水環(huán)境監(jiān)測工技術(shù)員培訓(xùn)高效液相色譜

11水環(huán)境監(jiān)測工技術(shù)員培訓(xùn)-高效液相色譜1高效液相色譜分析概述1.1高效液相色譜法的概念高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）是采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法，注入的供試品由流動相帶入柱內(nèi)，各成分在色譜柱內(nèi)被分離，并依次進入檢測器，由記錄儀、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。高效液相色譜法采用了全多孔微粒固定相，裝填在小口徑、短不銹鋼色譜柱內(nèi)，通過高壓輸液泵將流動相泵入高壓的色譜柱內(nèi)，溶質(zhì)在固定相中的傳質(zhì)速度大大加快，從而在短時間內(nèi)獲得高柱效和高分離度。由于紫外、熒光、電化學(xué)等高靈敏度檢測器的使用，高效液相色譜的柱后反應(yīng)檢測靈敏度可達皮克數(shù)量級（10-12g），現(xiàn)在的高效液相色譜配有計算機，不僅能夠自動處理數(shù)據(jù)，繪圖和打印分析結(jié)果，而且能夠?qū)x器的全部操作包括流動相選擇，流量、柱溫、檢測器波長的選擇，進樣、梯度洗脫方式等進行程序控制，實現(xiàn)了儀器的全自動化。5/11/20232第四部分高效液相色譜分析5/11/20233圖2高效液相色譜儀圖1高效液相色譜柱外形1.2高效液相色譜分類根據(jù)溶質(zhì)在兩相分離過程的物理化學(xué)原理不同，液相色譜可分為：（1）液-固吸附色譜液-固吸附色譜是用固體吸附劑作固定相，以不同極性溶劑作流動相，根據(jù)樣品中各組分在吸附劑上吸附性能的差別來實現(xiàn)分離的。氧化鋁、硅膠、聚酰胺等是常用吸附劑，以硅膠吸附劑應(yīng)用最廣。液-固吸附色譜適宜于分離極性不同的試樣，也適于分離異構(gòu)體，但由于對相對分子質(zhì)量的選擇性小，故不宜于分離同系物。（2）液-液分配色譜液-液分配色譜法中常用硅膠作為載體，在其表面涂漬一薄層固定液作為固定相，被分離組分隨流動相進入色譜柱，在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次分配，各組分間產(chǎn)生差速遷移從而實現(xiàn)分離。液-液分配色譜常用的固定液有β，β′-氧二丙腈、聚乙二醇、角鯊?fù)椤⒓谆柰?、聚烯烴等。液-液色譜流動相除一般要求外，還應(yīng)盡可能不與固定液互溶，兩者的極性差別應(yīng)很大。固定液的極性大于流動相的極性的液-液色譜稱為正相色譜，反之，則稱為反相色譜。5/11/20234正相色譜中流動相的主體為己烷、庚烷，可加入<20%的極性改性劑，如二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙醇、乙腈等，主要用來分離極性化合物，被分離組分按極性從小到大的順序流出色譜柱；反相色譜中流動相的主體為水，也可加入一定量的改性劑，如乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、四氫呋喃、異丙醇等，主要用來分離非極性化合物，被分離組分流出順序與正相色譜正好相反。（3）化學(xué)鍵合相色譜化學(xué)鍵合相色譜是通過共價鍵將有機固定液結(jié)合到硅膠載體表曲，而得到各種性能的固定相，而鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用過程中不易流失。根據(jù)鍵合固定相與流動相相對極性的強弱，可將鍵合相色譜法分為正相鍵合相色譜法和反相鍵合相色譜法。反相鍵合相色譜法適用于分離非極性、極性或離子型化合物，其應(yīng)用范圍比正相鍵合相色譜法廣泛。但使用時應(yīng)注意鍵合固定相不適于酸、堿度過大或含有氧化劑的緩沖溶液作流動相體系。5/11/20235（4）離子交換色譜是20世紀70年代發(fā)展起來的一項新型液相色譜法。這種方法中用離子交換樹脂作為固定相，電解質(zhì)溶液為流動相，用電導(dǎo)檢測器檢測。離子交換色譜是根據(jù)離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中帶相同電荷的組分離子進行可逆交換，這些離子對交換樹脂具有不同的親和力而彼此分離。離子交換色譜適于分析在溶劑中能形成離子的組分，不僅廣泛用于無機離子的分離，亦可用于有機物和生物物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等的分離。離子交換樹脂通常有兩種類型：一類是以微粒硅膠為基質(zhì)，用化學(xué)鍵合的方法將離子交換基團鍵合在硅膠表面；另一類是以苯乙烯與二乙烯苯的交聯(lián)共聚物為基質(zhì)，在它的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上引入各種酸堿性基團作為交換基團。例如，對于陽離子的分離，可選用含有磺酸基（RSO3-H+）的強酸型交換樹脂，對于陰離子的分離可以選用含有季銨[RN(CH3)3+OH-]的強堿型交換樹脂。5/11/20236（5）凝膠色譜又稱為分子排阻色譜法，它是基于試樣中各組分分子的大小和形狀不同來實現(xiàn)分離。凝膠色譜的固定相是一種表面惰性、含有許多不同尺寸的孔洞或立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚合材料。當被分離混合物隨流動相通過凝膠色譜柱時，比固定相孔洞尺寸大的分子不能進入孔洞而被排阻，只能沿多孔凝膠粒子之間的空隙先隨流動相流出色譜柱；中等大小的分子能進入凝膠中一些適當?shù)目锥粗校荒苓M入更小的孔洞中，較慢的流出色譜柱；小分子則可以進入凝膠中的絕大部分孔洞中，在柱中滯留的時間較長，更慢的流出色譜柱。