上海市臨檢中心 PCR技術(shù)人員上崗培訓(xùn)班課件 分子診斷質(zhì)控品

分子診斷質(zhì)控品的特性、選擇和應(yīng)用上海市臨床檢驗(yàn)中心王雪亮1涉及疾病種類2分子診斷實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)現(xiàn)狀GeneReviews：截止2013年05月，已發(fā)現(xiàn)3007種基因疾病，其中2776種已經(jīng)進(jìn)入臨床檢測(cè)，231種仍在研究階段，目前全球已有618個(gè)有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)工作3臨床實(shí)驗(yàn)室如何來保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠？4專家指出采用已知弱陽性和陰性質(zhì)控品進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制是保證檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其監(jiān)控的是實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的最重要的性能指標(biāo)，即重復(fù)性，并決定了當(dāng)批實(shí)驗(yàn)測(cè)定是否有效，報(bào)告能否發(fā)出，是對(duì)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的即時(shí)性評(píng)價(jià)。李金明等，涉及基因擴(kuò)增的個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證的重要性,2012,

35(11),963-9665質(zhì)

控

品定義：用于體外診斷的質(zhì)量控制物質(zhì)，是一種旨在用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)中使用的物質(zhì)、材料等。目的：是評(píng)價(jià)或驗(yàn)證測(cè)量精密度或由于試劑或分析儀器的變化導(dǎo)致的分析偏差等。用途：用于室內(nèi)質(zhì)量控制、室間質(zhì)量評(píng)價(jià)等。6質(zhì)控品的種類?

根據(jù)有無測(cè)定值可分為定值質(zhì)控品和非定值質(zhì)控品。?

根據(jù)質(zhì)控品的物理性狀不同分為凍干質(zhì)控品、液體質(zhì)控品和固體質(zhì)控品。7正確選用質(zhì)控品（基本要素）?

基質(zhì)效應(yīng)小質(zhì)控結(jié)果能真實(shí)反映性能提高不同系統(tǒng)間質(zhì)控結(jié)果可比性?

穩(wěn)定性好，有效期長(zhǎng)質(zhì)控參數(shù)可長(zhǎng)期使用避免由于質(zhì)控品問題導(dǎo)致的假陰性?

監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過程8正確選用質(zhì)控品（擴(kuò)展要素）?

液體質(zhì)控品消除復(fù)溶過程可能引入的誤差，減少瓶間差?

已知靶值或預(yù)期結(jié)果定量測(cè)定：陽性（高、低濃度）、陰性定性測(cè)定：陽性（接近測(cè)定下限）、陰性?

價(jià)格便宜?

生物安全性9常用質(zhì)控品類型?

臨床樣本?

細(xì)胞系?

人工制備樣本9

基因組DNA9

質(zhì)粒9

體外轉(zhuǎn)錄RNA9

假病毒顆粒10臨

床

樣

本11臨

床

樣

本HCV臨床樣本作為質(zhì)控品鄧演超等，國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2013,34(3):271-273組織樣本作為分子病理質(zhì)控品DequekerEMet

al,JMolDiagn,2016,18(2):205-14.12臨

床

樣

本優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：?

真實(shí)樣本?來源有限?

評(píng)價(jià)整個(gè)分析過程

??

包含所需基因序列

?最優(yōu)樣本生物傳染性可能存在異質(zhì)性13臨床樣本制備質(zhì)控品注意事項(xiàng)?

制備方法應(yīng)規(guī)范，制定相關(guān)的SOP文件?

應(yīng)經(jīng)過質(zhì)量檢驗(yàn)，保證與預(yù)期結(jié)果相符。14細(xì)

胞

系MeissnerJD,JGen

Virol.

1999Jul;80(Pt7):1725-33.NAMALWA細(xì)胞用于EBV檢測(cè)CYP2C19不同基因型王雪亮等,檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),

2015,30(11):

1078-1082LinGetal,PLoS

One,2015,10(7):e0134174.16細(xì)

胞

系缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：?

細(xì)胞株有限?

模擬真實(shí)樣本，穩(wěn)定性好?

評(píng)價(jià)整個(gè)分析過程?

生物安全性實(shí)用樣本?

易于制備，成本低17人工合成樣本——基因組DNA?

經(jīng)驗(yàn)證的臨床樣本?

已知基因突變的細(xì)胞系1819人工合成樣本——基因組DNA優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：?

有已知的突變位點(diǎn)

?非“真實(shí)”樣本?

樣本均一?

可再生??不能監(jiān)測(cè)提取過程可能發(fā)生基因重排或丟失20人工合成樣本——質(zhì)粒21Eklund

C,etal,2012,J.Clin.

