FCM技術(shù)在國際上已被廣泛的應用于2022優(yōu)秀文檔

FLOWCYTOMERTYANDITSAPPLICATIONONMEDICALSCIENCESHIXUEGENGFLOWCYTOMERTY簡稱FCML/MWBC+DCE/M豐富發(fā)展對細胞周期的認識一、FCM原理&儀器結(jié)構(gòu)

二、FCM醫(yī)學生物學應用絕對計數(shù)

陽性群體的絕對數(shù)量（個細胞/微升）

例如：AIDS患者CD4＋50個細胞/ul血;

CD34+造血干/祖細胞絕對計數(shù)目前已在歐美，日本等西方國家中開始逐步采用，成為血液腫瘤的國際標準分類方案。單個分散細胞懸液的制備

2.異倍體DNA偏離的程度生物學行為：腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、利用細胞吸咐等的生物學特性圖中縱軸一般為細胞數(shù)。新分類標準將傳統(tǒng)的細胞組織形態(tài)學和臨床特征與現(xiàn)代的免疫表型和遺傳變異相整合，比現(xiàn)有的FAB白血病分類方案，多種淋巴瘤分類方案有明顯的改進和提高。樣品制備、醫(yī)學生物學應用高分辨流式細胞術(shù)是一種血液病理學檢測方法，它利用先進的流式細胞術(shù)和產(chǎn)權(quán)獨有的數(shù)據(jù)分析方法來為臨床血液腫瘤提供一種早期和準確的診斷和分型手段細胞周期與細胞動力學參數(shù)測定免疫活性細胞功能的測定

(1)混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗(MLC)

(2)細胞介導細胞毒試驗

(3)細胞吞噬功能試驗

(4)血清中自身免疫抗體的檢測

(5)細胞因子（cytokines）的分泌能力培養(yǎng)了一批有綜合能力的人才細胞團塊、細胞碎片盡可能少FCM技術(shù)在國際上已被廣泛的應用于腫瘤血液病免疫性疾病艾滋病器官移植等方面的常規(guī)臨床檢查中，并已成為上述疾病診斷、疾病監(jiān)控、治療選擇、療效判斷和預后估計等至關(guān)重要、甚至唯一的方法。

近年WHO已公布了全新的血液淋巴組織腫瘤分類標準

見:美國臨床腫瘤協(xié)會舉辦“臨床腫瘤雜志”（JournalofClinicalOncology，Vo17No12，1999：PP3835—3849）;世界衛(wèi)生組織腫瘤國際組織學分類手冊（Springer—Verlay出版社，2000版）新分類標準將傳統(tǒng)的細胞組織形態(tài)學和臨床特征與現(xiàn)代的免疫表型和遺傳變異相整合，比現(xiàn)有的FAB白血病分類方案，多種淋巴瘤分類方案有明顯的改進和提高。目前已在歐美，日本等西方國家中開始逐步采用，成為血液腫瘤的國際標準分類方案。新的WHO分類標準中細胞免疫表型分析主要是依靠FCM來檢測1978年國家科委重點項目：研制國內(nèi)第一臺激光流式細胞儀1982年國內(nèi)第一臺三參數(shù)激光流式細胞儀誕生1984年國家科委組織科研成果的鑒定驗收1985年獲國家衛(wèi)生部科技成果乙等獎1985年-靈敏度、信噪比、更多參數(shù)流式分選儀研制計算機四參數(shù)軟件開發(fā)樣品制備、醫(yī)學生物學應用第一幅直方圖：雞紅血細胞+蛙紅血細胞LXJ流式細胞計填補國內(nèi)空白全部采用國產(chǎn)元器件培養(yǎng)了一批有綜合能力的人才促進了FCM先進技術(shù)在各領(lǐng)域應用1984年在全國率先開設：研究生課程《分析細胞學技術(shù)》一、FCM原理&儀器結(jié)構(gòu)

二、FCM醫(yī)學生物學應用一、FCM原理&儀器結(jié)構(gòu)

二、FCM醫(yī)學生物學應用FluorescenceActivatedCellSorterOrtho30FACS420FACScanFACScaliburFACStarPlusFACSVantageEPICSALTRA

FC500FACSAria

FCM細胞大群體的分析

高統(tǒng)計學精度

單細胞多參數(shù)相關(guān)分析

更多、更精確的信息

以往其它細胞學技術(shù)不可比擬的1、FCM儀器的一般結(jié)構(gòu)2、細胞信號的檢測與分析3、FCM測量數(shù)據(jù)的處理例如：敗血癥患者：264個CD64抗原分子/個中性粒細胞1984年在全國率先開設：(一)細胞動力學中的應用生物學行為：腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、多參數(shù)測量另一重要意義是通過有關(guān)參數(shù)進行“設門”(gating)分析。細胞遺傳學改變所致