因此被分離組分依相對分子質(zhì)量由高到低的順序依次流出色譜柱。根據(jù)所用流動相不同，凝膠色譜法可以分為兩類，用水溶液作流動相，叫做凝膠過濾色譜，而用有機溶劑作流動相，稱為凝膠滲透色譜。凝膠色譜法主要用來分離相對分子質(zhì)量大于2000的化合物，如有機聚合物、蛋白質(zhì)等生物高分子等，應(yīng)用最廣的是用來分析高分子聚合物的相對分子質(zhì)量分布。凝膠色譜法不適宜用于分子大小組成相似或分子大小僅差10%的組分分析，如對同分異構(gòu)體的分離就不宜使用。5/11/202371.3高效液相色譜與氣相色譜分析的比較高效液相色譜與氣相色譜有許多相似之處，他們所用基本概念、基本理論基本一致。但二者的流動相、儀器設(shè)備和操作條件等方面不同，主要區(qū)別有：（1）兩者應(yīng)用范圍不同由于氣相色譜使用氣體流動相，被分折樣品必須要有一定的蒸汽壓，汽化后才能在柱上分折。液相色譜則不受試樣揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合于相對分子質(zhì)量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離、分析，大約占有機物的70％~80％。（2）流動相不同氣相色譜的流動相載氣是惰性的，不參與分配平衡過程，與試樣分子無親和作用，試樣分子只與固定相相互作用；液相色譜的流動相可為離子型、極性、弱極性、非極性的溶液，能夠與樣品產(chǎn)生相互作用，為提高選擇性增加了一個因素。而且還可以選用不同比例的兩種或兩種以上的液體做流動相，增大分離的選擇性，能完成難度較高的分離工作。5/11/20238（3）色譜柱不同氣相色譜柱的固定相粒度大，在0.1~0.5mm之間；填充柱內(nèi)徑1~4mm，柱長1~4m，柱效102~103；毛細管柱內(nèi)徑0.1~0.3mm，柱長10m~100m，柱效為103~104；柱溫較高，最高可達300℃~400℃。其分離機理依據(jù)吸附、分配兩種原理進行樣品分離。液相色譜柱的固定相粒度小，在5~10μm之間；填充柱內(nèi)徑3~6mm，柱長15~30cm，柱效103~104；毛細管柱內(nèi)徑0.01~0.03mm，柱長5~10m，柱效為104~105；柱溫為常溫。其分離機理依據(jù)吸附、分配、分子篩、離子交換、凝膠等多種原理進行樣品分離。（4）其他和氣相色譜相比，高效液相色譜對樣品回收比較容易，且定量，很多場合高效液相色譜不僅是作為一種分析方法，而更多的是作為一種分離手段，用以提純和制備具有足夠純度的單一物質(zhì)。但目前高效液相色譜儀的檢測器靈敏度尚不及氣相色譜，且液相色譜缺乏通用檢測器，儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜，價格昂貴。在實際應(yīng)用中，這兩種色譜技術(shù)各有所長，互相補充。在高效液相色譜越來越廣泛地獲得應(yīng)用的同時，氣相色譜仍然發(fā)揮著它的重要作用。5/11/202392高效液相色譜的基本類型2.1液-固色譜（LSC）分離原理及固定相對流動相的要求液-固色譜法又稱吸附色譜法，適合于分離可溶于有機溶劑的樣品。（1）分離原理當吸附劑對溶質(zhì)分子的吸附力大于對溶劑分子的吸附力時，溶質(zhì)分子就將吸附在吸附劑上，則保留值愈大；反之，保留值小或不被保留。對每一種溶質(zhì)而言，在給定的色譜條件下，洗脫過程中存在著一個吸附和解吸的動態(tài)平衡，即有一吸附平衡常數(shù)K。K值表示溶質(zhì)在固定相和流動相中的濃度比：式中，Cs和Cm分別表示溶質(zhì)在固定相和流動相中的濃度。不同的溶質(zhì)有不同的平衡常數(shù)。K值大說明該物質(zhì)在固定相中被吸附得牢固而在流動相中的溶解能力差，移動速度慢，在固定相中停留時間就長。分配系數(shù)相差越大，各組分越容易彼此分離。吸附劑吸附組分的能力，主要取決于吸附劑的比表面積和理化性質(zhì)、組分的組成和結(jié)構(gòu)以及洗脫液的性質(zhì)等。組分與吸附劑性質(zhì)近似時，易被吸附，呈現(xiàn)高的保留值。5/11/202310（2）固定相對流動相的要求液-固吸附色譜固體吸附劑按其性質(zhì)可以分為極性和非極性兩種類型。極性的有硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚酰胺等。極性吸附劑又可分為酸性和堿性吸附劑。酸性適于分離堿性溶質(zhì)。堿性吸附劑則適于分離酸性溶質(zhì)。各種吸附劑中，最常用的吸附劑是硅膠，其次是氧化鋁。在液-固色譜中，除了固定相對樣品的分離起主要作用外，還可以通過流動相的選擇來改變K值，或改變一對化合物的K值比，從而使它們的K值有最大的差別而達到分離。流動相在色譜分析中并不單純地起著運送溶質(zhì)通過色譜柱的作用，它還影響著溶質(zhì)的分配系數(shù)，所以在色譜分析中流動相的選擇同吸附劑的選擇同樣重要。流動相應(yīng)價廉、安全等。除此之外，液-固吸附色譜的流動相還必須符合：（1）對樣品有足夠的溶解能力，但不能與試樣發(fā)生反應(yīng)；（2）與固定相互不相溶，也不發(fā)生不可逆反應(yīng)；（3）粒度小，有較高的滲透性和柱效；（4）應(yīng)與所用檢測器相匹配；（5）應(yīng)有較高的純度；（6）應(yīng)具有低的粘度；（7）容易精制、純化，毒性小等。在液-固色譜中，選擇流動相的基本原則是極性大的試樣用極性較強的流動相，極性小的則用低極性流動相。下表按極性順序列出了幾種做LSC流動相的溶劑。5/11/202311常用液-固吸附色譜流動相5/11/202312為了獲得合適的溶劑極性，常采用兩種、三種或更多種不同極性的溶劑混合起來使用，如果試樣組分的分配比K值范圍很廣，則采用梯度洗脫。