第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝演示文稿

第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝演示文稿目前一頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點優(yōu)選第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝目前二頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點3制藥微生物生產(chǎn)菌種如何選育？發(fā)酵過程中主要檢測的參數(shù)有哪些？發(fā)酵工藝過程如何控制？知識回顧目前三頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點4主要內(nèi)容抗生素的概述：（1）抗生素的定義（2）抗生素的命名（3）抗生素的分類青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝：（重點）（1）青霉素的概述

（2）生產(chǎn)菌的生物學特性

（3）發(fā)酵工藝過程

目前四頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點51抗生素的定義和命名（1）抗生素的定義

早期：一般認為來源于微生物，且主要作用于細菌感染。故認為抗生素(antibiotics)是微生物在代謝過程中產(chǎn)的，在低濃度下就能抑制它種微生物生長和活動，甚至殺死他種微生物的化學物質(zhì)。由于抗生素的這種殺菌能力，我們曾經(jīng)把這類物質(zhì)叫做抗菌素。目前五頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點6現(xiàn)在：來源：隨著抗生素研究和生產(chǎn)的發(fā)展，新的抗生素的來源正在擴大。可以是微生物、植物（如蒜素、常山堿、黃連素、長春花堿、魚腥草素等）、動物（如魚素、紅血球素等）。但抗生素的工業(yè)化生產(chǎn)主要是來自微生物的大量發(fā)酵法，微生物是抗生素舞臺上的主角。作用對象：病毒、細菌、真菌、原生動物、寄生蟲、藻類、腫瘤細胞等。因此不能把抗生素僅僅作為抗菌藥物。

目前六頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點7定義：雖然抗生素已被廣泛使用，但是由于抗生素的多樣性，關于抗生素的定義在專家中一直存在著分歧。目前，一個大多數(shù)專家所接受的定義是：抗生素是由生物（包括某些微生物、植物和動物在內(nèi)）在其生命活動過程中產(chǎn)生的或（化學合成獲得的），能在低濃度下有選擇地抑制他種生物機能的低分子量的有機物質(zhì)。狹義的定義是：抗生素是低分子量的微生物代謝產(chǎn)物，能在很低的濃度下抑制其他微生物的生長。目前七頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點8

按生物的來源：凡是在動、植物或微生物產(chǎn)生的，可按來源命名。如青霉素、赤霉素、蒜素按化學結構命名：化學結構性質(zhì)清楚的，如四環(huán)素（含有四并苯的基本母核），氯四環(huán)素（金霉素），氧四環(huán)素（土霉素）。名稱R1R2微生物來源四環(huán)素HH金色鏈霉菌金霉素HOH金色鏈霉菌土霉素ClH龜裂鏈霉菌其它：紀念意義、產(chǎn)地、俗名如正定霉素、井岡霉素、金霉素和土霉素等。（2）抗生素的命名（一般分為三類）目前八頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點9

HNONSCH3CH3HCOO-H-lactamringβ-內(nèi)酰胺環(huán)RnaturalpenicillinR=CH2-CO-目前九頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點10β-內(nèi)酰胺環(huán)苯甲異噁唑青霉素氨芐青霉素羧芐青霉素苯氧甲基青霉素目前十頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點112抗生素的發(fā)展簡史2.1治療和發(fā)展我國的發(fā)展：1953年5月1日，建立了第一個生產(chǎn)青霉素的抗生素工廠（上海第三制藥廠）；1958年6月3日，最大的抗生素聯(lián)合企業(yè)建成投產(chǎn)（華北制藥廠,石家莊），也是青霉素發(fā)酵總容積居世界首位。目前，多為原料藥基地。但在半合成及成品藥的劑型方面與國外相比差距很大。目前十一頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點12抗生素濫用的重災區(qū)中國是抗生素使用大國，也是抗生素生產(chǎn)大國：年產(chǎn)抗生素原料大約21萬噸，出口3萬噸，其余自用（包括醫(yī)療與農(nóng)業(yè)使用)，人均年消費量138克左右(美國僅13克)。2011年4月7日是世界衛(wèi)生日，首屆合理用藥大會在這一天召開，恰好契合了世界衛(wèi)生日的主題——“抵御耐藥性：今天不采取行動，明天就無藥可用”。目前十二頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點13“后抗生素時代”如果不再控制抗生素的濫用狀態(tài)，二十一世紀人類有可能失去抗生素這個有利的治療武器，重新回到?jīng)]有抗生素的時代，所謂“后抗生素時代”。后抗生素時代是倒退，我們可能回到?jīng)]有藥物可使用的狀態(tài)，大量的傳染性疾病將危害人類的身體健康和生命。雖然這是一種悲觀的想法，但悲觀的很有道理，細菌產(chǎn)生耐藥速度比新藥物開發(fā)的速度快得多，這是一個確實的現(xiàn)象。目前十三頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點143抗生素的分類可根據(jù)生物來源、作用對象、化學結構、作用機制、生物合成途徑等方面對抗生素進行分類。3.1根據(jù)抗生素的生物來源分類(生物學家)（1）放線菌產(chǎn)生的抗生素：如鏈霉素、四環(huán)類（如四環(huán)素）、大環(huán)內(nèi)酯類（如紅霉素）、多烯類（如制霉菌素）

