植物生理學實驗

植物生理學實驗..植物生理是實踐性很強的學科，學生必需通過實驗、實習才能加深對理論課的理解，并為后續(xù)專業(yè)課的學習打好基礎，同時，通過實驗、實踐可以提高學員觀察問題和解決問題的能力，提高學員的動手能力及獨立思考、分析問題的能力；在實驗課中要通過實例論述論證，讓學生認識到實驗的重要性，培養(yǎng)學生對實驗課的興趣；系統(tǒng)介紹植物生理的一般研究方法和基本技術；一、植物生理學實驗的基本要求

重視培養(yǎng)學生的實際操作技能，不片面追求實驗數(shù)據(jù)的準確性，培養(yǎng)學生實事求是的科學態(tài)度。對一些不能開設的實驗，通過演示實驗的方式，拓寬學生視野，完善實驗內(nèi)容。學生都應參加實驗實習環(huán)節(jié)，選作部分實驗，了解植物生理的主要測試技術，在教師的指導下，獨立或團隊操作，完成實驗內(nèi)容并用所學的知識，綜合分析，寫出實驗報告，解釋有關現(xiàn)象并討論實驗結(jié)果。實驗課程單獨考核，單獨記成績。一、植物生理學實驗的基本要求二、植物生理學實驗的目錄實驗一種子生活力的快速測定--------------------------4學時實驗二小藍子法測定植物的呼吸速率-------------------4學時實驗三葉綠素a、b含量的測定---------------------------4學時實驗四植物抗逆性的鑒定（電導儀法、丙二醛含量的測定、植物根系POD活性的測定）------------------------------------12學時實驗五改良半葉法測定植物光合速率（選做）--------4學時實驗六谷類種子萌發(fā)時淀粉酶活性的測定（選做）--4學時實驗一植物種子生活力的快速測定

(TTC法、染料染色法)種子生活力：是指種子能夠萌發(fā)的潛在能力或種胚具有的生命力。沒有生活力的種子是死亡的種子，不能萌發(fā)。種子壽命：種子從發(fā)育成熟到喪失生活力所經(jīng)歷的時間。種子壽命既與植物種類有關，也與貯藏條件（種子含水量、貯藏溫度）有關。正常性種子：水稻、玉米、小麥等種子（1-3年）短壽命：柳樹種子（12h）長壽命：蓮子（400年）貯存條件：低溫、低濕，保存時間長實驗一植物種子生活力的快速測定

(TTC法、染料染色法)[種子生活力檢測評估方法](1)還原力：呼吸→NADH→還原TTC，胚呈紅色。(2)原生質(zhì)著色：活種子不易著色，原生質(zhì)膜具有選擇透性。(3)呼吸釋放CO2，pH下降，酸堿指示劑顯色。(4)細胞中的熒光物質(zhì)：紫外照射發(fā)藍、藍紫色熒光。(5)外觀目測法：用肉眼觀察玉米種胚形狀和色澤。凡種胚凸出或皺縮、顯黑暗無光澤的，則種子新鮮，生活力強，可作生產(chǎn)用種。(6)浸種催芽法先將100粒種子用水浸約兩小時吸脹，放于濕潤草紙上，蓋以濕潤草紙，置于氧氣充足，室溫10-20℃環(huán)境中，讓種子充分發(fā)芽；再以發(fā)芽的種子粒數(shù)除以100，乘以100%，求得發(fā)芽率。這種測定方法雖然準確，但需要8天時間。實驗一植物種子生活力的快速測定

