維尼生物科技有限公司胰凝乳蛋白酶的制備

胰凝乳蛋白酶的制備胰凝乳蛋白酶的制備產(chǎn)品簡(jiǎn)介1實(shí)訓(xùn)目標(biāo)2實(shí)訓(xùn)原理3實(shí)訓(xùn)試劑與設(shè)備4生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)5產(chǎn)品檢測(cè)6產(chǎn)品簡(jiǎn)介一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介胰凝乳蛋白酶chymotrypsin又叫糜蛋白酶，是一種典型的絲氨酸蛋白酶，脊椎動(dòng)物的消化酶。EC3.421.1。在胰臟中以酶前體物質(zhì)胰凝乳蛋白酶原的形態(tài)生物合成，隨胰液分泌出去。在小腸受到胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的一定的分解，轉(zhuǎn)變成活性的胰凝乳蛋白酶。屬于肽鏈內(nèi)切酶（從肽鏈中間特殊的肽鏈位點(diǎn)將多肽裂解成小片斷；作用位點(diǎn)——中間特殊的肽鏈位點(diǎn)），主要切斷多肽鏈中的芳香族氨基酸殘基的羧基一側(cè)。

胰凝乳蛋白酶的制備實(shí)訓(xùn)目標(biāo)1.掌握鹽析法分離酶的基本原理和操作；2.掌握結(jié)晶的基本方法和操作；3.學(xué)習(xí)胰凝乳蛋白酶制備的方法。胰凝乳蛋白酶的制備實(shí)訓(xùn)原理胰凝乳蛋白酶的制備蛋白質(zhì)分子表面帶有一定的電荷，因同種電荷相互排斥，使蛋白質(zhì)分子彼此分離；同時(shí)，蛋白質(zhì)分子表面分布著各種親水基團(tuán)，這些基團(tuán)與水分子相互作用形成水化膜，增加蛋白質(zhì)水溶液的穩(wěn)定性。如果在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，蛋白質(zhì)分子表面的電荷被大量中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。由于不同的蛋白質(zhì)分子表面所帶的電荷多少不同，分布情況也不一樣，因此不同的蛋白質(zhì)鹽析所需的鹽濃度也各異。鹽析法就是通過控制鹽的濃度，使蛋白質(zhì)混合液中的各個(gè)成分分步析出，達(dá)到粗分離蛋白質(zhì)的目的。實(shí)訓(xùn)試劑與設(shè)備一、試劑和材料1、新鮮豬胰臟2、0.125mol/LH2SO4溶液3、固體（NH4）2SO4，4、1%酪蛋白溶液：稱取酪蛋白1.0g，加pH為8.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液100mL，在沸水中煮5min使之溶解，冰箱中保存。5、磷酸鹽緩沖液：0.1mol/L，pH為7.46、0.1mol/LNaOH溶液，1%BaCl2。胰凝乳蛋白酶的制備實(shí)訓(xùn)試劑與設(shè)備二、實(shí)驗(yàn)器材高速組織搗碎機(jī)，解剖刀，鑷子，剪刀，燒杯（50mL、100mL），離心機(jī)，離心管，漏斗，紗布，棉線，吸管（10mL、5mL、2mL、1mL、0.5mL），玻璃棒，滴管，透析袋，臺(tái)秤，分析天平，離心機(jī)。胰凝乳蛋白酶的制備生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)一、生產(chǎn)前準(zhǔn)備1、檢查生產(chǎn)原料、各種生產(chǎn)用試劑；2、檢查生產(chǎn)設(shè)備；3、檢查生產(chǎn)記錄等文件二、生產(chǎn)操作1、胰凝乳蛋白酶提?。喝⌒迈r豬胰臟，放在盛有冰冷0.125mol/LH2SO4的容器中，保存在冰箱中待用。去除胰臟表面的脂肪和結(jié)締組織后稱重。用組織搗碎機(jī)絞碎，然后混懸于2倍體積的冰冷0.125mol/LH2SO4溶液中，放冰箱內(nèi)過夜。將上述混懸液離心10min，上層液經(jīng)2層紗布過濾至燒杯中，將沉淀再混懸于等體積的冰冷的0.125mol/LH2SO4溶液中，再離心，將兩次上層液合并，即為提取液。胰凝乳蛋白酶的制備生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)2、胰凝乳蛋白酶分離：取提取液10mL，加固體（NH4）2SO41.14g達(dá)0.2飽和度，放置10min，離心（3000r/min）10min。棄去沉淀，保留上清液。在上清液中加入固體（NH4）2SO41.323g達(dá)0.5飽和度，放置10min離心（3000r/min）10min。棄去上清液，保留沉淀。將沉淀溶解于3倍體積的水中，裝入透析袋中，用pH為7.4的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液透析，直至1%BaCl2檢查無白色BaSO4沉淀產(chǎn)生，然后離心（3000r/min）5min。棄去沉淀（變性的酶蛋白），保留上清液。在上清液中加（NH4）2SO4（0.39g/mL）達(dá)0.6飽和度，放置10min，離心（3000r/min）10min。棄去上清液，保留沉淀（即為胰凝乳蛋白酶）。胰凝乳蛋白酶的制備生產(chǎn)實(shí)訓(xùn)3、胰凝乳蛋白酶結(jié)晶：取分離所得的胰凝乳蛋白酶溶于3倍體積的水中。然后加（NH4）2SO4（1.14g/mL）至胰凝乳蛋白酶溶液達(dá)0.25飽和度，用0.1mol/LNaOH調(diào)節(jié)至pH6.0，在室溫（25～30℃）放置12h即可出現(xiàn)結(jié)晶。胰凝乳蛋白酶的制備產(chǎn)品檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)試劑與器材

N-乙酰-L-酪氨酸乙酯（ATEE）、磷酸緩沖溶液二、檢測(cè)器材試管、吸管、容量瓶、量筒、電子分析天平、比色皿、722型分光光度計(jì)。胰凝乳蛋白酶的制備產(chǎn)品檢測(cè)一、檢測(cè)前準(zhǔn)備1、檢測(cè)裝運(yùn)、各種檢測(cè)用試劑2、檢查檢測(cè)記錄等文件二、產(chǎn)品檢測(cè)1、試樣處理：取23.7mgN-乙酰-L-酪氨酸乙酯（ATEE），加入0.067M磷酸緩沖溶液（pH值）50mL，溫?zé)崾蛊淙芙猓鋮s后用同一緩沖溶液稀釋到100mL。2、酶活力測(cè)定：胰凝乳蛋白酶溶于0.0012N鹽酸液中，使其12~16μ（USP單位）/mL，吸取200μL酶液，加入含有3mL底物的溶液的比色杯中，速搖勻后，即在237nm處測(cè)定光吸引值的增加。每30s讀數(shù)一次，連續(xù)讀數(shù)5min，5min內(nèi)光吸收值上升，應(yīng)呈線性關(guān)系。每分鐘吸收值增加0.0075為一個(gè)酶活力單位。胰凝乳蛋白酶的制備產(chǎn)品檢測(cè)3、酶活力計(jì)算：每毫克胰凝乳蛋白酶活力單位（P）=A5－A0/5×0.