、放線菌素類（如放線菌素D）等。（其中鏈霉菌屬最多，諾卡氏菌屬、小單孢菌次之）（2）真菌產(chǎn)生的抗生素：如青霉菌屬和頭孢菌屬等分別產(chǎn)生一些很重要的抗生素（青霉素、灰黃霉素、頭孢菌素）。目前十四頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點15（3）細菌產(chǎn)生的抗生素：如多粘桿菌、枯草桿菌、芽孢桿菌等。如多粘菌素。（4）植物或動物產(chǎn)生的抗生素：從被子植物蒜中制得的蒜素；從動物臟器中制得的魚素等。3.2根據(jù)抗生素的作用對象分類（醫(yī)生、病理學家）（1）廣譜抗生素：如氨卞青霉素既抑制G+，又抑制G-（2）抗G+的抗生素：如青霉素，（3）抗G-的抗生素：如鏈霉素（3）抗真菌的抗生素：如制霉菌素（4）抗病毒的抗生素：如四環(huán)類抗生素對立克次氏體及較大病毒有一定作用。（5）抗癌的抗生素：如阿霉素目前十五頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點163.3根據(jù)抗生素的化學結構分類（化學家）較復雜，目前已確定結構的抗生素習慣如下分類：（1）β-內(nèi)酰胺類抗生素：包括青霉素類，頭孢菌素類等（2）氨基糖苷類抗生素：包括鏈霉素、慶大霉素等（3）大環(huán)內(nèi)脂類抗生素：如紅霉素、麥迪加霉素（4）四環(huán)類抗生素：如四環(huán)素、土霉素（5）多肽類抗生素：如多粘菌素、桿菌肽（6）蒽環(huán)類抗生素：如阿霉素、柔紅霉素（7）喹諾酮類抗生素：如環(huán)丙沙星、諾氟沙星目前十六頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點173.4根據(jù)作用機制分類此種分類的優(yōu)點：便于進行理論研究，有助于了解抗生素影響病原體新陳代謝的哪些環(huán)節(jié)，從而找出治療的規(guī)律，使抗生素的使用更為合理。（1）抑制細胞壁合成的抗生素：如青霉素。（2）影響細胞膜功能的抗生素：多烯類抗生素。（3）抑制病原菌蛋白質(zhì)合成的抗生素：四環(huán)素。（4）抑制核酸合成的抗生素：如影響DNA結構和功能的絲裂霉素C。（5）抑制生物能作用的抗生素：如抑制電子轉移的抗霉素。目前十七頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點18目前十八頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點193.5根據(jù)抗生素的合成途徑分類（1）氨基酸、肽類衍生物抗生素：如青霉素類、頭孢菌素等寡肽抗生素。（2）糖類衍生物抗生素：如鏈霉素等糖苷類抗生素。（3）以乙酸、丙酸為單位的衍生物抗生素：紅霉素等丙酸衍生物。目前十九頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點20生產(chǎn)方法：1、生物合成法：

①傳統(tǒng)方法②“工程菌”制造法③細胞融合技術法

2、化學合成法；3、生物合成加化學合成法。

4抗生素的生產(chǎn)工藝目前二十頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點21

1、生物合成法：

①傳統(tǒng)方法大多數(shù)抗生素是由放線菌和霉菌產(chǎn)生的。菌種是通過從土壤中分離、篩選獲得，一般采用深層通風攪拌發(fā)酵罐生產(chǎn)。傳統(tǒng)方法目前存在很多不足，因此，人們采用基因工程和細胞融合技術，對抗生素產(chǎn)生菌進行了改造和重新設計，不僅可以制造出許多高效低毒的新型抗生素，還可改革工藝，使抗生素產(chǎn)量成倍地增長。目前二十一頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點22②“工程菌”制造法

第一次由“工程菌”制造的全新抗生素—麥迪紫紅素A，是美國報道的。他們將產(chǎn)放線紫紅素的部分基因插入產(chǎn)麥迪霉素的放線菌中，構建的“工程菌”產(chǎn)生了全新的抗生素。我國新構建的生產(chǎn)丁胺卡那霉素的“工程菌”，就是把?；富蚩寺〉娇敲顾禺a(chǎn)生菌中獲得的。新的“工程菌”生產(chǎn)的新抗生素毒副作用小，對耐卡那霉素、慶大霉素致病菌臨床療效顯著。目前二十二頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點23③細胞融合技術法