(TTC法、染料染色法)[實驗目的]了解種子活力測定生產(chǎn)意義掌握重要種子活力測定方法和評價標準理解TTC/染料法測定種子活力的原理[實驗原理]TTC法當TTC溶液滲入種胚的活細胞內(nèi)，并作為氫受體被脫氫輔酶（NADH或NADPH）還原時，可產(chǎn)生紅色的三苯甲腙（TTF），胚染成紅色；如果種胚死亡則不能染色，種胚生命力衰退或部分喪失生活力則染色較淺或局部被染色。染料染色法有生命力種子胚細胞的原生質(zhì)膜具有半透性，有選擇吸收外界物質(zhì)的能力，一般染料不能進入細胞內(nèi)，胚部不染色；而喪失生命力的種子，其胚部細胞原生質(zhì)膜喪失了選擇吸收能力，染料可以自由進入細胞內(nèi)，使胚部染色。實驗一植物種子生活力的快速測定

(TTC法、染料染色法)[實驗材料及藥品]不同活力的玉米和小麥種子0.5%氯化三苯四氮唑法（TTC法）紅墨水（稀釋20倍）刀片培養(yǎng)皿實驗一植物種子生活力的快速測定

(TTC法、染料染色法)[實驗步驟]一、氯化三苯四氮唑法（TTC法）1、原理凡是生活細胞，就有新陳代謝。滲入生活細胞的無色的TTC能被脫氫輔酶（NADH2或NADPH2）上的氫還原成紅色產(chǎn)物（TTF），肉眼可辨。2、材料：玉米、小麥（吸脹種子）3、方法：100粒種子，沿中心線縱切為二，做如下處理：

100半粒

+0.5%TTC→30℃，60min→

檢查

100半粒,煮沸5min

注意：胚為紅色的為具活力種子。4、作業(yè)：計數(shù)活種子數(shù)，計算活種子的百分率。實驗一植物種子生活力的快速測定

(TTC法、染料染色法)[實驗步驟]二、紅墨水染色法1、原理生活細胞的原生質(zhì)膜對物質(zhì)吸收有選擇性，而死細胞的無此功能，紅墨水顆?？梢赃M入。2、材料：玉米、小麥（吸脹種子）3、方法種子100粒，沿中心線縱切為二，做如下處理：

100半粒

+5%紅墨水→室溫,60min→檢查

100半粒煮沸5min

注意：胚部著色（紅色）很淺或不著色者為生活種子，胚與胚乳著色程度相當者為死種子。4、作業(yè)：計數(shù)活種子數(shù)，計算活種子的百分率。實驗一植物種子生活力的快速測定

(TTC法、染料染色法)實驗一植物種子生活力的快速測定

(TTC法、染料染色法)[實驗要點]

1、種子要先軟化；

2、種子要沿種胚縱切為兩半；

3、顯色時要使漂浮的種子全部浸入試劑中；

4、TTC見光易分解，需在暗條件下保溫染色；

5、結(jié)果觀察主要是看胚部的顏色變化。實驗一植物種子生活力的快速測定

(TTC法、染料染色法)[實驗結(jié)果分析]比較兩種種子活力的高低比較分析兩種方法測定結(jié)果的差異植物種子活力測定的其它方法實驗二植物呼吸速率的測定——小籃子法一、實驗目的與要求掌握小籃子法測定植物種子呼吸速率的原理與步驟；比較活種子與死種子的呼吸速率。二、實驗原理1、植物的呼吸作用定義：是植物體吸收氧氣，將有機物轉(zhuǎn)化成二氧化碳和水并釋放能量的過程。葡萄糖+6O26CO2

+6H2O+能量意義：代謝的中心有機物轉(zhuǎn)化的樞紐能量的主要供應渠道

2、測定呼吸速率的常用方法紅外線CO2氣體分析儀(IRGA)CO2可以吸收特定波段的紅外輻射。當被檢CO2氣體通過IRGA的氣室時，可使紅外輻射減少或增加，且變化幅度取決于CO2的濃度。這種變化可被IRGA的檢測器所檢定，且以電訊號的形式輸出，由記錄儀所記錄。氧電極法3、小籃子法密閉容器中加入一定量堿液[一般用Ba(OH)2]，并懸掛植物材料，則植物材料呼吸放出的CO2可為容器中Ba(OH)2所吸收，然后用草酸滴定剩余的Ba(OH)2，從空白和樣品二者消耗的草酸溶液之差，可計算出呼吸釋放的CO2量具體反應式：Ba(OH)2+CO2

