相關(guān)聯(lián)。（五）三級結(jié)構(gòu)：在二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)模體的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步盤曲、折疊形成的，涉及主鏈、側(cè)鏈在內(nèi)的所有原子和基團(tuán)的空間排布。特點(diǎn)：①具有多種二級結(jié)構(gòu)元件。②具有明顯的折疊層次。③是緊密的球狀或橢球狀實(shí)體；分子內(nèi)空腔很小。④疏水側(cè)鏈多埋藏在分子內(nèi)部；親水側(cè)鏈多暴露在分子表面。⑤分子表面往往有一空穴，周邊分布著疏水側(cè)鏈，是其行使功能的活性部位。（六）四級結(jié)構(gòu)：是指在多條肽鏈組成的一個(gè)蛋白質(zhì)分子中，各亞單位在寡聚蛋白質(zhì)中的空間排布及亞單位間的互相作用。蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)的類型：（1）按亞基的種類分類：可將四級結(jié)構(gòu)分為相同亞基構(gòu)成和不同亞基構(gòu)成兩大類型。由相同亞基構(gòu)成的多聚體稱為同源多聚體，由不相同亞基構(gòu)成的多聚體稱為異源多聚體（2）按亞基的數(shù)目分類：可將四級結(jié)構(gòu)分為低聚體和多聚體兩大類。在低聚體中，亞基多數(shù)緊密堆積，呈現(xiàn)球形結(jié)構(gòu)。在多聚體中，亞基的堆積可以有多種結(jié)構(gòu)，如：線性結(jié)構(gòu)、空心的球狀多面體結(jié)構(gòu)、棒狀結(jié)構(gòu)、網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)等。（3）按裝配機(jī)制分類：可將四級結(jié)構(gòu)分為隨機(jī)裝配和成核裝配兩大類。一般寡聚體的裝配過程是幾個(gè)亞基隨機(jī)碰撞，在裝配過程中可以出現(xiàn)多種中間狀態(tài)。核裝配的裝配過程則是幾個(gè)亞基一方面形成類似于結(jié)晶過程中晶核的裝配核心，然后再快速地聚集裝配。成核裝配過程是先激活，然后成核，最后聚集裝配。屬于這種裝配類型的蛋白質(zhì)一般亞基數(shù)目都很大。5.α型結(jié)構(gòu)、β型結(jié)構(gòu)、α/β型結(jié)構(gòu)又可分為哪些亞類？答：（一）α型結(jié)構(gòu)的分類：（1）線繞式α螺旋：是指兩股α螺旋彼此纏繞，像兩股線纏繞成一股繩索似的超盤繞排布。線繞式α螺旋是纖維蛋白的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，有足夠的強(qiáng)度和柔性。線繞式α螺旋結(jié)構(gòu)特性：每圈包含3.5個(gè)AA殘基。特點(diǎn)：①序列上存在七聯(lián)反復(fù)體。②每經(jīng)7個(gè)殘基(2圈螺旋)后側(cè)鏈的互相作用就完全反復(fù)。（2）四螺旋束：是α蛋白中最常見的一種域結(jié)構(gòu)。它是由四股螺旋排布成一束狀結(jié)構(gòu)，其間各段螺旋的軸向近似平行，稱為四螺旋束結(jié)構(gòu)。（3）珠狀折疊：是由8段α螺旋(通常標(biāo)記為A～H)的組合，彼此被短環(huán)鏈區(qū)連接，螺旋通過特定的空間排布形成活性位置。是最重要的一類α域結(jié)構(gòu)。它們存在于一大組相關(guān)蛋白質(zhì)中，涉及肌紅蛋白、血紅蛋白、藻類中的捕光組裝體(藻藍(lán)蛋白)等。（4）復(fù)雜螺旋組合。③④⑤⑥③④⑤⑥（二）β型結(jié)構(gòu)分類:（1）上-下β桶式：上-下β桶式的結(jié)構(gòu)特性：β鏈以反平行的上-下方式順序連接，最后一股鏈與第一股鏈以氫鍵結(jié)合，形成一個(gè)類似桶狀的結(jié)構(gòu)。（2）上-下開放式β層：結(jié)構(gòu)特性：由四個(gè)反平行β鏈組合成的開放型模體，其間的β鏈?zhǔn)孜膊环忾]成桶狀。（3）希臘鑰匙(回紋)式折疊：結(jié)構(gòu)特性：①β鏈以反平行方式折疊成兩個(gè)分開的β層，它們彼此堆積形成一個(gè)變形的圓桶狀。②其間β鏈1、2、3、4和5、6、7、8分別形成希臘鑰匙形(回紋)模體，故稱為希臘鑰匙式β桶。（4）平行β螺旋折疊可分為兩種：1）雙層β螺旋：特性：①每圈螺旋由2股β鏈與2段環(huán)鏈區(qū)相間構(gòu)成。②在形成結(jié)構(gòu)域時(shí)這一基本結(jié)構(gòu)單位反復(fù)3次,產(chǎn)生右手纏繞螺旋結(jié)構(gòu)，中間形成疏水內(nèi)核。