正交設(shè)計(jì)優(yōu)化裂褶菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

PAGE目錄TOC\o"1-3"\u序言 11材料和方法 21.1材料 31.1.1供試菌株 31.1.2培養(yǎng)基 31.1.3主要儀器設(shè)備 31.2方法 31.2.1菌種活化 31.2.2菌種同步 31.2.3單因素實(shí)驗(yàn) 31.2.4正交試驗(yàn) 41.2.5裂褶菌菌絲體的提取工藝流 41.2.6裂褶菌菌絲生物量 52結(jié)果與分析 52.1裂褶菌菌絲生物量單因素結(jié)果與分析 52.1.1無機(jī)鹽單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 52.1.2碳源氮源單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 63小結(jié)與討論 10參考文獻(xiàn) 10致謝 11正交設(shè)計(jì)優(yōu)化裂褶菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的研究序言裂褶菌(Schizophyllumcommune)屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、裂褶菌科、裂褶菌屬[1]。裂褶菌又名白參（云南）、樹花（陜西）、雞冠菌、雞毛菌子等，是一種具有較高營養(yǎng)和藥用價(jià)值的大型真菌。其擔(dān)子果初為杯狀，后呈盤狀，菌褶窄，自基部輻射而生，有裂褶，單系菌絲，罕二系，孢子光滑，無色非淀粉質(zhì)[2]。其子實(shí)體可供藥用，在云南的民間常用裂褶菌子實(shí)體與雞蛋燉服，治療婦女白帶，效果非常顯著[3]。裂褶菌胞外多糖(Schizophyllan-glucan，SPG)，又稱裂褶菌素，是一種水溶性的β-D-葡聚糖。具有一條由β-(1-3)鍵連接的β-D-吡喃型葡萄糖殘基所構(gòu)成的主鏈，并且在主鏈上每3個(gè)糖殘基處有一個(gè)β-(1-6)連接的β-D-吡喃型葡萄糖側(cè)鏈。裂褶菌胞外多糖是一種特有的、穩(wěn)定的、電中性的多糖。pH中性，蒽酮試劑反應(yīng)呈藍(lán)綠色，苯酚—硫酸試劑反應(yīng)呈紅色，α-苯酚試劑反應(yīng)呈紫紅色[4]。裂褶菌胞外多糖的水溶液具有觸變性、假塑性和粘彈性。發(fā)酵的懸浮液，由于菌絲的網(wǎng)聯(lián)可表現(xiàn)出非牛頓性的提高[5]。裂褶菌胞外多糖在25℃時(shí)以三螺旋的形式溶解在水中，起源于三螺旋外側(cè)的β-(1-6)連接的D-葡萄糖基團(tuán)呈垂直狀[6]。裂褶菌胞外多糖在水溶液中溫度變化和構(gòu)象轉(zhuǎn)化具有極高的協(xié)同性；低溫時(shí)，三螺旋結(jié)構(gòu)有序，稱為三螺旋I；高溫時(shí)，三螺旋結(jié)構(gòu)為無序，被稱三螺旋П；而當(dāng)水中的溫度升至135~140℃時(shí),鏈便從三螺旋結(jié)構(gòu)上分離下來，完全分散成單鏈[7]。多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)、分支度和分子量有關(guān)。研究表明：在具有免疫調(diào)節(jié)能力的多糖中，只有那些具有β-(1-6)分支的β-(1-3)-D-葡聚糖才對腫瘤生長有抑制作用。而分支度(DB)在0.2~0.33的β-(1-3)-D-葡聚糖的生物活性則更強(qiáng)。裂褶菌胞外多糖恰為具有β-(1-6)-D-葡萄糖側(cè)鏈的β-(1-3)-D-葡聚糖，它的分支度為0.33，分子量范圍也在具有活性的范圍之間，且可溶于水。因此，裂褶菌多糖較其它菌類、植物的β－葡聚糖有著更強(qiáng)的生理活性[8]裂褶菌胞外多糖在調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗輻射等方面有著明顯的療效。在臨床治療上，作為免疫治療劑可延長肺癌和胃癌病人的壽命[9]，是一種非常好的生物應(yīng)答效應(yīng)物(biologicalresponsemodifiers，BRMs)。在日本，這種抗癌葡聚糖與其他化療成分組合，目前正作為腫瘤免疫療法的藥物而使用，有著很好的療效[10]。