BaCO3

+H2OBa(OH)2+H2C2O4

BaC2O4

+2H2O以酚酞指示滴定終點。1mL的1/44mol/L草酸溶液中的草酸與1mg的CO2等摩爾數(shù)。空白和樣品二者消耗的草酸溶液的mL數(shù)差值

=Ba(OH)2溶液吸收的CO2

mg數(shù)

=

種子呼吸作用釋放的CO2mg數(shù)三、實驗材料與試劑材料

小麥種子（浸種）和煮死的種子的小麥或綠豆種子；試劑的Ba(OH)2；

1/44mol/L的草酸；酚酞指示劑。1#種子2#實驗裝置圖四、實驗步驟取具玻璃塞和橡皮塞的500mL廣口瓶各1只，分別編號1#、2#；2.分別稱取10g煮死種子和浸種活種子，以紗布包裹，懸掛在橡皮塞下方；3.向兩瓶內(nèi)各加入Ba(OH)2溶液20mL，立即封口，室溫放置。1#種子2#實驗裝置圖不時輕搖兩瓶，1h后，拔除瓶塞，各加酚酞指示劑2滴，立即以塑料袋（保鮮膜）分別封口；將滴定管下端插入瓶中，以草酸滴定Ba(OH)2，記錄所用草酸體積V1和V2。五、計算呼吸速率(mgCO2/gFW.h)

=(V1-V2)/(W×t)六、思考題在本實驗呼吸測定怎樣排除不應有的干擾因素？在實驗過程中為什么要輕搖廣口瓶數(shù)次？就計算公式而言，為什么草酸的用量可代表種子呼吸放出的CO2的量？草酸（1/44mol/L）滴定Ba(OH)2(0.05mol/L)，酚酞作指示劑，溶液由紫色變成無色，滴定至終點后，馬上顏色又由無色變成紫色，原因是什么？白天在實驗室測定植物莖葉的呼吸速率會受到什么影響？如何解決？如果實驗材料選擇的是不同萌發(fā)階段的小麥種子及幼芽，哪一階段的呼吸速率最大？（結(jié)合實驗1進行分析）實驗三

葉綠體色素的提取、分離、性質(zhì)及含量測定一、實驗目的掌握葉綠體色素的提取原理及方法；掌握葉綠體色素的部分理化性質(zhì)；掌握葉綠體色素定量分析方法及步驟。二、實驗原理2.類胡蘿卜素（一）葉綠體色素：胡蘿卜素葉黃素

葉綠素a葉綠素b1.葉綠素（二）四種色素的化學性質(zhì)均為親脂性>親水性：

均不溶于水，而溶于有機溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機溶劑提取。極性大小：

葉綠素b>葉綠素a>葉黃素>胡蘿卜素

根據(jù)相似相溶原理，在有機溶液中的溶解度：

葉綠素b<葉綠素a<葉黃素<胡蘿卜素葉綠素的卟啉環(huán)葉綠素分子頭部的金屬卟啉環(huán)中心均為Mg2+。在弱酸作用下，葉綠素分子中的鎂可被H+

取代而形成褐色的去鎂葉綠素，后者遇銅則可形成綠色的銅代葉綠素。銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易被破壞，故常用此法制做植物的原色標本。（三）葉綠素的光學性質(zhì)

葉綠素與類胡蘿卜素都具有光學活性，表現(xiàn)出一定的吸收光譜，可用分光光度計精確測定。葉綠素的熒光現(xiàn)象葉綠素溶液在透射光下呈綠色，而反射光下呈紅色的現(xiàn)象。三、實驗材料與試劑實驗材料：綠色植物葉片實驗儀器及試劑：UV-1700分光光度計；天平；剪刀；打孔器；研缽；移液管；漏斗；量筒；培養(yǎng)皿；濾紙；95%乙醇；石英砂；CaCO3；醋酸銅四、實驗步驟1、葉綠體色素提取將植物葉片擦凈，去中脈后取5g剪碎，加少許碳酸鈣和石英砂，再分次加入10mL酒精研磨，過濾，定容至50ml，分裝于5個試管內(nèi)，容量分別為10ml。23451