2.2液-液色譜分離原理及固定相對流動相的要求液-液色譜法（liquidliquidchromatography，LLC）又稱為分配色譜法（partitionchromatography）是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶（或部分互溶）的液體中溶解度的不同，有不同的分配從而實現(xiàn)分離的方法。（1）分離原理液-液色譜法是由馬?。∕artin）及辛格（Synge）于1941年提出的。在液-液色譜中，一個液相作為流動相，而另一個液相則涂漬在很細的惰性載體上作為固定相。流動相與固定相應(yīng)互不相溶，兩者之間應(yīng)有一明顯的分界面。當被分離試樣進入色譜柱后，溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中達到平衡，其在兩相中的濃度比稱為分配系數(shù)（distributioncoeficient），以KD表示。5/11/202313式中，Cs和Cm分別表示溶質(zhì)在固定相和流動相中的濃度。分配系數(shù)KD是分配色譜較為重要的參數(shù)。分配系數(shù)KD值大，說明該組分在色譜柱中保留時間長，移動速度慢，它將較遲地出現(xiàn)在流出液中，比移值Rf值較小；反之，KD值?。ㄔ诒由V中常用比移值Rf表示各組分在色譜中的保留行為，定義為原點至斑點質(zhì)量中心的距離與原點至溶劑前沿距離的比值），則此物質(zhì)在柱中保留時間短，移動速度快，它將較早地出現(xiàn)在流出液中，Rf值較大。因此，利用KD值不同可使混合物中各組分相互分離。根據(jù)固定相和流動相之間相對極性的大小，可將分配色譜分成兩類。流動相極性低而固定相極性高者，稱為正相分配色譜法（normalphasepartionchromatography），它對于極性強的組分有較大的保留值，常用于分離強極性化合物。流動相極性大于固定相的，稱為反相分配色譜法（reversedphasepartitionchromatography），它對于極性弱的組分有較大的保留值，適合于分離弱極性的化合物。正相色譜法與反相色譜法的區(qū)別見下表。5/11/202314正相色譜法與反相色譜法的區(qū)別比較項目正相色譜法反相色譜法固定相流動相出峰順序保留值與流動相極性的關(guān)系適于分離的物質(zhì)強極性弱—中等極性極性弱的組分先出峰隨流動相極性增強保留值變小極性物質(zhì)非極性中等—強極性極性強的組分先出峰隨流動相極性增強保留值變大弱極性物質(zhì)5/11/202315（2）固定相對流動相的要求液-液色譜的固定相由載體和固定液組成，將固定液涂漬在載體上組成固定相。因此在液-液色譜中，除一般要求外，還要求流動相對固定液的溶解度盡可能小。因此，固定液和流動相的性質(zhì)通常處于兩個極端，如當選擇的固定液是極性溶劑時，所選用的流動相則通常是極性很小的溶劑或非極性溶劑，這種正相分配色譜，適合于分離極性化合物；反之，如選用非極性物質(zhì)為固定相，而極性溶劑為流動相的反相分配色譜方法則適合于分離芳烴、稠環(huán)芳烴及烷烴等化合物。一般正相色譜法常用非極性的流動相，如石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷類、苯等或它們的混合物。反相色譜法常用極性的流動相，如水、各種水溶液（包括酸、堿、鹽及緩沖液）、低級醇類等。固定相與流動相的選擇，要根據(jù)被分離物中各組分在兩相中的溶解度之比即分配系數(shù)而定?？上仁褂脤Ω鹘M分溶解度大的溶劑為洗脫劑，再根據(jù)分離情況改變洗脫劑的組成，即在流動相中加入一些別的溶劑，以改變各組分被分離的情況與洗脫速率。各種溶劑的極性大小順序參照吸附色譜法。盡管選用了與固定液不會互溶的溶劑做流動相，但在色譜過程中固定液仍會有微量溶解，固定相會不斷流失，即使將流動相預(yù)先用固定相液體飽和或在色譜柱前加一個預(yù)柱，使流動相先通過預(yù)柱，再進入色譜柱，但仍難以完全避免固定液的流失。化學(xué)鍵合固定相是通過化學(xué)反應(yīng)把各種不同的有機基團鍵合到硅膠（載體）表面的游離羥基上，代替機械涂覆的液體固定相，這不僅避免了液體固定相流失的困擾，還大大改善了固定相的功能，提高了分離的選擇性，適用于分離幾乎所有類型的化合物。但化學(xué)鍵合相色譜中的固定相特性和分離機理與分配色譜法都存有差異，所以一般不宜將化學(xué)鍵合相色譜法統(tǒng)稱為液-液分配色譜法。5/11/2023162.3離子交換色譜分離原理及對流動相的要求離子交換色譜（ionexchangeChromatography，IEC）以離子交換樹脂作為固定相，是各種高效液相色譜中最先得到廣泛應(yīng)用的現(xiàn)代液相色譜方法。2.3.1分離原理離子交換劑是一類帶有離子交換功能基團的固體顆粒，結(jié)構(gòu)為在交聯(lián)的高分子骨架上結(jié)合可解離的無機基團。在離子交換過程中，離子交換劑的本體結(jié)構(gòu)不發(fā)生明顯的變化，只是所帶的離子與組分相同電性的離子發(fā)生離子交換。離子交換色譜的原理：當流動相帶著樣品電離生成的離子通過固定相時，樣品離子和離子交換樹脂上帶固定電荷的活性交換基團之間發(fā)生離子交換，由于不同組分離子對于離子交換樹脂的親和力不同，即相互作用強度不同，與樹脂作用弱的組分不易保留，首先從柱中被沖洗下來，而與樹脂作用強的組分則較長時間地保留在柱中，較晚地被沖洗出來。因此當它們通過離子交換柱時就獲得了分離。5/11/202317離子交換色譜的交換機理5/11/202318根據(jù)樹脂所含活性基團的性質(zhì)，以及所交換離子的電荷的不同，離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。陽離子交換樹脂以苯乙烯-二乙烯苯共聚物為本體制成帶有磺酸基團的強酸型樹脂，用于分離陽離子；陰離子交換樹脂以同樣的本體接上季銨基團，用于分離陰離子。