免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)10標(biāo)記技術(shù)

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹浚簩W(xué)習(xí)免疫組織化學(xué)技術(shù)【實(shí)驗(yàn)器材】：小腸石蠟切片(Ag)、染色缸、染色架、二甲苯、95%及無(wú)水乙醇、蒸餾水、雙氧水、山羊血清、一抗（單抗）、二抗、三抗試劑盒、DAB顯色劑、PBS緩沖液、沖洗架、顯微鏡。實(shí)驗(yàn)10免疫組織化學(xué)技術(shù)

一、組織標(biāo)本的取材【實(shí)驗(yàn)方法】

組織大?。洪L(zhǎng)1cm×寬1cm×厚0.2～0.3cm。二、組織標(biāo)本的固定

1.目的

(1)防止組織細(xì)胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài)。

(2)使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖和酶等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時(shí)相仿。（3）使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起

來(lái)而產(chǎn)生不同的折射率，造成光學(xué)

上的差異，以便染色后易于鑒別和

觀察。

（4）固定劑兼有硬化作用、使組織硬化、

增加組織硬度、便于制片。（5）防止細(xì)胞過(guò)度收縮或膨脹而失

去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。

（6）經(jīng)過(guò)固定的組織能對(duì)染料產(chǎn)生

不同的親和力而著色清晰，便

于辨認(rèn)。2.固定液的種類

(1)甲醛固定液

10％福爾馬林

10％中性福爾馬林

10％中性緩沖福爾馬林

(2)4％多聚甲醛固定液等

3.漂洗

已固定的組織樣品，在切片之前必須進(jìn)行漂洗，其主要目的是洗去組織中存余的固定液。三、組織脫水、浸蠟及包埋

1.目的由于石蠟不溶于水和醇類試劑，只溶解在二甲苯類試劑中。因而,組織經(jīng)固定和水洗后含大量水分,需用乙醇類試劑進(jìn)行脫水,水脫完后,組織內(nèi)含有大量的乙醇,還必須用能溶解乙醇的二甲苯來(lái)置換,最后經(jīng)浸蠟,組織細(xì)胞內(nèi)被大量石蠟支稱,才使組織能用于石蠟切片。2.脫水劑的種類：非石蠟溶劑的脫水劑和脫水兼石蠟溶劑的脫水劑。

常用的脫水劑:(1)乙醇；(2)丙酮；等

3.常用的透明劑：

(1)二甲苯；(2)甲苯；(3)苯；等

4.脫水原則

脫水方法甚多，一般需逐級(jí)進(jìn)行脫水，否則可引起組織強(qiáng)烈收縮，組織變形。

在脫水完全的前提下，組織的透明必須徹底，但不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)引起組織切片困難。5.常規(guī)石蠟包埋過(guò)程

(1)脫水：70％、80％、90％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ，

無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ。

(2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ。

(3)浸蠟：石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ。

(4)石蠟包埋：修蠟塊，標(biāo)號(hào)小動(dòng)物組織脫水、透明和浸蠟時(shí)間

70％、80％、90％乙醇各30min，95％乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h，無(wú)水乙醇Ⅰ和Ⅱ各30min，二甲苯Ⅰ15min,Ⅱ10min，Ⅲ10min（肉眼觀察），石蠟Ⅰ30min，石蠟Ⅱ30min，石蠟Ⅲ1～2h。四、組織切片、和貼片

切片可分石蠟切片、冰凍切片、火棉膠切片，IHC切片要求不同與常規(guī)切片，需連續(xù)有序，防止脫片等特殊要求。1.切片前的準(zhǔn)備工作

(1)載玻片的清潔：市售載玻片需經(jīng)清潔液泡24h，流水沖洗，系列乙醇浸泡，涼干涂膠。(2)切片粘合劑的種類

多聚賴氨酸（分子量300KD）：0.5%濃度。

APES試劑（3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干凈載玻片→丙酮5min→APES（1ml+50ml丙酮）：用鑷子夾住浸入APES試劑1～3次→純丙酮洗二次→干燥玻片→用鋁箔包好，室溫或4℃保存?zhèn)溆?。鉻礬明膠液：

鉻礬0.5g明膠5gH2O21000ml

甲醛明膠液：

40％甲醛2.5ml明膠0.5gH2O2100ml

2.石蠟切片要求及注意事項(xiàng)：

(1)連續(xù)切片按序貼在玻片的下1/3。

(2)37℃烤片18h以上。

(3)切片厚2～4μm。

(4)切片刀要快。

(5)編上號(hào)。

(6)切片可在4℃保存數(shù)年。

3.切片、展片、貼片和烤片：

在切片機(jī)上切片，置水水浴箱中展片、貼片，貼好的片子置于37℃過(guò)夜或60℃2h

。①石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，下行酒精至水。PBS沖洗，

3min×2次；

石蠟切片脫蠟復(fù)水步驟：

二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，80％乙醇5min，70％乙醇5min，流水沖洗。

②3%H2O2/甲醇溶液，20min(阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶)；

PBS沖洗，3min×2次；

③滴加正常羊血清工作液封閉，37℃20min，傾去勿洗；五、切片免疫組化染色步驟（5-HT:5-羥色胺）④滴加第一抗體，37℃孵育

60min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照）；PBS沖洗，3min×2次；⑤滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育

30min；PBS沖洗，3min×2次；⑥滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30min；PBS沖洗，3min×2次；

⑦DAB/H2O2

染色，自來(lái)水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。

免疫組化染色步驟【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】細(xì)胞質(zhì)中有棕褐色顆粒者為5-HT陽(yáng)性細(xì)胞。漿陽(yáng)性漿陽(yáng)性出現(xiàn)背景著色的幾種原因

●

內(nèi)源性過(guò)氧化酶沒有完全阻斷●脫蠟不徹底●組織粘貼劑使用不當(dāng)或太濃●

PBS沖洗不夠

●抗體稀釋不合理，濃度太高

●底物顯色時(shí)間太長(zhǎng)5-HT

5-羥色胺(5-HT)又名血清素，約90%合成和分布于腸嗜鉻細(xì)胞，5-HT作為神經(jīng)遞質(zhì)，主要分布于松果體和下丘腦，可能參與痛覺、睡眠和體溫等生理功能的調(diào)節(jié)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT含量/功能異?？赡芘c精神病、偏頭痛等多種疾病的發(fā)病有關(guān)。1.加山羊血清的作用是什么?

防止非特異性染色。組化染色時(shí)，在加入一抗前，加入與第二抗體相同的動(dòng)物源血清（非免疫血清）吸附封閉底物組織上的帶電荷物質(zhì)（蛋白物質(zhì)的物理吸附位點(diǎn)），然后再進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，必要時(shí)也