ELISA檢測(cè)技術(shù)演示文稿

ELISA檢測(cè)技術(shù)演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)ELISA檢測(cè)技術(shù)目前二頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-LinkedImmunosorbentTest,ELISA)

：基于抗原-抗體反應(yīng)的特異性和等比例性，是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附（包被）在固相載體(聚苯乙烯微量反應(yīng)板，也稱酶標(biāo)板

)表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，加入相應(yīng)的酶底物后發(fā)生顏色反應(yīng)，通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，通過(guò)顏色反應(yīng)的深淺檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原含量的檢測(cè)技術(shù)。目前三頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)ELISA的發(fā)展概況

自從Engvall和Perlman（瑞典，1971）首次報(bào)道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）以來(lái)，由于ELISA技術(shù)具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，將利用基因工程技術(shù)制備的抗原或單克隆抗體包被酶標(biāo)板后，極大地提高了ELISA檢測(cè)技術(shù)的特異性，加之電腦化程度極高的ELISA檢測(cè)儀的使用，使ELISA更為簡(jiǎn)便實(shí)用和標(biāo)準(zhǔn)化，從而使其成為最廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法之一。目前，ELISA檢測(cè)技術(shù)在科學(xué)研究、疾病診斷、檢驗(yàn)檢疫、環(huán)境監(jiān)測(cè)等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。目前四頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)ELISA的基本原理

酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過(guò)分光光度計(jì)進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法?；驹砟壳拔屙?yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)ELISA試劑盒的組成完整的ELISA試劑盒通常包含以下各組分：

（1）已包被抗原或抗體的固相載體（俗稱酶標(biāo)板）；

（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（酶標(biāo)記物）；

（3）酶的底物；

（4）參考標(biāo)準(zhǔn)品（定量試劑盒）及其稀釋液；

（5）酶標(biāo)記物及樣本的稀釋液；

（6）洗滌液（通常為濃縮液，用前按比例稀釋）；

（7）反應(yīng)終止液；（8）封口膜若干、說(shuō)明書一份。目前六頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)酶標(biāo)板目前七頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)ELISA常用酶類辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)DH2+H2O2D+H2O

上式中，DH2為供氫體，H2O2為受氫體。常用底物：

1.鄰苯二胺(OPD)，產(chǎn)物為橙紅色（492nm檢測(cè)）；

2.四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，產(chǎn)物為藍(lán)色，酸性條件下變?yōu)?/p>

黃色（450nm檢測(cè)）。反應(yīng)終止液：HCl或H2SO4溶液。目前八頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)堿性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)常用底物：

1.對(duì)硝基苯磷酸酯(p-NPP)，產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚

（405nm檢測(cè)）；

2.發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于熒光測(cè)定，靈敏度高于顯色底物的方法。反應(yīng)終止液：NaOH溶液。目前九頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)ELISA所需儀器設(shè)備恒溫箱洗板機(jī)酶標(biāo)儀目前十頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)ELISA的類型和方法半定量ELISA試驗(yàn)定量ELISA試驗(yàn)試驗(yàn)?zāi)康脑囼?yàn)性質(zhì)間接法雙抗夾心法(直接夾心法)BAS-ELISA雙夾心法(間接夾心法)競(jìng)爭(zhēng)法ELISA直接法目前十一頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)

直接法ELISA是將酶標(biāo)抗原或抗體直接與包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗原-抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測(cè)定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出包被在酶標(biāo)上的抗體或抗原的量（見后圖）。該方法可用于檢測(cè)抗體或抗原。

直接法ELISA優(yōu)點(diǎn):1.特異性高、準(zhǔn)確性好；

2.實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，用時(shí)短。缺點(diǎn):1.應(yīng)用范圍較小，生產(chǎn)難度大。

——需制備各種酶標(biāo)抗原或抗體。目前十二頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)間接法ELISA

間接法ELISA是將酶標(biāo)記在二抗上，當(dāng)抗體（一抗）和包被在酶標(biāo)板的抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物后，再以酶標(biāo)二抗和復(fù)合物結(jié)合，通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)產(chǎn)物的顏色可以（間接）反映一抗和抗原的結(jié)合情況，進(jìn)而計(jì)算出抗原或抗體的量（見后圖）。該方法可用于抗體檢測(cè)，是目前檢測(cè)抗體最常用的ELISA方法。優(yōu)點(diǎn):1.適用范圍廣，無(wú)需制備特殊的酶標(biāo)抗體;2.制備方便，價(jià)格便宜。目前十三頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)雙抗夾心法ELISA