③包含兩組反復(fù)的9殘基共有序列。2）三層β螺旋：特性：①每圈螺旋具有三段含3～5個(gè)殘基的短β鏈，彼此由環(huán)鏈連接。近似呈三棱柱。②沒有特性序列模式(由于在三層β螺旋結(jié)構(gòu)環(huán)鏈區(qū)的長度、每圈所含氨基酸的數(shù)量和性質(zhì)都不相同，所以無法用特性序列模式探測這種結(jié)構(gòu)的存在）。③螺旋內(nèi)部既有疏水基團(tuán)也有極性和荷電基團(tuán)，彼此以氫鍵或靜電互相作用。④長環(huán)鏈也許形成蛋白質(zhì)分子的活性位置。（三）α/β型（1）結(jié)構(gòu)特性：①以平行的或混合的β層為中心四周邊繞α螺旋。②由β-α-β模體組成。（2）分類:1）TIM桶式折疊2）開放扭轉(zhuǎn)式折疊特性一個(gè)開放的扭轉(zhuǎn)β層兩側(cè)被α螺旋圍繞?；钚灾行牡奈恢迷讦聦郁然诵纬傻目p隙，幾乎是所有這類蛋白的結(jié)合位置。3）馬蹄式折疊：特性：①所有α螺旋都位于β層一側(cè)，形成一個(gè)類似馬蹄狀的彎曲開放結(jié)構(gòu)，α螺旋在外側(cè)，β層則構(gòu)成馬蹄的內(nèi)壁。②β層的一側(cè)面對α螺旋，參與α螺旋與β層之間疏水核的形成，另一面暴露在溶劑中。6.蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)流程：（1）當(dāng)我們開始對某一天然蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)時(shí)，一方面1b.要查找PDB（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫）了解這個(gè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是否已被收錄。假如PDB中沒有收錄又未見文獻(xiàn)報(bào)道，我們需要通過蛋白質(zhì)X射線晶體學(xué)及NMR方法測定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，或者1a.運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)預(yù)測蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。（2）構(gòu)建該蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型。（3）依據(jù)已構(gòu)建的天然蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，分析結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。（4）以天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系為基礎(chǔ)，從數(shù)據(jù)庫搜索并進(jìn)行蛋白質(zhì)突變體設(shè)計(jì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測。（5）幾何優(yōu)化及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)研究幾何優(yōu)化，評價(jià)的是蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的合理性。進(jìn)行結(jié)構(gòu)模型的立體化學(xué)參數(shù)檢測：鍵長、鍵角、非鍵合原子的接觸距離等，是否在正常范圍內(nèi)，是否違反化學(xué)規(guī)律。分子動(dòng)力學(xué)分析，評價(jià)的是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)分子的生物活性構(gòu)象是構(gòu)象空間能量較低的幾個(gè)構(gòu)象之間的平衡狀態(tài)，具有一定的穩(wěn)定性。因此，可以在一定條件下做分子動(dòng)力學(xué)模擬，查看蛋白質(zhì)分子的原子隨時(shí)間的變化趨勢。（6）對突變體蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析并與原先的結(jié)果進(jìn)行比較（需反復(fù)進(jìn)行，第一次與天然蛋白質(zhì)比較，以后可以與天然蛋白質(zhì)或突變體進(jìn)行比較。