Microbiol,50:2289–2298.vander,

etal,2008,Pharmacogenomics,9:1261–6.人工合成樣本——質(zhì)粒優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：?

明確的基因序列?非“真實(shí)”樣本?

易于生產(chǎn)，價(jià)格便宜?

不能監(jiān)測(cè)提取過程?

無感染性?

穩(wěn)定性好24人工合成樣本——體外轉(zhuǎn)錄RNA25ChangMetal,JClinVirol.2012,55(2):128-33.人工合成樣本——體外轉(zhuǎn)錄RNA優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：?

明確的基因序列?

穩(wěn)定性差?

具有再生性?

無感染性?

不能監(jiān)測(cè)提取過程27人工合成樣本——假病毒顆粒Pasloske

BL

etal.,J

ClinMicrobiol.1998Dec;36(12):3590-4.人工合成樣本——假病毒顆粒優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：?

明確的基因序列?

監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過程?

生物安全性?

專利保護(hù)，價(jià)格昂貴?

表面結(jié)構(gòu)不同，不能充分模擬真實(shí)病毒?

穩(wěn)定性好目前現(xiàn)狀？?

分子診斷項(xiàng)目快速增長(zhǎng)?

新的技術(shù)發(fā)展（如NGS、數(shù)字PCR等）引入新的檢測(cè)項(xiàng)目但是……對(duì)于絕大多數(shù)分子診斷項(xiàng)目，現(xiàn)在還不能提供陽性質(zhì)控品（經(jīng)過確認(rèn)的更是少之又少?。?0例如：囊胞性纖維癥(CF)基因檢測(cè)?

信息收集自35個(gè)美國(guó)臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室?所有臨床實(shí)驗(yàn)室開展至少美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)院（ACMG）推薦的23個(gè)CF等位基因?所有臨床實(shí)驗(yàn)室鑒定102個(gè)不同的CF等位基因?

僅有42個(gè)等位基因有相應(yīng)的細(xì)胞系60個(gè)等位基因還沒有可用的細(xì)胞！31專家指出盡管少部分分子檢測(cè)項(xiàng)目已有質(zhì)控物質(zhì)，但是大部分的分子檢測(cè)項(xiàng)目還是缺乏有效的質(zhì)控物質(zhì)。其次，現(xiàn)在的多元質(zhì)控物質(zhì)商品的開發(fā)也不夠成熟。實(shí)驗(yàn)室更愿使用免費(fèi)的患者標(biāo)本或者根本不進(jìn)行質(zhì)量控制，只有罕見突變才勉強(qiáng)花錢購買質(zhì)控品。王治國(guó)等，分子診斷質(zhì)量控制面臨的問題，2012，6(30)，466-467032官方機(jī)構(gòu)-WHO/官方機(jī)構(gòu)-GeT-RM官

方

機(jī)

構(gòu)——其他?American

Type

Culture

Collection/?Coriell

Cell

Repositories/?European

Collection

ofCell

Cultures.uk/?GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultureshttps://www.dsmz.de/?Japanese

Collection

of

Research

Bioresourceshttp://cellbank.nibiohn.go.jp/english/?Riken

Bioresource

Centerhttp://en.brc.riken.jp/35商業(yè)化公司?

Acrometrix?

QiagenMarseille/cn//?

InVivoScribe?

AdvancedBiotechnologies//?

LGC

Standards?

Diagnostic

Hybrids/epages/?

Maine

Molecular

Quality

Controls?

Zeptometrix//?

Molecular

Controls?

SeracareLifeSciences//default.aspx?

Asuragen?

Hologic

(Third

Wave

Technologies)//en/36質(zhì)控品的使用?

已知陽性質(zhì)控?

已知陰性質(zhì)控?

空白（無模板）37陽性質(zhì)控品?

定性檢測(cè)9

接近方法測(cè)定下限濃度?

定量檢測(cè)9

測(cè)定線性范圍內(nèi)的高、低濃度38陰性質(zhì)控品?

監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室以前擴(kuò)增產(chǎn)物的污染?

實(shí)驗(yàn)操作所致樣本間的交叉污染?

試劑污染39空白管質(zhì)控?

監(jiān)測(cè)擴(kuò)增試劑是否發(fā)生污染，具有較強(qiáng)的污染鑒別性?

監(jiān)測(cè)反應(yīng)液加樣區(qū)及加樣過程是否發(fā)生污染?

鑒別實(shí)驗(yàn)室是否發(fā)生污染40質(zhì)控品使用的注意事項(xiàng)?

均勻分散于臨床標(biāo)本中，與臨床標(biāo)本同時(shí)處理?