對抗生素產(chǎn)生菌采用細胞融合技術的成果更為突出。橄欖色無孢小單孢菌細胞融合株抗生素產(chǎn)率比原菌株提高140倍。目前DNA重組技術已廣泛用于紅霉素、鏈霉素等20多種抗生素的育種工作，可以預見不久將來會有更多的由“工程菌”生產(chǎn)的新型抗生素問世。目前二十三頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點242、化學合成法

根據(jù)某種抗生素的化學組成和結構，通過化學合成的方法，可生產(chǎn)部分抗生素。如：氯霉素、磷霉素等。經(jīng)過化學合成方法和控制條件的不斷深入研究，越來越多的抗生素可用化學合成法生產(chǎn)。目前二十四頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點253、生物合成加化學合成法

許多細菌逐漸出現(xiàn)了抗藥性，已經(jīng)證實某些抗藥性因子位于細菌內(nèi)的質(zhì)粒上，質(zhì)?？梢栽诩毦g轉移，結果抗性菌日益增多，抗生素療效就越來越低。為了對付細菌的抗藥性，科學家對原有的抗生素進行了“整容手術”，細菌因再無法識別改頭換面的抗生素而被抑制或殺死?，F(xiàn)在已能使用克隆了?；富虻摹肮こ叹保ù竽c桿菌）高效率的生產(chǎn)半合成抗生素。臨床現(xiàn)在使用的貴重特效藥物先鋒霉素（頭孢菌素類）、氨芐青霉素，就是這類半合成抗生素類藥物。國外已有幾十種這類藥物在實驗室研制成功。目前二十五頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點26抗生素制備的一般流程圖

菌種孢子制備種子制備發(fā)酵發(fā)酵液預處理及種子加濾提取及精制成品檢驗前體發(fā)酵階段提取階段成品包裝目前二十六頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點5青霉素概述27目前二十七頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點28青霉素的理化性質(zhì)青霉素本身為一元酸，可與鉀、鈉、鎂、鈣、鋁和銨等化合成鹽類。易溶于水，游離酸易溶于醇、酮、醚、酯等一般有機溶劑。游離酸或鹽類的水溶液均不穩(wěn)定，極易失去抗菌效力。不耐熱，一般保存于冰箱中，但青霉素鹽的結晶純品，在干燥條件下可于室溫保存數(shù)年。青霉素的抗菌效力與其分子中的β-內(nèi)酰胺環(huán)有關。目前二十八頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點29抗菌作用和臨床應用青霉素主要抑制G+菌，但對某些G-菌，螺旋體及放線菌也有強大的抗菌作用，青霉素的抗菌作用與抑制細胞壁的合成有關。青霉素臨床上用于治療葡萄球菌傳染癥如腦膜炎、化膿炎、骨髓炎等，溶血性鏈球菌傳染癥如腹膜炎、產(chǎn)褥熱，以及肺炎、淋病、梅毒和炭疽等。目前二十九頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點30菌種：產(chǎn)黃青霉生長發(fā)育分七個階段：Ⅰ—Ⅳ期：菌絲生長期，適宜做種子；Ⅳ—Ⅴ期：青霉素分泌期；Ⅵ期：菌絲體自溶期。5.1青霉素生產(chǎn)菌的特性點青霉目前三十頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點31青霉素產(chǎn)生菌的生長過程分生孢子發(fā)芽期菌絲繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒減少，小空孢大空孢自溶菌絲生長期青霉素分泌期菌絲自溶期目前三十一頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點

第1期：分生孢子萌發(fā)，具有小泡。 第2期：菌絲繁殖，嗜堿性，類脂肪小顆粒。 第3期：脂肪包涵體，貯藏物，嗜堿性很強。

第4期：空泡，嗜堿性減弱，開始產(chǎn)生抗生素。 第5期：大空泡，中性染色大顆粒，脂肪包涵體 消失，青霉素產(chǎn)量最高。 第6期：個別細胞自溶，胞內(nèi)無顆粒，釋放氨，

pH上升。 第7期：菌絲完全自溶，僅有空細胞壁。發(fā)酵培養(yǎng)下的生長過程及細胞學變化目前三十二頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點