離子交換劑可在pH=1~14的寬范圍內(nèi)工作。2.3.2固定相對流動相的要求（1）固定相陽離子交換樹脂主要含有—SO3H，—COOH，—OH，—SH，—PO3H2等酸性基團，其中可電離的H+與溶液中某些陽離子進行交換。當樹脂上可交換的離子是H+時，稱為氫型樹脂；若為某金屬離子時，稱為鹽型樹脂，商品一般為鈉型。依據(jù)其酸性強度，又可分為強酸型和弱酸型陽離子交換劑。樹脂的酸性強度一般按下列次序遞減：5/11/202319陰離子交換樹脂的母體和苯乙烯型樹脂相同，但在母體上連接-NH2，-NHR，-NR2或-N+，R3X-等活性基團。此類樹脂在水溶液中形成羥基型，商品一般為氯型。含有季銨者為強堿性，含有-NH2，=NH，≡N等基團者為弱堿性。強堿性陰離子交換樹脂在酸、堿和有機溶劑中較穩(wěn)定，可在酸性、堿性和中性溶液中進行陰離子交換，其交換容量不隨溶液的pH值而變。弱堿性陰離子交換樹脂對OH-

的親合力大，故只能在酸性介質(zhì)中與陰離子交換，它的交換容量隨溶液的pH值而改變。（2）流動相大部分離子交換色譜都在水溶液中進行，離子交換色譜的流動相經(jīng)常使用各種不同濃度的緩沖液，如在陽離子交換樹脂中經(jīng)常采用醋酸、磷酸緩沖液；在陰離子交換樹脂中則應(yīng)用氨水、吡啶等緩沖液；對復(fù)雜的多組分則可采用梯度洗脫方法，即有規(guī)律地隨時間而改變?nèi)芤旱男再|(zhì)，如pH、離子強度等。有時也使用甲醇、乙醇同水緩沖溶液混合使用，以提高分離的選擇性，改善試樣溶解度。有機溶劑的加入還可減小某些樣品組分的拖尾現(xiàn)象，從而改善分離度。在以水溶液為流動相的離子色譜中，緩沖液濃度直接影響著離子平衡。要避免使用濃度接近飽和的緩沖液，因為若產(chǎn)生鹽的沉淀，會造成液相色譜系統(tǒng)的堵塞。如果緩沖液太弱，則無法控制流動相的pH值。5/11/2023202.4凝膠色譜分離原理及對流動相的要求凝膠色譜又稱分子排阻色譜法，用化學(xué)惰性的多孔性凝膠作固定相，按固定相對樣品中各組分分子體積阻滯作用的差別來實現(xiàn)分離。2.4.1分離原理凝膠色譜是根據(jù)溶質(zhì)分子大小的不同即分子篩效應(yīng)而進行分離的。凝膠色譜過程是在一根長的色譜柱中填充用適當溶劑溶脹的凝膠顆粒，這些凝膠顆粒內(nèi)部充滿著大小不一的孔洞。在凝膠顆?？讖椒秶鷥?nèi)的分子能進入凝膠顆?？紫吨校M入的孔隙部分因分子大小各異，在色譜柱的淋洗過程中，大分子的流程短，移動速度快，先流出色譜柱；小分子的流程長，移動速度慢，后流出色譜柱；而中等分子居兩者之間，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。多孔性的凝膠就相當于一個分子篩。利用分子篩效應(yīng)，大小不同的分子就能實現(xiàn)彼此分離。溶液中分子直徑比凝膠顆粒最大孔徑大的分子完全不能進入到凝膠顆粒內(nèi)的孔洞中，只能經(jīng)過凝膠顆粒之間的空隙隨溶劑移動，當流完自由空間后就從柱的下端流出，此種情況叫全排出。直徑比最小孔洞直徑小的分子能進入凝膠顆粒的全部孔洞，因此在流完自由空間和全部凝膠顆粒的內(nèi)孔洞之后，方從柱的下端流出。如果兩種或兩種以上這樣的大分子或小分子，即使分子大小不同，在此兩種情形下均不能實現(xiàn)彼此分離。5/11/202321因此可以得出凝膠色譜的分離特點：①大分子先流出來，保留體積小，保留時間短；小分子后流出，保留體積大，保留時間長。②對于相對分子質(zhì)量不同的物質(zhì)可以達到有效的分離，與組成和性質(zhì)無關(guān)。一般用單一的溶劑即可達到分離測定的目的，不用改變?nèi)軇姸鹊奶荻攘芟?。③樣品組分的保留體積小于色譜柱中流動相溶劑的總體積，分離得到窄的色譜峰，便于定量檢測。凝膠色譜柱填料不存在極性，不存在吸附而影響柱效的問題。④以一組不同相對分子質(zhì)量的標樣來標定色譜柱，建立校正曲線，然后再以此作為數(shù)據(jù)處理的依據(jù)。⑤凝膠色譜的弱點是峰容量較小，不能分離分子大小相近的混合物。5/11/202322凝膠色譜5/11/2023232.4.2固定相對流動相的要求（1）固定相在凝膠色譜中，樣品的分離主要靠凝膠，因此，必須選擇合適的凝膠。選擇凝膠時應(yīng)考慮以下幾個問題：①凝膠的孔徑及其分布要與被測試樣相對分子質(zhì)量大小相適應(yīng)；②凝膠必須與流動相匹配，在使用過程中，由于溶劑的作用，凝膠會發(fā)生不同程度的溶脹，凝膠的孔徑也會因溶劑不同而孔徑有所變化。（2）流動相在凝膠色譜中，樣品的分離主要依據(jù)凝膠的孔隙和孔徑分布與樣品相對分子質(zhì)量大小及相對分子質(zhì)量分布的相互匹配來實現(xiàn)，改善分離度不是通過改變流動相組成來實現(xiàn)。在凝膠色譜中流動相的選擇主要考慮以下幾點。①用作流動相的溶劑應(yīng)與溶解樣品的溶劑互溶；②流動相應(yīng)與柱子填充的凝膠固定相相互匹配，能浸潤凝膠；③流動相的粘度通常會影響柱效，應(yīng)盡可能采用低粘度溶劑；④流動相應(yīng)與所使用的檢測器相匹配。5/11/2023242.5高效液相色譜分離方法的選擇一般可根據(jù)樣品的摩爾質(zhì)量、溶解度、分子結(jié)構(gòu)等進行初步選擇。（1）摩爾質(zhì)量范圍在200—2000的適合于液-固色譜法、液-液色譜法、凝膠色譜法；（2）摩爾質(zhì)量大于2000的則宜用凝膠色譜法。凝膠色譜法對溶解于任何溶劑的物質(zhì)都適用。（3）對于溶于水可以解離的物質(zhì)或含有能離解的官能團（如有機酸或堿）的化合物則采用離子交換色譜法為佳。（4）凡能溶解于烴類（如苯或異辛烷）則宜用液-固吸附色譜法。如芳香族化合物在苯中溶解度高。（5）脂肪族、芳香族化合物或能溶于二氯甲烷的樣品，則多用常規(guī)的液-液分配色譜法和液-固吸附色譜法分離。