據(jù)日本小松信彥教授的藥理實(shí)驗(yàn)表明:裂褶菌胞外多糖能提高細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)免疫球蛋白的形成，刺激單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的活性，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和消化功能，增進(jìn)遲發(fā)性皮膚變態(tài)反應(yīng)。它對荷癌鼠的巨噬細(xì)胞移動有抑制作用，對Sacoma-180，Sacoma-37，EhrlishCarcinoma，YoshidaSacoma等4種動物實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤有明顯的抑制作用[9]。裂褶菌胞外多糖的另外一個(gè)特點(diǎn)是能與其他的抗生素聯(lián)合使用，起到比兩藥各自單獨(dú)使用有更高的療效。它與鏈霉素、慶大霉素、利福平聯(lián)合使用可提高抗菌素效價(jià)，降低抗菌素副作用的理想效果[10]。在對癌性胸膜炎的治療過程中幾乎全部患者在1~2月后胸水均有淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞出現(xiàn)，雖然胸水沒有消失，但癌細(xì)胞變性、消失或明顯減少[11]。國內(nèi)北京醫(yī)科大學(xué)的林志彬教授的藥理實(shí)驗(yàn)表明，裂褶菌胞外多糖可恢復(fù)年老動物低下的細(xì)胞免疫及體液免疫功能，提高年老小鼠抗體形成細(xì)胞的數(shù)目，對延緩衰老有一定的意義[12]。來源于裂褶菌的β-(1-6)支鏈β-(1-3)葡聚糖也可以幫助提高皮膚細(xì)胞的增殖，膠原質(zhì)的生物生成，曬傷修復(fù)，并且可以有效地減少皮膚發(fā)炎，非常適合在化妝品和皮膚病學(xué)上應(yīng)用。又因?yàn)樗仁撬苄缘?，又是天然的，所以較目前化妝品中常用的從面包酵母中提取的不溶于水或以羥甲基磷酸化進(jìn)行化學(xué)修飾的β－葡聚糖更適合應(yīng)用于化妝品。裂褶菌胞外多糖作為一種抗衰老和抗發(fā)炎的有效成分有著廣闊的前景[13]。在國內(nèi)，南京大學(xué)的李兆蘭等人[14]在90年代對裂褶菌多糖的分離、提取、構(gòu)象及其培養(yǎng)工藝進(jìn)行過較為全面的研究，在對小鼠進(jìn)行的藥理試驗(yàn)表明，胞內(nèi)多糖可恢復(fù)免疫功能，對延緩衰老有一定的意義。東北師范大學(xué)周義發(fā)等[15]對裂褶菌胞外多糖的構(gòu)象進(jìn)行了分析，探討了溫度、pH等參數(shù)同裂褶菌多糖構(gòu)象變化的關(guān)系。上海師范大學(xué)、浙江醫(yī)學(xué)研究院藥物所、華南理工大學(xué)等單位也曾對裂褶菌的深層培養(yǎng)有過一定的研究[16]。由于裂褶菌子實(shí)體個(gè)體較小，人工栽培生物學(xué)效率也偏低，所以要獲得大量裂褶菌多糖目前主要依靠深層發(fā)酵。由于裂褶菌液體發(fā)酵后發(fā)酵醪黏稠，進(jìn)行分離比較困難，而且多糖多數(shù)附著在菌體表面,所以我們可以以裂褶菌菌絲生物量為主要指標(biāo)來研究裂褶菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，國內(nèi)關(guān)于裂褶菌發(fā)酵工藝的研究報(bào)道較少，而且主要集中在胞外多糖的研究方面[16]。 本文以裂褶菌菌絲生物量和粗多糖產(chǎn)量為指標(biāo)通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了裂褶菌發(fā)酵培養(yǎng)基，希望通過優(yōu)化提高裂褶菌多糖產(chǎn)量。1材料和方法1.1材料1.1.1供試菌株裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.)，利用野生裂褶菌經(jīng)過多孢分離獲得，保存在學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。1.1.2培養(yǎng)基斜面種子培養(yǎng)基（采用綜合PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO43.0g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，瓊脂20g/L，pH自然?；瘜W(xué)試劑除瓊脂外均為分析純。種子平板培養(yǎng)基：同斜面種子培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基組分：葡萄糖，酵母粉，KH2PO4，MgSO4·7H2O，pH自然。1.1.3主要儀器設(shè)備JA5002電子天平 上海精密電子儀器有限公司全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋

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天津三水科學(xué)儀器有限公司ZHWY-2102型搖床上海智誠分析儀器制造有限公司HHB11—600S型電熱恒溫干燥箱天津市華北儀器有限公司1.2方法1.2.1菌種活化將配制好的綜合PDA培養(yǎng)基裝入試管，于0.05Mpa排冷空氣兩次，121℃下滅菌20~30分鐘，取出擺放斜面后備用。在超凈工作臺上進(jìn)行接種，從原始菌種斜面中切一塊培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入另一支斜面試管中，置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~6d，菌絲長滿斜面后備用。1.2.2菌種同步在超凈工作臺上制備綜合PDA培養(yǎng)基平板，冷卻后將活化的裂褶菌斜面菌種接種到綜合PDA平板中央，每皿接種1塊直徑約為1cm的菌種塊，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，菌絲長滿平皿后備用。菌種同步的目的是為了保證接種時(shí)接種量和種子菌齡盡量一致，減少實(shí)驗(yàn)誤差。1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)1.2.3.1無機(jī)鹽單因素實(shí)驗(yàn)KH2PO4的最適濃度確定。培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖30g/L，酵母粉10g/L，KH2PO4濃度梯度為0、1、2、3、4、5、0.2和0.5g/L，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)。分別標(biāo)記為K0、K1、K2、K3、K4、K5、K6和K7。配制好后，用八層紗布和雙層報(bào)紙封口，于121℃下滅菌20-30min冷卻至室溫，在超凈工作臺上進(jìn)行接種，用直徑3mm打孔器取位于同一圓周的菌齡相同的菌種圓片，每個(gè)三角瓶接種10片，在轉(zhuǎn)速為160r/min的恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。待發(fā)酵醪粘稠，生長最快的處理沒有發(fā)酵液時(shí)，終止培養(yǎng)。發(fā)酵所得發(fā)酵醪用于菌絲生物量和多糖測定。MgSO4·7H2O的最適濃度的測定。培養(yǎng)基配方如下MgSO4·7H2O的濃度梯度為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1和2g/L分別標(biāo)記為M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6和M7。實(shí)驗(yàn)方法與上述相同。1.2.3.2碳氮源單因素實(shí)驗(yàn)參考有關(guān)文獻(xiàn)[17]可知裂褶菌發(fā)酵培養(yǎng)基最適碳源為葡萄糖。培養(yǎng)基碳源最適濃度確定：培養(yǎng)基中葡萄糖濃度梯度為0、10、20、30、40、50和60g/L，酵母粉10g/L，根據(jù)無機(jī)鹽單因素實(shí)驗(yàn)確定無機(jī)鹽濃度，KH2PO4濃度為3g/L，MgSO4·7H2O的濃度為0.15g/L。每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)方法同上。氮源最適濃度的確定。培養(yǎng)基配方：葡萄糖30g/L，酵母粉濃度梯度為0、5、10、15、20、25和30g/L。實(shí)驗(yàn)方法如上。1.2.4正交試驗(yàn)我們考慮采用L16(45)正交試驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì)。