二代測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建 羅氏診斷羅博士

Fredrick

Sangerandhisfirst

generationsequencing–ddNTPchain-terminationmethod.PCR,

inventedbyKary

Mullis,becomes

thefoundationofsequencing.JamesWatson

&FrancisCrick

discovered

DNAstructure.NanoporeMinionPacBio

Sequel3-generationsequencingrealizes

high-throughputandlongread-lengthsequencing–

3GSsequencers

(PacBio,Nanopore,

etc.)Sangersequencingautomationsolution–

CEsequencer

(ABI

3130,3730,

3500

etc.)Next-generation

sequencingrealizes

high-throughputandlow

costsequencing–

NGSsequencers

(Illumina,

IonTorrent,

SOLiD,454,etc.)NGS

libraryPPi橋式PCR-成簇反應(yīng)NGS

library可逆終結(jié)子

-邊合成邊測(cè)序NGS

library液滴PCR電位計(jì)

-

半導(dǎo)體測(cè)序NGSlibrary?????片段化、修飾及環(huán)化滾環(huán)擴(kuò)增

(RCA)DNA納米球

(DNB)形成DNB陣列加載cPAS測(cè)序反應(yīng)

(類似SBS)建庫(kù)到底是在干什么？①④②③④①②雙端標(biāo)簽文庫(kù)①

與流動(dòng)槽（FlowCell）結(jié)合的區(qū)域②

Read1和Read2測(cè)序引物結(jié)合的區(qū)域③

插入片段④

標(biāo)簽序列區(qū)域（Index）文庫(kù)制備的目的是在需要測(cè)序的DN

片段兩端加上能夠與測(cè)序儀配合的接頭序列（Multiplexed,

SR,P

）測(cè)序&分析原始樣品收集樣品富集核酸提取核酸定量&質(zhì)控文庫(kù)制備文庫(kù)定量&質(zhì)控靶向富集

片段化

mRNA富集，rRNA去除（可選）

片段化

反轉(zhuǎn)錄（一、二鏈合成）

加A加接頭

擴(kuò)增

末端修復(fù)

加A加接頭

擴(kuò)增（可選）DNA建庫(kù)RNA建庫(kù)Genomic

DNAFragmentationEND

repairClean-up

or

Size

selectionClean-upA-tailingClean-upAdapter

ligationClean-up

or

Size

selectionPCR

amplification(Optional)Clean-up

or

Size

selectionNGS

library?

物理打斷?

液體剪切力（HydroShear）強(qiáng)

大弱

小?

氮?dú)猓∟ebulization）?

聚焦聲波（Covaris）?

超聲（Bioruptor）?

酶切片段化?

轉(zhuǎn)座酶（Nextera）?

混合酶（KAPA,

NEB）?

末端補(bǔ)平?

將粘性末端補(bǔ)平，使片段化后的DNA變?yōu)槠侥┒?

Klenow酶用于雙鏈DNA

5'突出末端的補(bǔ)平(fill-in)；?

雙鏈DNA

3'突出的打平(也稱削平)?

PNK酶磷酸化5’端?

加A尾?

在所有平末端DNA的3’端加上一個(gè)A堿基?

能夠有效防止接頭二聚體和多連體的形成?

在連接酶作用下，測(cè)序接頭與DNA片段進(jìn)行TA連接?

常見(jiàn)的Illumina接頭如下圖左上角所示，為Y型接頭?

右圖為NEBUltra所采用的環(huán)形接頭，需要在后續(xù)PCR過(guò)程中加上測(cè)序所需的部分序列（P5、P7以及index（BC））Clean-up

or

Size

selection?

片段篩選?

利用磁珠進(jìn)行片段篩選是目前的主流方法?

也可用切膠回收的方法進(jìn)行?

PCR擴(kuò)增?

目的性富集兩頭均成功連接上接頭的片段Total

RNAEnrichment

(polyA+/rRNA-)FragmentationEND

repairA-tailingAdapter

ligation1st

strand

synthesis2nd

strand

synthesisPCR

amplification(Optional)NGS

library1)

RNA經(jīng)熱和鎂處理碎片化,

隨機(jī)引物退火2)

第一條鏈合成過(guò)程中，引物延伸3)

第二條鏈合成過(guò)程中,

Uracils插入從而“標(biāo)記”鏈UUUUUUU

U

U

U

U

U

U

U

U4)

dAMP被添加到

3’端，促進(jìn)連接AU

U

U

U

U

U

U

U

UAU

U

U

U

U

U

U

U

U5)

連接接頭AAU

U

U

U

U

U

U

U

UU

U

U

U

U

U

U

U

U6)