（6）如果樣品不溶于水但溶于異丙醇時，可用水和異丙醇的混合液作液-液分配色譜法的流動相，而用憎水性化合物作固定相。（7）一般用液-固色譜法來分離異構(gòu)體，用液-液色譜法來分離同系物。5/11/2023253高效液相色譜儀高效液相色譜儀于1967年問世，實現(xiàn)了對樣品的高速、高效、高靈敏度的分析測定。高效液相色譜儀可以分為分析型和制備型，盡管它們的性能各異、應(yīng)用范圍不同，但其基本組件是相似的，分析流程見圖8-7。5/11/202326高效液相色譜儀流程圖3.1載液系統(tǒng)高效液相色譜儀輸液系統(tǒng)包括貯液罐、高壓輸液泵、梯度淋洗裝置等。3.1.1貯液罐貯液罐是用來供給足夠數(shù)量的合乎要求的流動相以完成分析工作的，它一般是以不銹鋼、玻璃或聚四氟乙烯襯里為材料。容積一般為0.5~2.0L為宜。對凝膠色譜儀和制備型儀器，其容積應(yīng)該更大些。貯液罐的放置位置應(yīng)該高于泵體，以保持一定的輸液靜壓差。3.1.2高壓輸液泵在高效液相色譜分析中，色譜柱中裝填直徑為5~10μm的固定相，其對流動相有較高的阻力。為了達到快速高效的分離，必須有很高的柱前壓力，才能獲得高的液體流速。對高壓輸液泵的要求是：流量穩(wěn)定；輸出壓力高；流量范圍寬；耐酸、堿和緩沖液腐蝕；壓力變動小，更換溶劑方便，空間小，易于清洗和更換溶劑并具有梯度淋洗功能等。高壓輸液泵按排液性能可分為恒壓泵和恒流泵。按工作方式又可分為液壓隔膜泵、氣動放大泵、螺旋注射泵和往返柱塞泵四種，前兩種為恒壓泵，后兩種為恒流泵。恒壓泵可以輸出一個穩(wěn)定不變的壓力，但當系統(tǒng)的阻力變化時，輸入壓力雖然不變，但流量卻隨阻力而變；而恒流泵對輸出液體的流量保持恒定，與外界色譜柱等阻力無關(guān)。5/11/202327恒流泵結(jié)構(gòu)5/11/2023283.1.3梯度洗脫裝置梯度洗脫（又稱梯度洗提、梯度淋洗）就是流動相中含有兩種（或多種）不同極性的溶劑，在分離過程中按一定程序連續(xù)地改變流動相的濃度配比，以調(diào)節(jié)它的極性。通過流動相極性的變化來改變待分離樣品的選擇因子，并使樣品中的所有組分在最短的時間內(nèi)獲得最佳的分離。梯度洗脫可分為低壓梯度和高壓梯度兩種操作方式。低壓梯度（外梯度）：是采用在常壓下預(yù)先按一定的程序?qū)煞N或多種溶劑混合后再用泵輸入色譜柱系統(tǒng)，亦稱為泵前混合。高壓梯度（內(nèi)梯度）：由兩臺高壓輸液泵、梯度程序器（或計算機及接口板控制）、混合器等部件組成。兩臺泵分別將兩種極性不同的溶劑輸入混合器，經(jīng)充分混合后進入色譜柱系統(tǒng)，這是一種泵后高壓混合形式。高壓梯度所采用的泵多為往復(fù)柱塞泵，由此獲得的流量精度高、梯度淋洗曲線重復(fù)性好。它的主要優(yōu)點是兩臺高壓輸液泵的流量皆可獨立控制，可獲得任何形式的梯度程序，并且易于實現(xiàn)自動化。梯度洗脫時，為了得到重復(fù)保留數(shù)據(jù)，流速和溶劑組成準確尤為重要。一臺好的梯度淋洗設(shè)備除了泵以外，梯度曲線的靈活性、混合的均勻性，以及滯后和畸變都是很重要的考察指標。5/11/2023293.2進樣系統(tǒng)對于液相色譜進樣裝置，要求重復(fù)性好，死體積小，保證柱中心進樣，進樣時對色譜柱系統(tǒng)流量波動要小，便于實現(xiàn)自動化等。進樣系統(tǒng)包括取樣、進樣兩個功能。而實現(xiàn)這兩個功能又有手動和自動兩種方式。3.2.1注射器進樣用高效液相色譜專用注射器將樣品注入專門設(shè)計的與色譜柱相連的進樣頭內(nèi)，這種進樣方式可以獲得比其它任何一種進樣方式都要高的柱效，而且價格便宜。但壓力不能超過15MPa。3.2.2六通閥進樣六通閥具有耐高壓、低死體積的特點，分為定體積和不定體積兩種?？梢灾苯佑糜诟邏合?，把樣品送入色譜柱，不需要停流，進樣量由固定體積的定量管或微量進樣器控制，所以重復(fù)性好，閥進樣比進樣器進樣效率下降10%，但重現(xiàn)性好。5/11/202330六通閥工作原理示意圖（（a）準備，（b）工作）3.2.3自動進樣器自動進樣器是由計算機自動控制定量閥，按預(yù)先編制注射樣品的操作程序工作。取樣、進樣、復(fù)位、樣品管路清洗和樣品盤的轉(zhuǎn)動等一系列動作全部按預(yù)定的程序自動進行，一次可進行幾十個或上百個樣品的分析。5/11/2023313.3分離系統(tǒng)對色譜柱的要求是柱效高，選擇性好，分析速率快等。市售的用于HPLC各種微粒填料如多孔硅膠及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相，氧化鋁，有機膠球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對于同系物分析，只需500塔板即可；對于較難分離物質(zhì)可采用高達2萬塔板的柱子，因此一般用10~30cm左右柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。色譜柱一般采用優(yōu)質(zhì)不銹鋼管制作，按用途可以分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：常用分析柱內(nèi)徑2~5mm（常用4.6mm，國內(nèi)有4mm、5mm），柱長10~30cm；窄徑柱內(nèi)徑1~2mm，柱長10~20cm；毛細管柱內(nèi)徑0.2~0.5mm；半制備柱內(nèi)徑＞5mm；實驗室制備柱內(nèi)徑20~40mm，柱長10~30cm；生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達幾十厘米。高效液相色譜柱的裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性應(yīng)在±5%或±10%以內(nèi)。