試驗(yàn)為四因素四水平，并做三個(gè)重復(fù)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交因子水平表和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，見表1。表1因子水平表（單位：g/L）水平因素A/葡萄糖B/酵母粉C/KH2PO4D/MgSO4?7H2O130520.12401030.33501540.54602050.7培養(yǎng)基配制完成后，實(shí)驗(yàn)方法與單因素實(shí)驗(yàn)相同。1.2.5裂褶菌菌絲體的提取工藝流1.2.5.1菌絲體的提取工藝100ml發(fā)酵 水洗 沖掉菌絲表面的多糖真空抽濾（100ml水分兩次抽濾）一層濾紙 水洗菌絲體烘干（50℃）稱量菌絲生物量。1.2.5.2胞外多糖的提取工藝將菌絲體提取過程中得到的過濾液取1/5體積，加入三倍95%的乙醇提取多糖。50℃烘干稱量。1.2.6裂褶菌菌絲生物量取出裂褶菌菌絲培養(yǎng)液，真空抽濾，將分離出的菌絲體放入平板中進(jìn)行烘干，起始溫度為30℃，每隔1小時(shí)增加5℃，最高溫度50℃。烘干過程中每隔4h翻動1次，烘干至恒重。冷卻，稱重。菌絲生物量（g/L）=菌絲體重量/培養(yǎng)液體積2結(jié)果與分析2.1裂褶菌菌絲生物量單因素結(jié)果與分析2.1.1無機(jī)鹽單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析不同濃度的無機(jī)鹽對菌絲生物量及胞外多糖產(chǎn)量的影響分別見表3和表4。表中數(shù)據(jù)。表2無機(jī)鹽對菌絲生物量的影響（單位：g/100ml）KH2PO4菌絲生物量ΣXiXiMgSO4·7H2O菌絲生物量ΣXiXiⅠⅡⅢⅠⅡⅢK01.141.141.153.431.14M01.151.141.163.451.15K11.161.151.153.461.15M11.201.211.213.621.21K21.251.261.263.771.25M21.231.231.243.701.23K31.491.501.494.481.49M31.251.251.243.741.25K41.301.311.303.911.30M41.141.141.133.411.34K51.321.321.313.951.31M51.101.101.123.321.11K61.121.121.143.381.13M61.131.141.133.401.33K71.361.361.354.071.36M71.261.261.273.791.26表3無機(jī)鹽對粗多糖產(chǎn)量的影響（單位：g/100mL）KH2PO4粗多糖產(chǎn)量ΣXiXiMgSO4·7H2O粗多糖產(chǎn)量ΣXiXiⅠⅡⅢⅠⅡⅢK00.250.260.250.760.25M00.310.350.320.980.33K10.610.630.611.850.61M10.710.710.722.140.71K20.610.610.621.840.61M20.510.510.521.540.51K30.810.810.812.430.81M30.810.820.832.460.82K40.710.720.712.140.71M40.510.520.511.540.51K50.410.420.421.250.41M50.610.620.611.840.61K60.410.440.421.270.42M60.420.410.411.240.41K70.610.620.621.850.61M70.430.420.451.300.43從表2、表3可以看出K3即KH2PO4的最適濃度為3g/L。分析如下：當(dāng)采用較大濃度，KH2PO4的濃度從1～5g/L時(shí)菌絲生物量和粗多糖產(chǎn)量都先上升后下降，最大菌絲生物量為達(dá)到1.49g/100mL，粗多糖產(chǎn)量為0.81g/100mL當(dāng)采用小濃度，即為0.2和0.5g/L時(shí)菌絲生物量和粗多糖濃度都有所上升，但是都明顯小于1.49，所以我們可以認(rèn)定KH2PO4的最適濃度為3g/L。MgSO4·7H2O的最適濃度為0.3g/L。