擴(kuò)增時(shí)不應(yīng)將質(zhì)控品放于固定孔中，放置位置應(yīng)順延以便監(jiān)測(cè)每孔的擴(kuò)增效率?

質(zhì)控品雖經(jīng)滅活處理，但仍具有潛在的傳染性，仍應(yīng)按傳染性樣本對(duì)待，注意防護(hù)措施?

注意質(zhì)控品最佳保存條件，使用完畢后應(yīng)及時(shí)放回，如發(fā)生下述情況嚴(yán)禁使用9

已過有效期9

樣本管已發(fā)生泄漏9

樣本管標(biāo)記無法識(shí)別41失控分析42失控分析?

實(shí)驗(yàn)操作人員在檢測(cè)樣本時(shí)，如發(fā)現(xiàn)質(zhì)控檢測(cè)數(shù)據(jù)不符合質(zhì)控規(guī)則，應(yīng)在室內(nèi)質(zhì)控記錄單上簡(jiǎn)述失控原因。?

失控的原因主要包括：操作失誤、質(zhì)控品失效、儀器維護(hù)不良等。43失控分析?

操作失誤——主要是人為因素9

加樣問題（漏加、錯(cuò)加等）9

試劑及樣本識(shí)別9

誤讀誤判9

其他操作問題（如：離心條件、操作不標(biāo)準(zhǔn)等）44失控分析?

質(zhì)控品問題9質(zhì)控品過期9保存不當(dāng)，如冷凍樣本冷藏保存，造成核酸降解9操作或意外污染：手工加樣過程中交叉污染或加錯(cuò)樣。45失控分析?

儀器設(shè)備等：9

PCR儀、離心機(jī)、加樣器、恒溫設(shè)備等應(yīng)建立技術(shù)檔案，應(yīng)定期進(jìn)行校準(zhǔn)維護(hù)9開機(jī)檢查，查看前一工作日實(shí)驗(yàn)檢測(cè)報(bào)告及維護(hù)記錄9常用耗材：吸頭、離心管等46失控后處理?

重新測(cè)定同一質(zhì)控品，應(yīng)確認(rèn)以下情況：9質(zhì)控品是否在有效期內(nèi)9檢測(cè)試劑是否有問題9儀器、設(shè)備、耗材的應(yīng)用情況是否出現(xiàn)異常查明是否有人為誤差，另外還可以查出偶然誤差，即重測(cè)的結(jié)果在允許范圍內(nèi)（在控）。如果重測(cè)的結(jié)果不在允許范圍內(nèi)，則可以進(jìn)行下一步操作。47失控后處理?

新開一瓶質(zhì)控品，重新測(cè)定失控項(xiàng)目?

主要目的：如果結(jié)果正常，說明原來質(zhì)控品可能保存條件不當(dāng)，發(fā)生核酸降解。如果仍然不在允許范圍，則進(jìn)行下一步。48失控后處理?

維護(hù)儀器，重測(cè)失控項(xiàng)目，應(yīng)確認(rèn)以下問題9懷疑試劑問題9儀器存在不穩(wěn)定情況（以往或近期）主要目的：檢查儀器狀態(tài)，運(yùn)行條件是否被更改。檢查試劑，此時(shí)可更換試劑以查明原因。如結(jié)果仍不在允許范圍，則進(jìn)行下一步。49失控后處理?

確認(rèn)正確應(yīng)用以上步驟都未能得到在控結(jié)果，那就有可能是儀器的潛在問題或試劑的特殊原因，應(yīng)上報(bào)質(zhì)量主管、主任。?

對(duì)多次的質(zhì)控失敗查找原因，確認(rèn)消除后才能開展正常檢測(cè)工作。50陰性樣本做出陽性結(jié)果？主要考慮——污染問題：?

如實(shí)驗(yàn)室以前擴(kuò)增產(chǎn)物污染、樣本間交叉污染、試劑污染、試驗(yàn)耗材、操作污染等?

科研工作中導(dǎo)致的質(zhì)粒污染51陽性樣本檢測(cè)為陰性結(jié)果？主要考慮：?

試劑問題：Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶失活、探針純度標(biāo)記效率、核酸提取試劑效率等?

質(zhì)控品：核酸降解?

人為因素：核酸提取中隨機(jī)誤差、漏加樣本、識(shí)別錯(cuò)誤、判讀錯(cuò)誤?

儀器問題：如擴(kuò)增儀孔間溫度不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度不一致性等52弱陽性樣本檢測(cè)為陰性結(jié)果？?

表明目前實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)精確度低，導(dǎo)致未檢出弱陽性樣本，需關(guān)注以下問題：9

試劑因素：可以考慮更換新一瓶試劑進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)此因素后，應(yīng)啟用新試劑9

質(zhì)控品因素