5/11/2023323.4檢測系統(tǒng)高效液相色譜儀中的檢測器是三大關(guān)鍵部件（高壓輸液泵、色譜柱、檢測器）之一，主要用于檢測經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度的變化，最終得到樣品中各個組分的含量。檢測器是色譜分析工作中定量分析的主要工具。高效液相色譜中的檢測器，應(yīng)具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、峰型好、線性范圍寬、響應(yīng)快、適用范圍廣、死體積小等特點，還應(yīng)對溫度和流速的變化不敏感。檢測器分為兩大類：通用型檢測器和選擇性檢測器。通用型檢測器是對試樣和洗脫液總的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，因此能檢測的范圍廣，但是由于它對流動相也有響應(yīng)，因此易受環(huán)境溫度、流量變化等因素的影響，造成較大的噪聲和漂移，限制了檢測靈敏度，不適合于做痕量分析，并且通常不能用于梯度洗脫操作。選擇性檢測器僅對待分離組分的物理化學(xué)特性有響應(yīng)。其靈敏度高，受外界影響小，并且可用于梯度洗脫操作。但由于其選擇性只對某些化合物有響應(yīng)，限制了它的應(yīng)用范圍。通常一臺性能完備的高效液相色譜儀，應(yīng)當具備一臺通用型檢測器和幾種選擇性檢測器。5/11/2023333.4.1紫外吸收檢測器（UVD）紫外吸收檢測器（ultravioletabsorptiondetector，UVD）是高效液相色譜儀中使用最廣泛的檢測器?？煞譃楣潭úㄩL、可變波長及二極管陣列檢測三種類型。它只能檢測分子中含有共軛雙鍵的化合物。它的作用原理是基于被分析樣品對特定波長紫外光的選擇性吸收，樣品濃度與吸光度的關(guān)系服從比耳定律。由于紫外吸收對溫度、流動相組成和流速變化不敏感，因此紫外檢測器可用于梯度洗脫。分子中不含共軛體系的組分，如飽和烴、糖類等化合物，不響應(yīng)而無法檢測，而且對紫外有吸收的溶劑不能使用。工作過程：固定波長紫外吸收檢測器，由低壓汞燈提供固定波長λ=254nm（或λ=280nm）的紫外光，其結(jié)構(gòu)如圖。由低壓汞燈發(fā)出的紫外光經(jīng)入射石英棱鏡準直、再經(jīng)遮光板分為一對平行光束分別進入流通池的測量壁和參比臂。經(jīng)流通池吸收后的出射光，經(jīng)過遮光板、出射石英棱鏡及紫外濾光片，只讓254nm的紫外光被雙光電池接收。雙光電池檢測的光強度經(jīng)對數(shù)放大器轉(zhuǎn)化成吸光度后，經(jīng)放大器輸送至記錄儀。紫外-254檢測器就是一種廣泛使用的固定波長的紫外吸收檢測器。5/11/202334固定波長紫外檢測器5/11/202335可變波長紫外吸收檢測器的光路與固定波長檢測器基本一致，但燈源采用氘燈或氫燈，它可在200~400nm范圍內(nèi)有較好的連續(xù)光譜，因此可用一組濾光片來選擇所需的工作波長，雖然氫燈或氘燈的功率近20W，但是在某個波長的能量分配卻不大，因此它的靈敏度要比紫外-254檢測器略低。5/11/202336HP1100可變波長紫外檢測器紫外-可見檢測器實質(zhì)上就是裝有流動相的紫外-可見分光光度計，但是對波長的單色性要求不高，光譜寬度可允許達10nm，波長精度約±1nm。光源用氘燈-鎢燈，在紫外區(qū)工作時用氘燈，在可見區(qū)工作時切換為鎢燈。設(shè)定棱鏡或光柵的不同角度實現(xiàn)波長的選擇。半透半反鏡把光線分成兩束。一束進入檢測池，另一束作為參比信號?？勺儾ㄩL檢測器及紫外-可見分光度檢測器由于擴大了波長工作范圍，而使得應(yīng)用范圍大為增加，并可獲得更好的選擇性，即可選擇對所分析組分最適合而對溶劑背景不敏感的波長工作。5/11/202337二極管陣列檢測器（diodearraydetector，DAD）是一種新型的紫外檢測器。與普通的紫外檢測器相比，其分光系統(tǒng)和樣品池的位置正好相反，即光束先通過樣品池后由分光系統(tǒng)分光，所有波長的光在二極管陣列檢測器上同時被檢測。同時給出每個色譜峰的保留時間-吸光度-吸收波長三維色譜圖，如圖8-13，也即同時給出其定量與紫外光譜定性信息，可以檢測色譜峰的純度。5/11/202338HP1100二極管陣列檢測器光路圖1-鎢燈；2-偶合透鏡；3-氘燈；4-消色差透鏡；5-光閘；6-光學(xué)透鏡；7-樣品流通池；8-光學(xué)透鏡；9-狹縫；10-全息凹面衍射光靶；11-二極管陣列檢測元件二極管陣列檢測器測定菲的色譜、光譜圖3.4.2熒光檢測器（FD）

在液相色譜中，熒光檢測器（fluorescencedetector，F(xiàn)D）主要用于在紫外激發(fā)下能發(fā)射熒光的化合物。熒光檢測器最大的特點是它高靈敏度和高選擇性。其靈敏度比紫外檢測器高2~3個數(shù)量級，可檢測出ng級的痕量有機物。但是熒光檢測器不如紫外檢測器應(yīng)用那么廣泛，因為能引起熒光的化合物比較有限。有些化合物本身不產(chǎn)生熒光，但卻含有適當?shù)墓倌軋F，可與熒光試劑發(fā)生反應(yīng)生成熒光衍生物，這時就可用熒光檢測器檢測。工作原理：許多化合物存在光致發(fā)光現(xiàn)象，即它們可被入射光激發(fā)后發(fā)出波長相同的共振輻射或波長較長的特征輻射（即熒光）。熒光檢測器就是基于測量這種熒光強度與樣品濃度呈線性關(guān)系實現(xiàn)檢測。熒光檢測器需要比紫外檢測器強的光源作激發(fā)光源。常采用氙燈作光源，它可在250~260nm范圍內(nèi)發(fā)出強烈的連續(xù)光譜。5/11/202339熒光檢測器光路圖1-中壓汞燈光源；2-10%反射棱鏡；3-激發(fā)光濾光片；4-透鏡；5-測量池；6-參比池；7-發(fā)射光濾光片；8-光電倍增管；9-放大器；10-記錄器；11-光電管；12-對數(shù)放大器；13-線性放大器5/11/202340熒光檢測器是一種選擇性的檢測器，線性范圍較窄，不宜作為一般的檢測器使用，可用于梯度洗脫。