2.水研磨勻漿（光破壞對照）取2g剪碎的新鮮葉片，放入少量石英砂（不加碳酸鈣粉），用水研磨。先加2ml蒸餾水，研至糊狀，再加蒸餾水20ml，攪均，不過濾，分裝在2個試管內(nèi)。四、實驗步驟光對葉綠素的破壞操作太陽光下：水（1）、乙醇（1）暗處（實驗臺）：水（2）、乙醇（2）兩組（四管）3.光對葉綠素的破壞作用30分鐘后觀察各試管顏色的變化，并記錄，解釋現(xiàn)象

水研磨勻漿暗光

乙醇提取液暗光

注意：乙醇提取液的濃度太大，必須進行稀釋才能做光破壞實驗，稀釋倍數(shù)視提取液的濃度確定，濃度不要過大，否則在短時間之內(nèi)效果不明顯。4、葉綠素提取液熒光現(xiàn)象觀察取試管3：從與入射光垂直的方向觀察；再在透射光方向觀察葉綠體色素溶液的顏色；記錄葉綠素體色素溶液顏色有何不同，分析原因。5、銅代葉綠素反應向試管4中逐滴加入濃鹽酸，并不斷搖勻，至顏色變化，觀察并記錄現(xiàn)象；向變色后的葉綠素溶液中加入少量醋酸銅，并在酒精燈上緩緩加熱，觀察并記錄顏色的變化。分析原因。6、葉綠素定量測定稀釋葉綠素取5號試管醇提取液5ml轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中（或更大，視濃度而定），再加入乙醇定容至50ml。測量光吸收

利用722分光光度計或UV1700分光光度計，分別測定葉綠素提取液在645nm和663nm下的吸光度。

實驗原理

葉綠素提取液中同時含有葉綠素a和葉綠素b，二者的吸收光譜雖有不同，但又存在著明顯的重疊，在不分離葉綠素a和葉綠素b的情況下同時測定葉綠素a和葉綠素b的濃度，可分別測定在663nm和645nm（分別是葉綠素a和葉綠素b在紅光區(qū)的吸收峰）的光吸收，然后根據(jù)Lambert-Beer定律，計算出提取液中葉綠素a和葉綠素b的濃度。A663ab（1）A645ab（2）公式中Ca為葉綠素a的濃度，Cb為葉綠素b濃度（單位為和9.27分別是葉綠素a和葉綠素b在663nm下的比吸收系數(shù)（濃度為1g/L，光路寬度為1cma和葉綠素b在645nm下的比吸收系數(shù)。即混合液在某一波長下的光吸收等于各組分在此波長下的光吸收之和。實驗原理

將上式整理，可以得到下式：Ca663645（3）Cb645663（4）將葉綠素的濃度改為mg/L，則上式變?yōu)椋篊a663645（5）Cb645663（6）CT=Ca+Cb663645（7）CT為葉綠素的總濃度實驗原理

定量測定結(jié)果分析

將測得的數(shù)值代入到公式（5）（6）（7）中，計算出葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的濃度。最后要計算出單位葉片鮮重中葉綠素的含量：葉綠素a含量(mg/g鮮重)＝Ca×500ml（總體積數(shù)）×1ml/1000ml/L÷5g=a葉綠素b含量(mg/g鮮重)＝0.1Cb總?cè)~綠素含量(mg/g鮮重)＝0.1CT五、思考題：