分析如下：從圖1和圖2可以清晰的看出從0.1～0.5g/L裂褶菌菌絲生物量變化不是很明顯，而粗多糖產(chǎn)量先上升后下降再上升再下降，在MgSO4·7H2O濃度為0.3g/L時(shí)，菌絲生物量最大，為1.25g/100mL，粗多糖產(chǎn)量也達(dá)到最大，為0.82g/100mL；當(dāng)MgSO4·7H2O濃度為1和2g/L時(shí)，菌絲生物量分別為1.13和1.26g/100mL，雖然最大達(dá)到了1.26g/100mL，但是MgSO4·7H2O的用量卻增加了約七倍，并且粗多糖產(chǎn)量只有0.4g/100mL，從而我們可以選擇MgSO4·7H2O最適濃度為0.3g/100mL。2.1.2碳源氮源單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析碳氮源單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。表4碳氮源對菌絲生物量的影響（單位：g/100mL）C源菌絲生物量ΣXiXiN源菌絲生物量ΣXiXiⅠⅡⅢⅠⅡⅢC00.360.340.341.040.35N00.200.200.210.610.20C11.010.921.012.940.98N11.371.371.364.101.37C21.241.261.283.781.26N21.391.391.394.171.39C31.451.451.434.331.44N31.401.401.404.201.40C41.521.521.554.591.53N41.411.441.424.271.42C51.961.941.985.881.96N51.401.411.404.211.40C61.771.791.755.311.77N61.541.561.551.551.55表5碳氮源對粗多糖產(chǎn)量的影響（單位：g/100mL）C源粗多糖產(chǎn)量ΣXiXiN源粗多糖產(chǎn)量ΣXiXiⅠⅡⅢⅠⅡⅢC00.220.220.240.680.23N00.310.320.320.950.32C10.450.420.411.280.43N10.510.520.541.570.52C20.430.420.421.270.42N20.380.350.331.060.35C30.480.450.471.400.467N30.430.460.481.370.46C40.580.610.621.810.60N40.600.590.561.750.58C50.840.830.840.840.84N50.650.670.631.950.65C61.041.021.013.071.02N60.520.520.51.540.51從表4和表5實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出葡萄糖最適濃度為50g/L。分析如下：碳源對菌絲生物量及粗多糖產(chǎn)量的影響柱狀圖可以明顯看出當(dāng)葡萄糖濃度為50g/L時(shí)，菌絲生物量達(dá)到最大值1.96g/100mL，粗多糖產(chǎn)量為0.84g/100mL，所以我們可以確定最佳葡萄糖濃度為50g/L。從表4和表5實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出N3，N4與N5的菌絲生物量相差不大，分別為1.40、1.42和1.40g/L，而當(dāng)酵母粉濃度增加到N6，即30g/L時(shí)，菌絲生物量突然上升，這可能是由于酵母粉沒有用完，導(dǎo)致過濾時(shí)殘留在菌絲體中，從而使菌絲生物量陡增，而粗多糖含量卻有所下降，考慮到工廠發(fā)酵經(jīng)濟(jì)問題，我們可以把N源的最適濃度定為15g/L。2.2正交試驗(yàn)結(jié)果與分析試驗(yàn)按照L16(45)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對裂褶菌發(fā)酵全液菌絲生物量進(jìn)行提取試驗(yàn)，結(jié)果見表6。表6正交試驗(yàn)結(jié)果處理號ABCDY（菌絲生物量g/100mL）111110.9780.9650.989212221.1201.1211.124313331.3241.2991.301414441.4701.4591.483521231.2021.1981.197622141.2311.2541.247723411.5211.5121.525824321.7501.7521.754931341.4871.4801.4921032431.5111.5121.5201133221.6321.6311.6371234111.7291.7301.7281341421.7451.7431.7391442311.7991.8001.7971543242.1942.2002.1911644131.8151.8141.815SAS[18]軟件隊(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，結(jié)果見表7和表8。