測定中不能使用可熄滅、抑制或吸收熒光的溶劑作流動相。熒光檢測器現(xiàn)在已在生物化工、臨床醫(yī)學(xué)檢驗、食品檢驗、環(huán)境監(jiān)測中獲得廣泛的應(yīng)用。3.4.3折光指數(shù)檢測器（RID）折光指數(shù)檢測器（refractiveindexdetector，RID）又稱示差折光檢測器（DRD），是基于連續(xù)測定參比池和測量池中溶液的折光率之差來測定試樣濃度的檢測器。由于每種物質(zhì)都具有與其他物質(zhì)不相同的折射率，因此RID是一種通用型的濃度檢測器。溶液的光折射率是溶劑（流動相）和溶質(zhì)（樣品）各自的折射率乘以各自的物質(zhì)的量濃度之和。溶有樣品的流動相和流動相本身之間光折射率之差即表示樣品在流動相中的濃度：原則上凡是與流動相光折射指數(shù)有差別的樣品都可用它來測定，其檢測限可達10-6~10-7g。其主要缺點在于它對溫度變化很敏感。所以RID與UVD相比，RID通用，但靈敏度低，受周圍環(huán)境影響大。折光指數(shù)檢測器按其工作原理可以分為偏轉(zhuǎn)式和反射式兩種類型。如果工作池中的流動相中有了樣品通過，在45°的分界玻璃與液體介質(zhì)之間的折射會造成光束的偏轉(zhuǎn)。因光束偏轉(zhuǎn)使成像偏棱鏡的棱口，左右兩個光電管所接受的光束能量不等，產(chǎn)生的光電流就有差值，因此輸出不平衡的信號也就是樣品濃度的信號。幾乎每種物質(zhì)的折射率都各不相同，因此，都可用示差折光檢測器來檢測。5/11/202341反射式折光指數(shù)檢測器光路圖5/11/202342偏轉(zhuǎn)式示差折光檢測器光路圖1-鎢燈；2-透鏡；3-濾光片；4-遮光板；5-反射鏡；6-透鏡；7-工作池；8-參比池；9-平面反射鏡；10-平面細調(diào)透鏡；11-棱鏡；12-光電管；13-工作流路；14-參比流路3.4.4電化學(xué)檢測器對于無紫外吸收或不能發(fā)生熒光但具有電活性的物質(zhì)，可采用電化學(xué)檢測法。目前電化學(xué)檢測器主要有安培、電導(dǎo)、極譜和庫侖四種檢測器，許多具有電化學(xué)氧化還原性物質(zhì)的化合物，如含有電活性的硝基、氨基等有機物及無機物陰陽離子等可用電化學(xué)檢測器測定。如采用柱后衍生技術(shù)，電化學(xué)檢測法的應(yīng)用范圍還可擴展到非電活性物質(zhì)的檢測。它已在有機和無機陰陽離子、食品添加劑、環(huán)境污染物、動物組織中的代謝、生物制品及醫(yī)藥測定中獲得了廣泛的應(yīng)用。電化學(xué)檢測器具有以下特點：靈敏度高，最小檢出量一般為納克（ng）級，有時可達到皮克（pg）級；選擇性好，可測定大量非電活性物質(zhì)中痕量的電活性物質(zhì)；線性范圍寬，一般為4~5個數(shù)量級；設(shè)備簡單，成本低，檢測池體積小，柱效應(yīng)較小，響應(yīng)速度快。電化學(xué)檢測器所用的流動相必須具有導(dǎo)電性，因此，一般使用極性溶劑或水溶液，主要是鹽的緩沖液。在多數(shù)情況下只能檢測具有電活性的物質(zhì)，由于電極表面可能會發(fā)生吸附、催化、氧化還原等現(xiàn)象，因此電極都有一定的壽命，目前尚沒有一種通用和可靠的方法使電極表面獲得再生。而且電極對溫度和流速的變化比較敏感。5/11/2023433.4.5蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）蒸發(fā)光散射檢測器（evaporationlaserscatteringdetector，ELSD）是近年新出現(xiàn)的高靈敏度、通用型、質(zhì)量型檢測器。它能對各種物質(zhì)均有響應(yīng)，且響應(yīng)因子基本一致，它的檢測不依賴于樣品分子中的官能團，且可用于梯度洗脫。它可以用來檢測不揮發(fā)性化合物，包括氨基酸、脂肪酸、糖類、表面活性劑等，尤其對于一些較難分析的樣品，如磷脂、皂苷、生物堿、甾族化合物等無紫外吸收或紫外末端吸收的化合物更具有其他HPLC檢測器無法比擬的優(yōu)越性。此外，ELSD對流動相的組成不敏感，可以用于梯度洗脫。ELSD的檢測靈敏度要較高，檢測限可低至10-10g。檢測原理：首先將柱洗脫液霧化形成氣溶膠，然后在加熱的漂移管中將溶劑蒸發(fā)，余下的不揮發(fā)性溶質(zhì)顆粒在光散射檢測池中得到檢測。5/11/202344蒸發(fā)光散射檢測器工作原理示意圖1-HPLC柱；2-噴霧氣體；3-蒸發(fā)漂移管；4-樣品液滴；5-激光光源；6-光二極管檢測器；7-散射室5/11/202345左圖為蒸發(fā)激光散射檢測器的工作原理示意圖。色譜柱后流出物在通向檢測器途中，被高速載氣（N2）噴成霧狀液滴。在受溫度控制的蒸發(fā)漂移管中，流動相不斷蒸發(fā)，溶質(zhì)形成不揮發(fā)的微小顆粒，被載氣載帶通過檢測系統(tǒng)。檢測系統(tǒng)由一個激光光源和一個光二極管檢測器構(gòu)成。在散射室中，光被散射的程度取決于散射室中溶質(zhì)顆粒的大小和數(shù)量。粒子的數(shù)量取決于流動相的性質(zhì)及噴霧氣體和流動相的流速。當流動相和噴霧氣體的流速恒定時，散射光的強度僅取決于溶質(zhì)的濃度，這是它的定量基礎(chǔ)。蒸發(fā)激光散射檢測器與RID和UVD比較，它消除了溶劑的干擾和因溫度變化而引起的基線漂移，即使用梯度洗脫也不會產(chǎn)生基線漂移。它還具有死體積小、靈敏度高、噴霧氣體消耗少等優(yōu)點。3.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)高效液相色譜的分析結(jié)果現(xiàn)已廣泛使用色譜數(shù)據(jù)工作站來記錄和處理色譜分析的數(shù)據(jù)。