核酸分子雜交七年制

關(guān)于核酸分子雜交七年制第1頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸分子雜交（nucleicacidmolecularhybridization）是指用標(biāo)記的已知DNA或RNA片段檢測樣品中未知核酸序列，通過堿基互補配對原則發(fā)生同源性結(jié)合，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合的核酸序列的位置或大小顯示出來。探針(probe)：帶有可檢測標(biāo)記的已知序列的DNA或RNA片段。第2頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用：克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測和疾病的診斷等方面。目前核酸分子雜交不僅在分子生物學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛地應(yīng)用,而且在臨床基因診斷上的應(yīng)用也日趨增多。檢測對象:

克隆化的基因組DNA,、細(xì)胞總DNA、總RNA。雜交方法不同，被檢測的核酸可以是提純的，也可以在細(xì)胞內(nèi)雜交,即細(xì)胞原位雜交。核酸分子雜交特點：高度的靈敏性(pg)

、高度的特異性第3頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)核酸分子雜交的基本原理一、變性（denaturation）二、復(fù)性（renaturation）三、雜交（hybridization）四、預(yù)雜交（prehybridization）第4頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

基本原理：DNA變性、復(fù)性與分子雜交第5頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Hybridization第6頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Tm：50%DNA解鏈的溫度，又稱融解溫度。（G、C含量）Tm=69.3+0.41*(G+C)%融解溫度：50％雜化核酸分子解鏈溫度稱為寡核苷酸探針的Tm值。寡核苷酸探針的長度、堿基的含量和核酸的序列決定了探針的Tm值。實際操作中，常選擇低于Tm值5-10℃進行雜交。

Tm=4℃X（G+C）+2℃X（A+T）第7頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月雜交溫度：Tm=81.5℃+161.6logM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（甲酰胺%）M為Na+摩爾濃度，n為探針的復(fù)雜性

例如，一個長度為500bp的探針，（G+C）含量為50%，雜交體系中含5XSSC（0.75mol/LNa+）和50%甲酰胺，則其Tm值為：

Tm=81.5℃+(-2.07)+20.5–1–30.5=68.4℃50%甲酰胺溶液,溫度一般選擇低于Tm值20-25℃雜交溫度應(yīng):68.4℃-25℃=43.2℃甲酰胺是一種變性劑，能干擾堿基堆積力和氫鍵的形成，降低核酸雜交的Tm值，50%的甲酰胺可以使Tm降低30℃第8頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月5’3’5’3’5’3’5’3’影響核酸分子雜交的因素探針的濃度、長度、復(fù)雜性離子強度溫度與變性劑（甲酰胺）雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性

第9頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月預(yù)雜交prehybridization概念：為了減少探針與廣泛存在的非互補核酸的非特異性結(jié)合，在雜交前用封閉物將這些非特異性位點封閉。這一雜交前的處理過程稱為預(yù)雜交。常用的封閉物：（1）變性的非特異性DNA:如鮭魚精DNA、小牛胸腺DNA，又稱為覆蓋DNA。（2）高分子化合物：Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖400、脫脂奶粉第10頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月基本實驗步驟：electrophoresisTransferBlockblocksubstrateprobeMigrationhybridization第11頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)核酸探針probe：帶有可檢測標(biāo)記的已知DNA或RNA片段，用于檢測待測樣品中的靶核酸序列。

核酸探針的類型核酸探針的標(biāo)記方法核酸探針的檢測第12頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月按化學(xué)本質(zhì)分：DNA探針

RNA探針

按標(biāo)記物分：放射性標(biāo)記探針核酸探針的類型

3H、32P、35S、125I等優(yōu)點：高特異性，高靈敏度缺點：存在放射性污染，半衰期短非放射性標(biāo)記探針生物素，地高辛、熒光素等第13頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的探針標(biāo)記法：（1）化學(xué)標(biāo)記法：光敏生物素標(biāo)記法（2）酶促標(biāo)記法：將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，然后利用酶學(xué)的方法將標(biāo)記物摻入到探針分子上。切刻平移法、隨機引物法、末端標(biāo)記法等第14頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月光敏生物素標(biāo)記法:強光10-20分鐘，光敏基團與核酸探針的磷酸基團以共價鍵結(jié)合。第15頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）酶促標(biāo)記法：

將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，然后利用酶學(xué)的方法將標(biāo)記物摻入到探針分子上。

缺口平移法、隨機引物法、末端標(biāo)記法等32P或35S同位素標(biāo)記的單核苷酸dig-dUTP的結(jié)構(gòu)第16頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）缺口平移法由DNA酶Ⅰ和大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。DNA酶Ⅰ：在雙鏈DNA上隨機打開若干個單鏈缺口，產(chǎn)生3’-OH端大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’外切核酸酶活性（nicktranslation）“邊切除、邊聚合”第17頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月最合適的缺口平移片段一般為50-500個核苷酸。DNA酶Ⅰ的用量和E.coliDNA聚合酶Ⅰ的質(zhì)量會影響產(chǎn)物片段的大小。DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性,故應(yīng)使用仔細(xì)純化后的DNA。第18頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月隨機引物（4-6nt）：含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶ⅠKlenow片段：

5’→3’DNA聚合酶活性弱3’→5’外切核酸酶活性無5’→3’外切核酸酶活性（2）隨機引物法（randompriming）第19頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月產(chǎn)物平均長度為400-600個核苷酸。Klenow片段沒有5’→3’外切酶活性,反應(yīng)穩(wěn)定,可以獲得大量的有效探針。反應(yīng)時對模板的要求不嚴(yán)格,用微量制備的質(zhì)粒DNA模板也可進行反應(yīng)。第20頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）探針的末端標(biāo)記：在5’或3’端通過酶促反應(yīng)加上標(biāo)記物酶切第21頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸探針檢測方法同位素標(biāo)記探針：放射自顯影檢測雜交信號

放射自顯影是指利用放射線在x線片的成影作用來檢測雜交信號。取出雜交膜，在Whatman濾紙上晾干，用保鮮膜包好，在暗室中置于X線片上，加增感屏，固定于暗盒內(nèi)，-70℃曝光適當(dāng)時間（1-7天），在暗室中取出X線片，顯影、定影，即可在X線片上讀出雜交帶。第22頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月非放射性標(biāo)記探針：偶聯(lián)反應(yīng)+顯色反應(yīng)Dig：半抗原，可通過抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)與顯色體系偶聯(lián)Dig-DNA探針

+抗Dig抗體-堿性磷酸酶（AP）

或辣根過氧化物酶（HRP）

+底物：BCIP+NBT藍紫色或DAB紅棕色；TMB

藍色第23頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸分子雜交的分類第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)第24頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月一、膜上印跡雜交

印跡技術(shù)：將凝膠中待測的核酸分子轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的方法。指將待測核酸序列結(jié)合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針進行雜交的過程。第25頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月1．固相支持物的選擇特點：較強的結(jié)合核酸的能力（>10μg/cm2）;

與核酸分子結(jié)合后，不影響核酸與探針的雜交反應(yīng);

與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定、牢固，能經(jīng)受雜交、洗膜等；非特異性吸附少，經(jīng)洗膜能將非特異性吸附的探針洗脫掉;

具有良好的機械性能，柔軟性好、韌性強，便于操作。常用的固相支持物：

硝酸纖維膜（NC）、尼龍膜、PVDF膜（聚二氟乙烯膜）等第26頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月固相支持物的選擇良好的固相支持物應(yīng)具備的條件：具有較強的結(jié)合核酸分子的能力（>10μg/cm2）與核酸分子結(jié)合后不影響其與探針分子的雜交反應(yīng)與核酸分子結(jié)合牢固非特異性吸附少具有良好的機械性，柔軟性好、韌性強，便于操作常用的固相支持物硝酸纖維膜、尼龍膜、PVDF膜等第27頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第28頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月第30頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月2．印跡方法Mechanicsoftransfer虹吸印跡法（Capillary）真空轉(zhuǎn)移法（Vacuum）電轉(zhuǎn)移法（Electrophoretic）BlotDNAtomembrane第31頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

CapillaryBlotting(upward)

nospecialequipmentrequired!1975年E.SouthernSouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)DNA片段<1kb，1小時DNA片段>15kb，18小時第32頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Electrophoreticblotting不宜用硝酸纖維素膜一般2~3小時，最多6~8小時especiallygoodforsmallfragmentsresolvedbyPAGE第33頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Vacuumblotting30~60分鐘moreefficientandquantitativethancapillarymustapplyvacuumevenlyandnottoostrongly第34頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月3．印跡類型Southern印跡雜交

Northern印跡雜交斑點及狹縫印跡雜交反向斑點雜交菌落或噬菌斑雜交第35頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月提取DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜，高溫烘烤與DNA或RNA探針雜交放射自顯影Southernblottinghybridization

檢測靶分子為DNA,檢測靶分子是否含有目的基因?？捎糜诨蚪M基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切圖譜分析、基因突變分析等。預(yù)雜交第36頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月PaperTowelsSouthernBlottinghybridizationtissueSDSProtKPhenolChloroSpin提取DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性、轉(zhuǎn)移到NC膜與DNA或RNA探針雜交放射自顯影第37頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Prehyb/Hybridization/Rinses第38頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月

檢測靶分子為DNA,

檢測靶分子是否含有目的基因。DNA指紋圖譜Southern印跡雜交的應(yīng)用：

第39頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Northernblottinghybridization檢測靶分子為RNARNA極易被RNase降解RNA酶抑制劑0.1%DEPC處理水(焦碳酸二乙酯)第40頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月與Southern

blotting

hybridization不同之處：不需要限制性核酸內(nèi)切酶酶切。變性方法不是堿變性，而是采用聚乙二醛和二甲基亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞等方法。應(yīng)用：檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達水平。比較不同組織或細(xì)胞的同一基因的表達情況。Northernblottinghybridization第41頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月pancreaskidneyskeletalliverlungplacentabrainheartmuscleGEFmRNASouthernblottinghybridization第42頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點：簡單、迅速（直接點樣）；可在同一張膜上進行多個樣品的檢測；應(yīng)用：同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋,可以得到半定量的結(jié)果；核酸粗提樣品的檢測效果也較好。Dotandslotblottinghybridization將變性后的DNA或RNA直接點樣與膜上第43頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Reversedothybridization

直接將不同的探針點印并固定在膜上，再將待測的DNA樣品與探針雜交，這樣一次雜交反應(yīng)就可以判斷DNA是否含有這些探針的同源序列。DNAchip第44頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月Colonyorphagehybridization

從重組DNA文庫中篩選陽性克隆

第45頁，課件共49頁，創(chuàng)作于2023年2月二、核酸原位雜交（nu