表7SAS處理結(jié)果變異來源自由度平方和均方F值概率值a32.860236730.95341224177.44＜0.0001b31.057890730.3526302465.63＜0.0001c30.145028060.048342699.000.0002d30.136909900.045636638.490.0003區(qū)組20.000149290.000074650.010.9862表8DUNCAN法多重比較結(jié)果Duncan分組平均值NAA1.88767124B1.59075123C1.42858122D1.21942121BA1.69158124A1.66392123AB1.41967122C1.35125121CA1.58625123A1.56167124AA1.53725122AB1.44125121DA1.599124ABA1.56233122BC1.50608121BC1.459123C根據(jù)以上表7中SAS輸出的各因子的F值的大小，得知決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因子的主次順序是：A>B>C>D。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖橇疡蘧z生物量，即處理使菌絲生物量越大效果越好，故根據(jù)表8中DUNCAN測驗(yàn)結(jié)果可知：A4顯著優(yōu)于A1，A2，A3，即葡萄糖的濃度最優(yōu)選取60g/L；B3顯著優(yōu)于B1，B2，但與B4差異不顯著，故酵母粉選取B3或B4均可，但考慮原料成本問題，我們選取B3，即酵母粉濃度15g/L；C2，C3，C4差異不顯著，但顯著優(yōu)于C1，考慮成本問題所以我們選取C2，即磷酸二氫鉀濃度為3g/L；D4與D2沒有顯著差異，但是D4產(chǎn)量高于D2，并且D4與D3，D1有顯著差異，所以我們選取D4，即硫酸鎂濃度為0.7g/L。綜合考慮確定A4B3C2D4最佳，即最優(yōu)的裂褶菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖60g/L，酵母粉15g/L，磷酸二氫鉀3g/L，硫酸鎂0.7g/L。3小結(jié)與討論通過L16（45）正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定了裂褶菌液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配方。比較A，B，C，D四個(gè)因素不同水平下各個(gè)均值，得出影響菌絲生物量的最優(yōu)組合為A4B3C2D4。裂褶菌在葡萄糖濃度為60g/L，酵母粉濃度為15g/L，磷酸二氫鉀濃度為3g/L，硫酸鎂濃度為0.7g/L，28℃，160rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)，待發(fā)酵醪粘稠，生長最快的處理沒有發(fā)酵液時(shí)終止培養(yǎng)，分離獲得最大菌絲生物量為22g/L。由于時(shí)間原因，本文未能得出影響粗多糖產(chǎn)量的最優(yōu)培養(yǎng)基成分組合，最佳培養(yǎng)基配方還有待研究。由于裂褶菌子實(shí)體小，人工栽培生物學(xué)效率只有40％-50％，所以目前國內(nèi)外裂褶菌多糖來源主要依靠深層發(fā)酵，但關(guān)于裂褶菌多糖發(fā)酵和提取的研究主要集中在胞外多糖，對于多糖的研究，目前主要是集中在胞外多糖上。提取胞外多糖需要經(jīng)過發(fā)酵醪的分離工序，但是由于裂褶菌液體發(fā)酵后發(fā)酵醪黏稠，進(jìn)行分離比較困難，而且多糖多數(shù)附著在菌體表面，需要多次沖洗才能將多糖和菌體分離，從而導(dǎo)致后續(xù)提取過程中濃縮成本提高。所以，對裂褶菌發(fā)酵全液進(jìn)行破碎后直接提取多糖有益于生產(chǎn)工藝的簡化和生產(chǎn)成本降低。在多糖醇沉過程中，試劑消耗量較大，操作繁瑣，如何改善提取工藝有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)[1]卯曉嵐.中國經(jīng)濟(jì)真菌[M].北京:科學(xué)出版社,1998,57-59[2]裘維蕃主編.菌物學(xué)大全