使操作實現(xiàn)程序化、自動化。色譜工作站的主要功能如下：（1）全部操作參數(shù)控制功能；（2）數(shù)據(jù)處理和譜圖處理功能；（3）進行計量認證的功能。此外，該工作站還具有控制多臺儀器自動化操作、網(wǎng)絡(luò)運行，還可優(yōu)化運行多種色譜分離軟件、多維色譜系統(tǒng)操作參數(shù)控制軟件等?？偟恼f來，色譜工作站的出現(xiàn)，不僅大大提高色譜分析的速度，也為色譜分析工作者進行理論研究、開拓新型分析方法創(chuàng)造了有利的條件。可以預(yù)料隨著電子計算機技術(shù)的迅速發(fā)展，色譜工作站的功能也會日益完善。色譜數(shù)據(jù)工作站的出現(xiàn)，不僅大大提高色譜分析工作的速度，也為色譜分析工作者進行理論研究、開拓新型分析方法創(chuàng)造了有利的條件。5/11/2023464高效液相色譜分析方法4.1定性分析4.1.1利用已知標準樣品定性由于每一種化合物在特定的色譜條件下，其保留值為定值，因此可以利用保留值進行定性。在相同的色譜條件下被測化合物與標準樣品的保留值一致，可以初步認為被測化合物與標準樣品相同。如果經(jīng)過多次改變流動相的組成，被測化合物的保留值仍與標準樣品的保留值相一致，那么就能進一步證明被測化合物與標準樣品相同。4.1.2利用具有選擇性的檢測器定性折光指數(shù)檢測器是一種通用型的檢測器，但是靈敏度比較低。而紫外、熒光及電化學(xué)檢測器則為選擇性檢測器，靈敏度比較高。同一種檢測器對不同種類的化合物的響應(yīng)值是不同的，而不同的檢測器對同一種化合物的響應(yīng)也是不同的。所以如果將一定量的未知化合物進入色譜柱，柱后并聯(lián)或串聯(lián)幾種檢測器，兩檢測器或幾個檢測器對被測化合物檢測靈敏度比值是與被測化合物的性質(zhì)密切相關(guān)的，可以用來對被測化合物進行定性分析，這就是雙檢測器定性體系的基本原理。5/11/2023474.1.3利用紫外檢測器全波長掃描功能定性在色譜圖上某組分的色譜峰出現(xiàn)極大值，即最高濃度譜帶進入檢測器時，通過停泵等手段，使組分在檢測池中滯留，然后對檢測池中的組分進行全波長（180~800nm）掃描，得到該組分的紫外-可見光譜圖；再取可能的標準樣品按同樣方法處理，也得一光譜圖。對比兩者光譜圖即能鑒別出該組分與標準樣品是否相同。4.1.4利用改變流動相組成被測組分保留值變化規(guī)律定性在液相色譜中，每種化合物的保留值將隨流動相組成的變化、固定相的不同而改變，不同的化合物其變化規(guī)律是不同的。因此人們?？扛淖兞鲃酉嘟M成等參數(shù)，使一組化合物得到好的分離。那么應(yīng)該說也可以根據(jù)某一化合物在特定條件下的保留值變化規(guī)律反過來推測它為何類化合物。4.1.5收集流出組分，再用其他物理或化學(xué)方法定性被測化合物經(jīng)過液相色譜檢測器中的光學(xué)檢測器，其結(jié)構(gòu)不受破壞，所以可以分別收集各個組分，然后再用其他方法，如紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振等方法作定性鑒定。5/11/2023484.2定量分析高效液相色譜法的特點之一，就是能夠?qū)Ω鞣N物質(zhì)作定量測定，無論樣品中組分含量是大還是小，高效液相色譜均能給出好的定量結(jié)果。當一定量化合物被注入色譜柱后，由流動相攜帶著在固定相與流動相之間進行多次分配，最后離開色譜柱，進入檢測器而產(chǎn)生響應(yīng)。由于該化合物在柱內(nèi)運行過程中，受傳質(zhì)、擴散等因素的影響，化合物離開色譜柱時，其濃度隨時間變化的規(guī)律是按高斯分布曲線的形式在記錄儀上被記錄下來的。色譜峰峰面積與進入色譜柱的物質(zhì)量之間有著線性的正比關(guān)系（在檢測器響應(yīng)值的線性范圍以內(nèi)）。這就是色譜法利用被測化合物的峰面積進行定量的基礎(chǔ)。5/11/2023494.2.1外標法外標法是以待測組分的純品作為標準品，取已知濃度的該標準品的溶液注入色譜柱得到其響應(yīng)值（峰面積或峰高），在一定濃度范圍內(nèi)，標樣量與響應(yīng)值之間有比較好的線性關(guān)系，可用下式表示：AR=K·CR·VR……..（1）AX=K·CX·VX……..（2）式中：AR——標準樣品的峰面積；CR——標準樣品溶液的濃度；VR——標準樣品溶液的進樣體積;AX——待測樣品的峰面積；CX——待測樣品溶液的濃度；VX——待測樣品溶液的進樣體積;在檢測器的靈敏度不是很穩(wěn)定的情況下，測定樣品期間需要經(jīng)常注入標樣以得到不同時間的K值。這種方法操作和計算都比較簡單，因此是常用的一種定量方法。但是該方法要求是：在分析樣品的整個操作過程中，操作條件要穩(wěn)定，如檢測器靈敏度、流速，流動相組成等不發(fā)生變化；標樣溶液及被測溶液要求密封好，使溶液濃度保持恒定；以及每次進樣體積要有好的重復(fù)性。否則將會影響定量結(jié)果的準確性。5/11/2023504.2.2內(nèi)標法由于外標法所提的幾點要求有時難以實現(xiàn)，為了得到更準確的定量結(jié)果，可以采用內(nèi)標定量方法。內(nèi)標法是比較精確的一種定量方法。內(nèi)標法定量，首先要選擇合適的內(nèi)標物，內(nèi)標物一般選用化學(xué)結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)與待測組分相近的純品，而且要具有與被測物相近的保留值，當樣品中有幾個被測組分時，要求內(nèi)標物的保留值介于幾個被測組分之間，也不能與其他組分峰重疊。內(nèi)標法定量的基礎(chǔ)是：在進行色譜測定之后，待測組分峰面積和參比物峰面積之比