由于Uracils的存在,

文庫(kù)擴(kuò)增過(guò)程中只有第一條鏈擴(kuò)增U

U

U

U

U

U

U

U

UcfDNA

片段分布規(guī)律性極高正常個(gè)體cfDNA濃度波動(dòng)小胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法）

(安諾優(yōu)達(dá)基因科技（北京）有限公司

國(guó)械注準(zhǔn)20173400331)胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測(cè)試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法）

(華大生物科技（武漢）有限公司

國(guó)械注準(zhǔn)20173400059)胎兒染色體非整倍體(T13、T18、T21)檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法）

(杭州杰毅麥特醫(yī)療器械有限公司

國(guó)械注準(zhǔn)20203400070)胎兒染色體非整倍體(T21、

T18、

T13)

檢測(cè)試劑盒(半導(dǎo)體測(cè)序法)

(東莞博奧木華基因科技有限公司

國(guó)械注準(zhǔn)20203400708)胎兒染色體非整倍體（T13/T18/T21）檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法）

(杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司

國(guó)械注準(zhǔn)20153400461)胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法）

(成都凡迪醫(yī)療器械有限公司

國(guó)械注準(zhǔn)20193400772)胎兒染色體非整倍體21三體、18三體和13三體檢測(cè)試劑盒（半導(dǎo)體測(cè)序法）

(廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司

國(guó)械注準(zhǔn)20193400773)采血核酸提取核酸定量&質(zhì)控文庫(kù)定量&質(zhì)控靶向富集血漿分離DNA文庫(kù)構(gòu)建（無(wú)需片段化）?MGIEasy

血漿游離DNA文庫(kù)制備試劑盒?MGIEasy

血漿游離DNA文庫(kù)制備（板式）試劑盒離心模塊、樣品模塊、樣本制備模塊、測(cè)序模塊采樣咽喉拭子肺灌洗液腦脊液胸腔積液血液核酸提取核酸定量

質(zhì)控文庫(kù)定量&質(zhì)控靶向富集病原富集&（根據(jù)樣本）（反向富集-降低人源）DNA/RNA組織文庫(kù)構(gòu)建糞便…DNA

+

RNA病原reads比例過(guò)低發(fā)現(xiàn)早篩診斷治療復(fù)發(fā)監(jiān)控用藥指導(dǎo)/MDxe.g.靶藥，免疫治療輔助診斷MRD,耐藥經(jīng)濟(jì)性-靈敏度-準(zhǔn)確性?

檢測(cè)范圍：整個(gè)基因組?

測(cè)序深度：~30X?

30X數(shù)據(jù)量：~90G?

檢測(cè)內(nèi)容:

全部外顯子(約占基因組的2%)?

測(cè)序深度：50X

-100X?

50X-100X數(shù)據(jù)量：5G-10G（50M

Panel大小

捕獲效率50%）?

檢測(cè)內(nèi)容:

目標(biāo)區(qū)域?

測(cè)序深度：>500X?

500X數(shù)據(jù)量：1G（1M

Panel大小

捕獲效率50%）原始樣品收集核酸提取核酸定量&質(zhì)控文庫(kù)定量&質(zhì)控靶向富集組織/FFPE樣品富集血液顯微切割文庫(kù)制備DNA文庫(kù)+質(zhì)檢純化蠟塊制備組織活檢福爾馬林固定石蠟包埋保存臨時(shí)保存可以室溫，最佳保存溫度為4°C為了防止組織自溶和RNA表達(dá)改變，盡量縮短取材和操作時(shí)間。固定時(shí)間對(duì)核酸的完整性沒(méi)有明顯影響，但實(shí)驗(yàn)表明擴(kuò)增效率降低，尤其是大片段脫水不充分會(huì)造成核酸嚴(yán)重降解；用低熔點(diǎn)石蠟包埋，便于后續(xù)脫蠟；免疫組化染色會(huì)造成核酸進(jìn)一步降解核酸提取腫瘤區(qū)域評(píng)估脫蠟消化解交聯(lián)DNA損傷修復(fù)指南建議選取腫瘤比例>20%的蠟塊提取核酸，必要時(shí)做腫瘤區(qū)域富集推薦的最高溫度是90°C，

蛋白酶k進(jìn)行組織加熱解除蛋白-DNA結(jié)合、解除DNA修飾、解除DNA-DNA的交聯(lián)。通常85-尿嘧啶糖基化酶（UDG）可修復(fù)C>U的堿基變異，否則數(shù)據(jù)中會(huì)出現(xiàn)T假70°C5min得到的DNA最適用于N