微生物實(shí)驗(yàn)放線菌

放線菌的分離純化、鑒別與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)生物科學(xué)1101班第二小組引言

土壤是微生物的大本營，它所含微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的，因此，土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價(jià)值的菌株。

放線菌廣泛分布在含水量較低，有機(jī)物較豐富和呈微堿性的土壤中，泥土所特有的泥腥味，主要是由放線菌產(chǎn)生的土腥味素所引起的，研究發(fā)現(xiàn)，駱駝尋找水源的主要線索就是嗅到土腥味素。每克土壤中放線菌的孢子數(shù)一般可達(dá)百萬左右。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、通過代表微生物放線菌的學(xué)習(xí)來掌握選育、分離純化和培養(yǎng)微生物等的基本操作技術(shù)。

2、深入了解放線菌的形態(tài)特征。

3、復(fù)習(xí)回顧微生物實(shí)驗(yàn)的各種技術(shù)及方法（培養(yǎng)基的制備，消毒與滅菌，革蘭氏染色法，無菌操作技術(shù)等）。

實(shí)驗(yàn)原理（結(jié)合《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》中實(shí)驗(yàn)五《平板分離技術(shù)與活菌計(jì)數(shù)》）

1、菌體培養(yǎng)：選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)、酸堿度、溫度和氧等要求或加入某種抑制劑造成只利于該微生物的生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。

馬丁氏培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：培養(yǎng)真菌（加入青霉素和鏈霉素，制成抗細(xì)菌的雙抗培養(yǎng)基）高氏1號培養(yǎng)基：培養(yǎng)放線菌（加入10％酚數(shù)滴）

2、微生物的分離與純化：從雜菌混生的微生物群體中獲得只含有一種或某一株微生物的過程。

3、微生物在固體培養(yǎng)基上形成的單個(gè)菌落可以是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲得單菌落的方法是平板分離法，此法主要有：①平板劃線分離法；②稀釋涂布平板法。后者除能分離純化微生物外，還可用于測定樣品中活菌數(shù)量。

4、放線菌主要是呈絲狀生長和以孢子繁殖的革蘭氏陽性細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)思路

將采集來的土壤樣品制成懸浮液，在懸浮液中獲取不同稀釋度的菌液，分別在高氏1號培養(yǎng)基上進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，待菌苔長出后，挑取少許菌苔觀察其形態(tài)，并將其細(xì)胞進(jìn)行革蘭氏染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物細(xì)胞，如若發(fā)現(xiàn)有雜菌，則須再次進(jìn)行分離純化。實(shí)驗(yàn)儀器和用具顯微鏡、擦鏡紙、雙層瓶、載玻片、蓋玻片、鑷子、無菌吸管、玻璃珠、無菌培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱等。實(shí)驗(yàn)操作

1、稀釋涂布平板法⑴倒平板⑵制備土壤稀釋液⑶涂布取菌液0.1ml放入已寫好稀釋度的平板中，靜置5~10min，使菌液吸附近培養(yǎng)基，用無菌的玻璃涂布器將菌液先沿一條直線輕輕地來回推動，使均勻分布，然后改變方向沿另一垂直線來回推動，平板內(nèi)邊緣處可改變方向用涂棒再涂布幾次。⑷培養(yǎng)放線菌、真菌，28℃培養(yǎng)3~5天；細(xì)菌，37℃培養(yǎng)2~3天⑸挑菌苔將培養(yǎng)后長出的單個(gè)菌落分別挑取少許細(xì)胞接種到培養(yǎng)基的斜面上，進(jìn)行培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查其特征是否一致，同時(shí)將微生物細(xì)胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物，若發(fā)現(xiàn)雜菌，需再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。2、平板劃線分離法（1）倒平板標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、土樣編號和實(shí)驗(yàn)日期。（2）劃線用無菌的接種環(huán)挑取上述10-1倍的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論采取哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，培養(yǎng)后能形成單個(gè)菌落。本實(shí)驗(yàn)采取四區(qū)劃線法。常見的幾種劃線方法⑶挑菌苔

將培養(yǎng)后長出的單個(gè)菌落分別挑取少許細(xì)胞接種到培養(yǎng)基的斜面上，培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查其特征是否一致，同時(shí)將微生物細(xì)胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物，若發(fā)現(xiàn)雜菌，需再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。(4)革蘭氏染色鑒別

將挑出的菌苔進(jìn)行革蘭氏染色，依次進(jìn)行初染、媒染、脫色、復(fù)染后進(jìn)行鏡檢，由于放線菌是革蘭氏陽性菌，所以染色后的菌體會呈現(xiàn)紅色。

脫色是革蘭氏染色是否成功的關(guān)鍵，脫色不夠造成假陽性，脫色過度造成假陰性色。所以要嚴(yán)格控制脫色的時(shí)間，保證染色成功。1、質(zhì)地:致密、干燥、多皺、小而不蔓延、不易挑起，表面有放射狀溝紋。2、菌落表面呈干粉狀。3、菌體多產(chǎn)脂溶性或水溶性色素。放線菌形態(tài)觀察放線菌菌絲的各種形態(tài)插片法使放線菌沿培養(yǎng)基與蓋玻片交界處生長并附著于蓋玻片上。(5)利用插片法培養(yǎng)放線菌實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、實(shí)驗(yàn)要在嚴(yán)格的無菌環(huán)境下進(jìn)行，以避免雜菌感染；

2、涂片時(shí)取菌量要適宜且要涂抹均勻，避免貪多造成菌體堆積而難以看清細(xì)胞個(gè)體形態(tài)。同時(shí)也應(yīng)避免取菌量太少而難以在顯微鏡視野中找到細(xì)胞；

3、涂布均勻，培養(yǎng)后菌落在整個(gè)平板表面分散均勻；

4、平板劃線時(shí)要快速，接種針在平板上迅速滑動。s思考題1、放線菌與細(xì)菌菌落最顯著的差異是什么？2、為什么要在高氏1號培養(yǎng)基中加入10%的酚？解答1、答：放線菌菌落的特征是：小型、干燥、不透明、表面呈致密的絲絨狀，上有一薄層彩色的“干粉”；菌落和培養(yǎng)基的連接緊密，難以挑取；菌落的正反面