1、用不含水的有機溶劑如無水乙醇、無水丙酮等提取干燥材料中的葉綠體色素，結(jié)果會如何？為什么？２、研磨提取葉綠素時，為何要加入CaCO3？

3、銅在葉綠素分子中具有替代鎂的作用，這有何實用意義？4、計算葉綠素a與葉綠素b含量的比值，可以得到什么結(jié)論？

實驗四植物組織逆境傷害程度的測定

（提前20min-20oC速凍材料）電導法【實驗原理】植物組織受到逆境傷害時，由于膜的功能受損或結(jié)構(gòu)破壞，而使其透性增大，細胞內(nèi)各種水溶性物質(zhì)包括電解質(zhì)將有不同程度的外滲，將植物組織浸入無離子水中，水的電導將因電解質(zhì)的外滲而加大，傷害愈重，外滲愈多，電導度的增加也愈大。故可用電導儀測定外液的電導度增加值，從而得知傷害程度。校園中任意一種植物葉片電導法【實驗材料】電導法【實驗方法】1實驗分兩個處理：對照：正常植物葉片低溫：低溫（-20℃）處理20min的葉片2沖洗葉片，用濾紙吸干，打取葉圓片。每個試管10片葉，加入15ml蒸餾水后放入塑料沙網(wǎng)（距液面1cm）統(tǒng)一抽氣20min。3抽完氣后，平衡20-30min，其間不斷搖動。4電導儀測定初電導值S1。5沸水浴10min，自來水冷卻（殺死植物組織），平衡10min（其間不斷搖動）后即可測定終電導S2?！緦嶒灧椒ā?/p>

取材各3片葉打取葉圓片

10片/管，15mL蒸餾水/管抽氣20min平衡20-30min測量S1煮沸15min冷卻平衡10min

測量S2【實驗步驟示意圖】相對電導度：L=（S1-空白電導）/（S2-空白電導）傷害度（%）：(Lt-Lck/1-Lck)*100【結(jié)果計算】1蒸餾水中加吐溫(可用洗衣粉代替），洗儀器時出現(xiàn)泡沫。吐溫作用：表面活性劑，促進細胞間隙水分與外界交換。2抽氣作用：抽出細胞間隙空氣，保證水分充分進入細胞間隙。3紗網(wǎng)作用：防止抽氣時葉圓片被抽出。【注意事項】測定電解質(zhì)外滲液時，為何要對材料進行真空滲入？測定過程中為何進行震蕩？【思考題】

一原理

植物器官在逆境條件下或衰老時,往往發(fā)生膜脂過氧化作用,丙二醛(MDA)是其中產(chǎn)物之一,通常將其作為脂質(zhì)過氧化指標,用于表示細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應的強弱。植物組織中丙二醛含量的測定丙二醛(MDA)硫代巴比妥酸(TBA)高溫酸性三甲基復合物(3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮)(紅棕色)上述反應在532nm處有最大吸收波長但此反應受可溶性糖的極大干擾：糖與TBA的反應產(chǎn)物在532nm處也有吸收(糖與TBA反應產(chǎn)物的最大吸收波長在450nm處)＋所以，測定MDA含量時需排除可溶性糖的干擾根據(jù)Lambert-Beer定律，對最大吸收光譜不同的兩個組分的混合液,代入數(shù)值，計算得出混合液中兩種組分的濃度公式：可溶性糖：C1/(mmol/L)=11.71OD450MDA：C2/(μmol/L)=6.45OD532－0.56OD450

二材料、儀器設備及試劑(一)材料植物葉片(常溫和低溫兩種狀態(tài))(二)儀器設備研缽,試管,移液管,恒溫水浴鍋,離心機,分光光度計

(三)試劑

10%三氯乙酸(TCA)0.6%硫代巴比妥酸(TBA)

三實驗步驟(1)MDA的提取取葉片剪碎，加10%TCA2ml和少量石英砂，研磨，進一步加入3mlTCA充分研磨，勻漿液以4000r/min下離心10min，上清液即為提取液，定容至10ml。(2)顯色反應及測定吸取上清液2ml，加2ml0.6%TBA，混勻，在沸水浴中煮沸15min，迅速冷卻，在4000r/min下離心5min。取上清液測定532nm和450nm下的OD值。對照以2mlTCA代替提取液。四結(jié)果計算以測得的OD532減去OD600的非特異吸收值，按155mmol-1cm-1消光系數(shù)計算MDA含量。分別計算衰老和對照組的值。MDA濃度

