基因工程操作流程

關于基因工程操作流程第1頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月為什么RNA聚合酶能夠僅在啟動子處結合呢?啟動子處的核苷酸順序具有特異的形狀以便與RNA聚合酶結合，就好像酶與其底物的結構相恰恰適合一樣。將100個以上啟動子的順序進行了比較，發(fā)現(xiàn)在RNA合成開始位點的上游大約10bp和35bp處有兩個共同的順序，稱為-10和-35序列。這兩個序列的共同順序如下，-35區(qū)“AATGTGTGGAAT”，-10區(qū)“TTGACATATATT”。大多數(shù)啟動子均有共同順序（consensussequence)，只有少數(shù)幾個核苷酸的差別。第2頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月終止子第3頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質編碼區(qū):非編碼區(qū):原核細胞的基因結構有調控作用，含啟動子、終止子等。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子第4頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）真核細胞的基因結構(補)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點內含子外顯子

能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內含子：

外顯子：

第5頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質的______和具有調控作用的______區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結構比較連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第6頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月1.2基因工程的基本操作程序①從細胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質粒④DNA重組⑤用重組質粒轉化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因第7頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定第8頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月目的基因——主要指編碼蛋白質的結構基因,也可以是一些具有調控作用的因子。取出DNA用限制酶切斷DNA

目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。1.目的基因的獲取第9頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月基因文庫的種類：基因組文庫：含有一種生物所有的基因部分基因文庫：含有一種生物的一部分基因（如：cDNA文庫）獲取目的基因的方法一：從基因文庫中獲取目的基因基因文庫（genelibrary）的概念：將含有某種生物的不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。第10頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月組織或細胞染色體DNA限制性核酸內切酶DNA片段重組DNA分子含重組分子的轉化菌載體受體菌基因組文庫存在于轉化細菌內，由載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。第11頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月mRNA逆轉錄酶cDNA雙鏈cDNA重組DNA分子載體含重組分子的轉化菌受體菌用某種生物發(fā)育的某個時期的mRNA制備雙鏈的cDNA后，建立的基因文庫。cDNA文庫第12頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）無有基因中內含子（位于編碼蛋白質序列內的非編碼DNA片段）無有基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以第13頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR(polymerasechainreaction)

——多聚酶鏈式反應是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。通過此技術，可獲取大量的目的基因。

獲取目的基因方法二：利用PCR技術擴增目的基因

PCR擴增儀第14頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月原理：DNA雙鏈復制反應過程：1.變性：將反應系統(tǒng)加熱至90℃-95℃，使模板DNA完全變性成為單鏈；2.退火：將溫度下降至55℃-60℃左右，使引物與模板DNA退火結合；3.延伸：將溫度升至70℃-75℃，DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA的合成反應。

上述三個步驟為一個循環(huán)，經(jīng)25～30次循環(huán)后，可將模板DNA擴增達百萬倍。反應體系：模板DNA、特異性引物、 耐熱DNA聚合酶、dNTP及緩沖液第15頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

利用PCR技術擴增目的基因第16頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA合成儀過程：

適用范圍：已知核苷酸序列，基因的核苷酸數(shù)量較少。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成

獲取目的基因方法三：化學合成法

第17頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月小結:目的基因的獲?。喝N方法(1)從基因文庫中獲取適用于目的基因序列為未知的情況(2)利用PCR技術擴增適用于目的基因的序列為已知的情況(3)人工合成適用于目的基因不是很大且其序列是已知的第18頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月基因表達載體的組成目的基因啟動子終止子標記基因等標記基因：鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。2、基因表達載體的構建第19頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的受體細胞

動物、植物、微生物轉化：

目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。3、目的基因導入受體細胞第20頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月1）將目的基因導入植物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法轉化方法2）將目的基因導入動物細胞顯微注射技術3）將目的基因導入微生物細胞常用CaCl2第21頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月1）將目的基因導入植物細胞常用方法：---農桿菌轉化法

適用范圍：雙子葉植物和裸子植物轉化過程：第22頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月1）將目的基因導入植物細胞——基因槍法基因槍法又稱微彈轟擊法，是籍高速度運動的金屬微粒將附著于其表面的核酸分子引入到受體細胞中的一種遺傳物質轉化技術。這是單子葉植物中常用的一種基因轉化方法，但是成本較高此技術最早由我國學者周光宇提出的，植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。1）將目的基因導入植物細胞——花粉管通道法第23頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月2）將目的基因導入動物細胞顯微注射技術第24頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月3）將目的基因導入微生物細胞大腸桿菌細胞的轉化方法：用Ca+（常用CaCl2）處理細菌細胞，以增大細胞壁的通透性，使細胞處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)——感受態(tài)細胞。將重組表達載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合，在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子，完成轉化。第25頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月1)分子水平的檢測檢測目的基因是否插入了轉基因生物的染色體DNA上檢測目的基因是否轉錄出了mRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質檢測方法：DNA分子雜交技術檢測方法：分子雜交技術檢測方法：抗原-抗體雜交4、目的基因的檢測和鑒定第26頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA分子雜交技術該方法是根據(jù)堿基互補配對原則，把互補的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學發(fā)光催化劑等進行標記，之后同被檢測的DNA中的同源互補序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。第27頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月

如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品含有目的基因或目的基因已經(jīng)轉錄。第28頁，課件共30頁，創(chuàng)作于20