修改設(shè)計(jì)）。（7）合成定位突變的蛋白質(zhì)。（8）對合成的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、純化及表征。（9）獲取新蛋白質(zhì)。7.蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)的手段有哪些？答：⑴二級結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝：①優(yōu)點(diǎn)：設(shè)計(jì)和合成都比較簡樸②缺陷：a.蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性b.是二級結(jié)構(gòu)的簡樸反復(fù)c.模塊設(shè)計(jì)模擬了天然蛋白質(zhì)共同的結(jié)構(gòu)與熱力學(xué)特性，是蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)的一個(gè)重要手段。⑵配體誘導(dǎo)組裝：配體誘導(dǎo)組裝是將配位結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)在結(jié)構(gòu)中幾個(gè)互相作用片斷的界面處；假如這個(gè)位點(diǎn)對配體有很高的親和力，則結(jié)合配體的合適的自由能將充足克服熵消耗，并驅(qū)動(dòng)肽的自組裝。⑶通過共價(jià)交叉連接實(shí)現(xiàn)肽的自組裝：①設(shè)計(jì)全新蛋白的重要障礙是肽鏈的構(gòu)象熵。當(dāng)幾個(gè)沒有連接的肽鏈進(jìn)行自組裝時(shí)，熵勢壘是比較難以克服的。但通過共價(jià)交叉連接可以減少構(gòu)象熵（因素是肽鏈交叉連接限制了鏈彼此間的位置，減小了形成獨(dú)特構(gòu)象的熵消耗）②自然界唯一用于交叉連接的方法是二硫鍵。在全新蛋白設(shè)計(jì)中也可以使用其他種類的新的交叉連接方法，如人工連接片段等。⑷在合成模板上肽的組裝：①模板組裝合成蛋白的方法（TASPs）:是用人工合成模板代替天然蛋白中的turn和loops連接二級結(jié)構(gòu)的單元。②TASPs的特點(diǎn)：每條肽鏈顯示最低限度的濃度依賴關(guān)系但是一旦它們連接到模板上，它們的結(jié)構(gòu)傾向于穩(wěn)定并且不依賴于濃度。③模板：是寡肽（如：乙酰基-Cys-Lys-Ala-Lys-Pro-Gly-Lys-Ala-Lys-Cys-酰胺）。該模板通過一個(gè)Pro-Gly轉(zhuǎn)折和另一端的一個(gè)二硫鍵形成兩個(gè)反平行β鏈。該模板因有一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此構(gòu)象及側(cè)鏈的取向比較擬定。模板中4個(gè)Lys側(cè)鏈的ε-氨基是二級結(jié)構(gòu)單元的連接位點(diǎn)。⑸線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)⑹基于組合庫的全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)：①組合庫設(shè)計(jì)應(yīng)考慮的問題:a.核心問題：埋藏疏水部分，優(yōu)化疏水核②優(yōu)化二級結(jié)構(gòu)單元間的界面。③基于二元模式設(shè)計(jì)的α螺旋組合庫④基于二元模式設(shè)計(jì)的β層組合庫8.試述Kunkel突變法和基于抗生素抗性“回復(fù)”突變法的基本環(huán)節(jié)？答：（1）Kunkel突變法：①將待突變基因克隆到突變載體（M13噬菌體DNA)上。②導(dǎo)入具有dUTP酶(dut)和尿嘧啶-N-糖基化酶雙缺陷的大腸桿菌菌株中培養(yǎng)，制備含U的單鏈模板DNA。（模板DNA中大約1％的T被U取代）③合成DNA的另一鏈：在DNA聚合酶的催化下,5′端磷酸化的突變寡核苷酸引物以單鏈DNA為模板合成互補(bǔ)鏈,而后由連接酶封閉缺口,產(chǎn)生閉環(huán)的雙鏈DNA分子。④將雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)染野生型大腸桿菌，模板鏈被降解（尿嘧啶-N-糖基化酶降解尿嘧啶），突變鏈因不含U被保存下來。⑤序列分析擬定突變體。（2）基于抗生素抗性“回復(fù)”的突變法：①將目的基因克