分化過程中基因表達的異常

細胞功能和細胞表型等

一系列的異常各種免疫細胞的表型分析血液腫瘤的原發(fā)性診斷和鑒別利用細胞吸咐等的生物學特性培養(yǎng)了一批有綜合能力的人才利用細胞物理學特性差異B細胞系(CD19，CD20)在相同的條件下，熒光反應產(chǎn)物的量（熒光強度）與所研究的生化成份的含量或活性之間有嚴格的化學定量關(guān)系培養(yǎng)了一批有綜合能力的人才(X、Y、Z三軸互為正交)1、FCM儀器的一般結(jié)構(gòu)2、細胞信號的檢測與分析3、FCM測量數(shù)據(jù)的處理細胞樣品熒光１ＰＭＴ熒光２ＰＭＴ熒光３ＰＭＴ側(cè)向散射光ＰＭＴ流動室鞘液前向散射光檢測器光束成形系統(tǒng)針孔裝置負高壓板正高壓板充電環(huán)細胞分選收集器廢液收集器收集器激光２激光１(X、Y、Z三軸互為正交)TEM00細胞樣品熒光１ＰＭＴ熒光２ＰＭＴ熒光３ＰＭＴ側(cè)向散射光ＰＭＴ流動室鞘液前向散射光檢測器光束成形系統(tǒng)針孔裝置負高壓板正高壓板充電環(huán)細胞分選收集器廢液收集器收集器激光２激光１X、Y、Z三軸互為正交FCM關(guān)鍵技術(shù)單細胞流

單細胞照明

單細胞檢測1、FCM儀器的一般結(jié)構(gòu)2、細胞信號的檢測與分析3、FCM測量數(shù)據(jù)的處理熒光染料化學技術(shù)的發(fā)展降低儀器造價簡化儀器設計方便儀器調(diào)試、操作推動FCM的應用起著十分積極的作用。1、FCM儀器的一般結(jié)構(gòu)2、細胞信號的檢測與分析3、FCM測量數(shù)據(jù)的處理（1）FCM數(shù)據(jù)的存貯

ListMode

(2)FCM數(shù)據(jù)顯示方式

a.單參數(shù)顯示

單參數(shù)直方圖表示的是一個測量參數(shù)與細胞數(shù)量間的統(tǒng)計分布關(guān)系

細胞多個測量參數(shù)中每一參數(shù)的測量數(shù)據(jù)都可整理為其統(tǒng)計分布，以分布直方圖(distributionhistogram)來顯示。圖中橫軸為該參數(shù)測量強度相對值，單位是道數(shù)。強度分布可以是線性的，也可以是對數(shù)的。圖中縱軸一般為細胞數(shù)。

b.雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示點陣圖、等高線圖、密度圖和三維立體顯示等細胞雙參數(shù)測定不僅能提供二個參數(shù)各自與細胞數(shù)量的關(guān)系，更重要的是獲得了這二參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系，其中包含了更多、更重要的生物學信息。

在FCM分析中，形態(tài)與結(jié)構(gòu)相似、具備相同功能的細胞群體其測量值總是相近的。這些細胞在單參數(shù)直方圖上以一個分布峰出現(xiàn)。在雙參數(shù)散點圖上，測量值相近或離散的細胞群總表現(xiàn)為散點的密集或稀疏，這在等高線輪廓圖上可用不同顏色或標有不同細胞數(shù)的各種曲線輪廓來表示。

要記住，在FCM數(shù)據(jù)顯示中，結(jié)構(gòu)和功能相同的細胞亞群總表現(xiàn)為集中分布的趨勢。不同的細胞亞群有其各自的分布區(qū)域。

FlowSortingc.多參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示、分析若干個單參數(shù)直方圖和各種不同組合的雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示來反映各種信息的。多參數(shù)測量另一重要意義是通過有關(guān)參數(shù)進行“設門”(gating)分析?？梢允菃螀?shù)設門，也可以是雙參數(shù)設門。通過設門來調(diào)閱其他參數(shù)的有關(guān)信息。（一）ＦＣＭ儀器的原理

（二）ＦＣＭ樣品制備技術(shù)1.單個分散細胞懸液的制備

2.選擇性分離細胞亞群

3.細胞熒光染色技術(shù)1.單個分散細胞懸液的制備

●酶消化法

●機械法

●化學試劑處理法

常用的酶類試劑酶反應的條件酶消化法的一般程序和步驟●機械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法等●化學試劑處理法：將對細胞的貼壁粘連行為有重要作用的二價鈣、鎂離子結(jié)合掉，從而使細胞分散常用的試劑：EDTA、EGTA、TPB等評判細胞懸液制備的標準細胞團塊、細胞碎片盡可能少細胞呈單個分散狀態(tài)分散過程中細胞的活性不受到明顯的損害以保證下一步的熒光染色處理。2.選擇性分離細胞亞群利用細胞物理學特性差異自然沉降法密度梯度離心法電泳法離心鼓淘汰法利用細胞吸咐等的生物學特性利用選擇性破壞部分細胞MACS&FCM多參數(shù)分析評判細胞分離結(jié)果的指標：收獲率：所得的細胞數(shù)占原細胞樣品中該亞群細胞數(shù)的百分比純度：是指分離后的樣品中該亞群細胞所占的百分比。3.細胞熒光染色技術(shù)