雙抗夾心法是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，在用酶標(biāo)的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測(cè)定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出捕獲的抗原量，本方法也稱為直接夾心法（見后圖）。

該方法可用于抗原檢測(cè)，例如細(xì)胞因子、激素、蛋白質(zhì)、細(xì)菌、病毒等，是目前檢測(cè)抗原最常用的ELISA方法。優(yōu)點(diǎn):1.適用范圍廣，無(wú)需制備特殊的酶標(biāo)抗體。

2.制備方便，價(jià)格便宜。目前十四頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)雙夾心法ELISA

雙夾心法是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，然后用未標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-未標(biāo)記抗體復(fù)合物；再應(yīng)用酶標(biāo)二抗和抗體-抗原-未標(biāo)記抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗體-抗原-未標(biāo)記抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，也稱為間接夾心法（見后圖）。

該方法可用于抗原檢測(cè)，例如蛋白質(zhì)、病原體等。優(yōu)點(diǎn):1.靈敏度高。

2.制備方便，無(wú)需制備特殊的酶標(biāo)抗體。缺點(diǎn):實(shí)驗(yàn)操作較復(fù)雜。目前十五頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)目前十六頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)BAS-ELISA

BAS-ELISA即生物素-親和素系統(tǒng)（biotinavidinsystem,BAS）ELISA法：是先將抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，然后用生物素（biotin）標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-生物素標(biāo)記抗體復(fù)合物，再依次加入親和素、酶標(biāo)記生物素（或直接加入酶標(biāo)記的親和素），最后加底物顯色。

生物素是一種生長(zhǎng)因子，廣泛分布于動(dòng)、植物體內(nèi)，又稱輔酶R或維生素H。親和素由四個(gè)亞單位組成，對(duì)生物素具有高度親和力，即一個(gè)親和素可以結(jié)合4個(gè)生物素分子。因此，本方法具有信號(hào)放大功能（特點(diǎn)）。

該方法可用于抗原、抗體以及DNA和RNA（生物素）檢測(cè)。目前十七頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)BAS-ELISA實(shí)驗(yàn)原理目前十八頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)法ELISA

競(jìng)爭(zhēng)法ELISA的實(shí)驗(yàn)原理：將包被了抗體的酶標(biāo)板的微孔分為測(cè)定孔和對(duì)照孔，在對(duì)照孔中加入已知濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液和酶標(biāo)記物（酶標(biāo)抗原）；在測(cè)定孔中同時(shí)加入酶標(biāo)抗原和待檢樣本（抗原），酶標(biāo)抗原和樣品互相競(jìng)爭(zhēng)包被抗體的結(jié)合點(diǎn)，形成酶標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物固定在微孔內(nèi)，沒有吸附的酶標(biāo)抗原通過(guò)洗滌去除，加入底物后，復(fù)合物上的酶催化底物生成有色產(chǎn)物。當(dāng)測(cè)定孔內(nèi)的樣本不含抗原時(shí)，固相上的抗體將和酶標(biāo)抗原結(jié)合，加入底物后顯色較深；當(dāng)樣本含有抗原時(shí)，樣本中的抗原和酶標(biāo)抗原共同競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)。酶標(biāo)抗原結(jié)合的比例越高，說(shuō)明結(jié)合在固相抗體上的待測(cè)抗原就越少，反之亦然；在一定的條件下，復(fù)合物上酶的量和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比，用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，從而計(jì)算出參與反應(yīng)的抗原和抗體的量，從而進(jìn)一步得知樣本中抗原的多少。目前十九頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)測(cè)定孔EEEEE酶標(biāo)記物底物溶液對(duì)照孔EEEEEEEEEEEEEEE酶標(biāo)記物底物溶液參考液(不含抗原)EE樣本(含抗原)競(jìng)爭(zhēng)法ELISA實(shí)驗(yàn)原理目前二十頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)半定量ELISA試驗(yàn)?zāi)壳岸豁?yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)間接法檢測(cè)血清HBsAb含量設(shè)計(jì)加板次序(空孔、陰、陽(yáng))加板(陰、陽(yáng)、樣)37℃,30min加酶標(biāo)抗體(空孔除外)洗滌3次，拍干加底物溶液(空孔除外)37℃,10-30min加終止液(空孔除外)避光上機(jī)檢測(cè)、結(jié)果判定(空孔調(diào)零)37℃,30min洗滌3次，拍干目前二十二頁(yè)\總數(shù)二十三頁(yè)\編于十二點(diǎn)雙抗