MDA含量(μmol/gFW)＝

D450、D532、D600分別代表450nm、532nm和600nm波長下的光密度值。五注意事項％的三氯乙酸對MDA-TBA反應較合適，若高于此濃度，其反應液的非專一性吸收偏高；MDA-TBA顯色反應的加熱時間，最好控制沸水浴10-15min之間。時間太短或太長均會引起532nm下的光吸收值下降；如待測液渾濁，可適當增加離心力及時間，最好使用低溫離心機離心。低濃度的鐵離子能增強MDA與TBA的顯色反應，當植物組織中鐵離子濃度過低時應補充Fe3+（最終濃度為0.5nmol·L-1）可溶性糖與TBA顯色反應的產(chǎn)物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），當植物處于干旱、高溫、低溫等逆境時可溶性糖含量會增高，必要時要排除可溶性糖的干擾。思考題1.通過丙二醛含量測定能夠解決什么理論和實際問題？2.說明膜脂過氧化作用的對植物的影響。3.TBA為什么要溶解在三氯乙酸中？4.為什么要測定反應液在600nm下的吸光度？5.丙二醛反應液為什么加熱時間過長會影響測定結(jié)果？6.如果可溶性糖含量影響丙二醛含量的測定，你有什么辦法消除其影響？7.植物正常葉片與低溫凍害葉片相比丙二醛含量有什么變化，分析其原因。過氧化物酶活性的測定——愈創(chuàng)木酚比色法一、實驗目的1.學習比較植物根系或葉片過氧化物酶的制備方法2.掌握過氧化物酶的反應原理及測定方法。

二、實驗原理什么是過氧化物酶?

過氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關系，在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱。這是因為過氧化物酶能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度，而且發(fā)現(xiàn)早衰減產(chǎn)的水稻根系中過氧化物酶的活性增加，所以過氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標。酶活力表示酶量的多少不能像一般物質(zhì)那樣，用重量(g)或體積(ml)。因為酶是一種生物催化劑。酶的存在和含量多少應體現(xiàn)在催化能力大小，即用酶活力(活性)表示。酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化學反應的能力。催化能力強(大)，酶活力就高(大)，也表示酶量多。酶本身的重量不能說明酶的實際含量多少。同樣重量的酶，酶活力可以不同，活力高，價值就大。二、實驗原理酶促反應速度酶活力具體用它所催化的某一化學反應的反應速度來表示，即在最適條件下(最適pH、最適T)酶催化的反應速度愈快，酶活力就愈高。速度愈慢，酶的活力就愈低。所以測定酶的活力(實質(zhì)上就是酶的定量)測定就是測定酶促反應的速度(用v表示)。酶促反應速度可用單位時間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物增加量來表示。單位：濃度/單位時間常用產(chǎn)物增加量表示，因為它從無到有，變化明顯。酶促反應隨時間增加，產(chǎn)物增加。二、實驗原理酶促反應的速度曲線Vmax時間產(chǎn)物的生成量斜率＝濃度/時間＝V從圖可知，反應速度只在最初一段時間內(nèi)保持恒定，隨著反應時間的延長，酶反應速度逐漸下降。引起下降的原因很多，如底物濃度降低，產(chǎn)物濃度增加而加速了逆反應的進行，產(chǎn)物對酶有抑制作用等。因此研究酶反應速度以酶促反應的初速度為準，即酶促反應最初的一段時間，產(chǎn)物呈線性增加時的反應速度。具體指酶促反應速度曲線的斜率。即從原點對曲線作切線，求切線斜率(v)=濃度/時間二、實驗原理測定原理RH2+H2O2→2H2O+R在有過氧化氫存在的條件下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，該物質(zhì)在470