注意:實際工作中

避免使用固定劑

盡可能減少離心和漂洗次數(shù)

FCM的熒光細胞化學過程要求有足夠的特異性，即所用熒光染料與所感興趣的細胞成份是否為特異性結(jié)合。

嚴格控制各種反應條件是保證反應特異性的重要因素。在相同的條件下，熒光反應產(chǎn)物的量（熒光強度）與所研究的生化成份的含量或活性之間有嚴格的化學定量關(guān)系一、FCM原理&儀器結(jié)構(gòu)

二、FCM醫(yī)學生物學應用A.百分率計算（細胞群體組成）

各種陽性細胞所占的百分含量（%）

例如：CD3：70%淋巴細胞

CD19：10%淋巴細胞

在各種生理、病理情況下的變化遵循一定的規(guī)律。

B.絕對計數(shù)

陽性群體的絕對數(shù)量（個細胞/微升）

例如：AIDS患者CD4＋50個細胞/ul血;

CD34+造血干/祖細胞絕對計數(shù)

C.抗原分子表達絕對定量

抗體結(jié)合數(shù)量，若知道抗原與抗體結(jié)合的化合價，可以計算出抗原的表達量（個分子/細胞）。

例如：敗血癥患者：264個CD64抗原分子/個中性粒細胞D.單細胞多色熒光分析三色、四色或更多色熒光的檢測從多個不同角度更客觀地更可靠地識別各類功能不同的細胞亞群如：Th細胞，CD3+CD4+CD8-CD45+白血病細胞免疫表型分析等E.膜、胞漿、核相關(guān)分析膜免疫表型+細胞漿內(nèi)功能狀態(tài)如：Th1/Th2細胞分析：cytokines的分泌急性髓系白血?。耗た乖?胞漿MPO（髓過氧化物酶）等膜抗原表達+FISH：表型和核型F.可溶性物質(zhì)分析CBA系統(tǒng)（CytometricBeadAssay）

Luminex100系統(tǒng)細胞因子、趨化因子、激素分子、蛋白激酶、過敏原、細胞信號傳導相關(guān)蛋白和核苷酸片段等

一、細胞生物學中的應用(一)細胞動力學中的應用1.細胞周期與細胞動力學參數(shù)測定2.豐富發(fā)展對細胞周期的認識3.理化因素及藥物的細胞動力學作用機理4.研究抗腫瘤藥物合理使用與配伍方案設計(二)細胞分化研究細胞分化過程中同時分析其增殖過程的變化，常常可提供十分重要的信息。通過檢測和定量細胞膜上各種分化抗原。

不同分化階段的造血細胞

形態(tài)有其一定變化

膜分化抗原的不同組合

特殊抗原表達量的變化

（三）細胞凋亡研究

細胞壞死(Necrosis)

細胞凋亡(Apoptosis)細胞凋亡過程中

形態(tài)學變化

細胞生化變化

細胞功能改變

FCM凋亡檢測的基礎(chǔ)和依據(jù)二.細胞遺傳學中的應用流式核型分析(Flowkaryotype)特定的染色體分選純化三.免疫學中的應用1.各種免疫細胞的表型分析

T淋巴細胞

B淋巴細胞

NK淋巴細胞巨噬細胞

DC等2.雜交瘤細胞的篩選與克隆

3.免疫活性細胞功能的測定

(1)混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗(MLC)

(2)細胞介導細胞毒試驗

(3)細胞吞噬功能試驗

(4)血清中自身免疫抗體的檢測

(5)細胞因子（cytokines）的分泌能力

四.腫瘤學中的應用腫瘤細胞增殖動力學DNA異倍體細胞群體異倍體細胞多少異倍體DNA偏離的程度腫瘤細胞生物學特征癌前病變生物學行為：腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、復發(fā)、化療療效交界瘤細胞DNA倍體測定

一個客觀的、定量的指標臨床腫瘤病理不可缺少的一個方面五.血液學中的應用(一)各種血細胞的計數(shù)與分類(二)各種造血細胞的研究(三)血液病學中的應用各種膜抗原在正常造血細胞分化成熟過程的不同階段或出現(xiàn)或消失，或表達增強，或表達降低，都遵循一定的規(guī)律研究表明這些抗原都是具有一定生物學功能的效應分子，它們參與造血細胞發(fā)育成熟過程中的免疫應答和調(diào)控作用造血干/祖細胞的分選純化白血病細胞

分化成熟受阻

增殖異常

凋亡障礙白血病細胞“雙表型”現(xiàn)象(Biphenotype)

血病細胞作為一種惡性細胞

異常細胞的分化程序

“發(fā)育不同步”(DevelopmentalAsynchronous)

“系列不保真性”(LineageInfidelity)細胞遺傳學改變所致

分化過程中基因表達的異常

細胞功能和細胞表型等

一系列的異常1.白血病細胞免疫表型分析細胞系抗原：B細胞系(