鏡檢控制規(guī)定時間取樣，顯微鏡觀察7個時期的態(tài)變化，控制發(fā)酵。1－4期為菌絲生長期，3期的菌體適宜種子。4－5期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強，通過工程措施，延長此期，獲得高產(chǎn)。第6期到來之前結束發(fā)酵。目前三十三頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點帶放補料工6.1青霉素生產(chǎn)流程結晶器種子罐1和2米孢子預處理罐過濾器發(fā)酵罐萃取器蒸發(fā)器工業(yè)鹽提煉工藝藝發(fā)冷凍干燥孢子瓊脂斜面酵

培養(yǎng)基制備無菌空氣冷至15℃6.青霉素發(fā)酵工藝過程目前三十四頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點

(1)、生產(chǎn)孢子制備斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，最適溫度25-26℃，培養(yǎng)6-8天，形成單菌落。再傳斜面，培養(yǎng)7天，形成綠色斜面孢子。 米孢子：移植到小米或大米固體培養(yǎng)基 上，生長7天，25℃

注意：每批孢子必需進行嚴格搖瓶試 驗，測定效價及雜菌情況。6.2青霉素發(fā)酵工藝過程目前三十五頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點(2)、種子罐培養(yǎng)工藝

一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。

培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等?？諝饬髁?：3（體積比）；充分攪拌300-350rpm；

pH自然，溫度27±1℃,40h

二級種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10％ 培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等。 通氣量1:1-1.5；攪拌250-280rpm；pH自然，25±1℃。10-14h

質(zhì)量：菌絲致密，菌絲粗壯，III期，倍增期6-8h目前三十六頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點(3)、生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝

三級罐：生產(chǎn)罐；接種量20％ 培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨， 硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油.

參數(shù)條件： 通氣量1：；150-200r/min； 前60小時，26℃；

60小時后:pH6.7,24℃。目前三十七頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點6.3發(fā)酵培養(yǎng)與過程控制

操作方式：反復分批式發(fā)酵 發(fā)酵罐：100m3，裝料80m3.

帶放:6-10次，帶放量10％，間隔24h。 發(fā)酵周期：180-220h發(fā)酵過程需連續(xù)流加葡萄糖、硫酸銨以及前體物質(zhì)苯乙酸鹽，補糖率是最關鍵的控制指標，不同時期分段控制。目前三十八頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點過程控制——補料分批操作控制基質(zhì)濃度

前40小時：培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物

40小時后：低速連續(xù)補加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，維持一定的最適濃度。 半饑餓狀態(tài)：延長合成期，提高產(chǎn)量。 碳源占成本12％以上，采用糖化液流加,降低成本。 糖與6APA結合形成糖基-6APA，影響青霉素產(chǎn)量。目前三十九頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點a.流加碳源控制

根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。殘?zhí)牵プ笥?，pH開始升高時流加糖。 葡萄糖的波動范圍較窄，濃度過低使抗生素合成 速度減慢或停止，過高則導致呼吸活性下降，甚至 引起自溶。

(1)培養(yǎng)基目前四十頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點b.流加氮源控制

玉米漿:最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。 補加無機氮源：硫酸銨、氨水、尿素 氨基氮濃度：0.01-0.05%。目前四十一頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點c.鹽離子控制

無機鹽：硫、磷、鎂、鉀等。 鐵對青霉素合成有毒，30-40ug/ml以下。 罐壁涂環(huán)氧樹脂保護層。目前四十二頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點d.添加青霉素側鏈前體

時期：合成階段 種類：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、 苯乙酰甘氨酸 毒性：抑制細胞生長和青霉素合成。 策略：低濃度流加 濃度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%

控制：保持供應速率略大于生物合成需要。目前四十三頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點

(2).溫度控制適宜菌絲生長溫度30℃，分泌青霉素25℃。20℃青霉素破壞少，周期很長。變溫控制，不同階段不同溫度。生長階段:較高溫度，縮短生長時間；生產(chǎn)階段適當降低溫度，以利于青霉素合成。前期控制26℃左右，后期降溫控制24℃目前四十四頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點(3).pH控制合成適宜pH6.4－6.6左右，避免超過7.0直接加酸或堿：自動控制流加葡萄糖：恒速；變速，依賴pH變化快慢。pH下降：補加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量pH上升：補加糖、生理酸性物質(zhì)（硫酸銨、油脂）目前四十五頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點(4).溶氧控制＜30％飽和度，產(chǎn)率急劇下降；＜10％，造成不可逆的損害。臨界溶氧濃度：30％。通氣比：1：0.8－1.5。適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧調(diào)整攪拌轉速:各階段的生長和耗氧量不同。目前四十六頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點(5).消沫

天然油脂：玉米油； 化學消沫劑：泡敵。 策略：少量多次。 注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。目前四十七頁\總數(shù)五十四頁\編于二十二點7青霉素的提煉工藝過程青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定易溶于有機溶劑，水中溶解度很小